Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Vi takker Institut for Plant &Soil Science og Cotton Inc. for deres delvise støtte til denne undersøgelse.

1. Eksperimentel forberedelse
<ol><li>Grind tørret plantemateriale i et fint pulver.</li>
	<li>Proteinsopløselighedsbuffer (PSB): Forbered stamopløsninger på 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M ethylendiaminetetraeddikesyre (EDTA) (pH 8.0) og autoklave dem. Lav frisk PSB buffer fra disse stamopløsninger med endelige koncentrationer på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecyl sulfat (SDS) i sterilt vand.</li>
	<li>Forbered 100 mL 70% ethanol (v/v): 70 mL 100% ethanol og 30 mL sterilt vand.</li>
	<li>Der fremstilles 100...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Bomuldsfibre er naturlige fibre fremstillet af cottonseed. Bomuldsfiber er en enkelt celle med ~95% celluloseindhold2 med højt krystallinsk celluloseindhold med omfattende anvendelser i tekstilindustrien31. Som, bomuld fiber indeholder ~ 95% cellulose, har vi brugt bomuld rodvæv til påvisning af skøn over krystallinsk cellulose indhold. Rodvæv af bomuld er moderat rigt på krystallinsk celluloseindhold og repræsenterer en almindeligt tilgængelig plantebiomasse. Den m...

Cellulose er den primære bærende komponent i cellevægge, som er til stede i både primære og sekundære cellevægge. Cellevæggen er en ekstracellulær matrix, der omgiver planteceller og primært består af cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matrixproteiner. Omkring en tredjedel af planterne biomasse er cellulose1, og det spiller en væsentlig rolle i plantevækst og udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleform vedligeholdelse, og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomuldsfiber indeholder 95% cellulose2 indhold, mens træer indeholder 40% til 50% af cellulose afhængigt af plantearter og organtyper3. Cellulosen består af gentagne enheder af cellobiose, en disaccharid af glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidbindinger4. Cellulose ethanol fremstilles af glucose fra den cellulose, der er til stede i plantecellevæggene5. Cellulosisk fiber består af flere mikrofibriller, hvor hver mikrofibril fungerer som kerneenhed med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymeren syntetiseres af plasmamembran indlejrede cellulosesyntasekomplekser (CSC'er)1,7. Individuelle cellulosesyntese A -proteiner (CESA) syntetiserer glucankæder, og de tilstødende glucankæder forbindes af hydrogenbindinger til krystallinsk cellulose1,8. Cellulose findes i flere krystallinske former med to fremherskende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som oprindelige former9. I højere planter findes cellulose i cellulose Iβ-form, mens der findes lavere plantecellulose i Iα form10,11. Samlet set cellulose spiller en væsentlig rolle i at give styrke og stivhed til planten cellevægge.
Førstegenerationsbiobrændstoffer fremstilles primært af majsstivelse, rørsukker og roesukker, som er fødevarekilder, mens andengenerationsbiobrændstoffer fokuserer på biobrændstofproduktionen fra nonfood-plantebiomassecellemateriale12. Et nøjagtigt skøn over indholdet af krystallinsk cellulose er ikke kun vigtigt for grundforskningen i cellulosebiosyntese og cellevægdynamik, men også for anvendt forskning i biobrændstof og bioprodukter. Der er udviklet og optimeret forskellige metoder til vurdering af cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimering. Den første rapporterede metode til celluloseestimering var af Cross og Bevan i 190813. Metoden var baseret på princippet om alternativ chlorering og ekstraktion ved natriumsulfat. Den cellulose, der blev opnået ved den oprindelige såvel som ændrede protokoller for Cross- og Bevan-metoden, viste imidlertid forurening af små fraktioner af lignin ud over en betydelig mængde xylaner og mannans14. På trods af flere modifikationer for at fjerne lignin og hemicellulose fra cellulosefraktionen beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mængde mannaner sammen med cellulose. Senere blev Kurschners metode udviklet ved at anvende salpetersyre og ethanol til at udvinde cellulose15. Denne metode erklærede, at den samlede lignin og 75% af pentosanerne blev fjernet, men de sande celluloseresultater var de samme som dem, der blev anslået ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En anden metode (Norman og Jenkins) blev udviklet ved at anvende methanolbenzen, natriumsulfat og natriumhypochlorit til at udvinde cellulose16. Denne metode beholdt også en del af lignin (3%) og betydelige mængder af pentosaner, der fører til en nøjagtig vurdering af cellulose. Senere brugte Kiesel og Semiganowsky en anden tilgang til hydrolyze cellulose ved hjælp af 80% koncentreret svovlsyre, og det hydrolyserede reducerede sukker blev anslået ved Bertrands metode17. De to metoder, Waksman's og Stevens18 og Salo14,19, som blev udviklet baseret på Kiesel og Semiganowsky's metode, også gav 4-5% mindre cellulose indhold i forhold til tidligere metoder20.
Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til estimering af krystallinsk celluloseindhold. Denne metode blev første gang beskrevet af Updegraff til måling af cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (anvendelse af salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoderne (hydrolyse af cellulose i glukosemonomerer ved hjælp af svovlsyre) med nogle modifikationer og anthronanalysen af Viles og Silverman for simpel kolorimetrisk estimering af glukose og krystallinsk celluloseindhold22. Princippet for denne metode er anvendelse af eddikesyre og salpetersyre (Updegraff reagens) til at fjerne hemicellulose og lignin fra det homogeniserede plantevæv, som efterlader eddikesyre/salpetersyreresistent cellulose til videre behandling og estimering15. Den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose behandles med 67% svovlsyre for at bryde cellulose i glukosemonomerer, og de frigivne glukosemonomerer anslås ved anthronanalyse21,23. Flere ændringer af den oprindelige Updegraff-metode blev brugt til at forenkle proceduren og celluloseestimering ved anthronanalyse24. Generelt kan denne metode opdeles i fem faser. I den første fase fremstilles plantematerialet. I anden fase adskilles råcellevæggen fra den samlede biomasse, da cellulose er nøglekomponenten i plantecellevægge. Senere, i tredje fase, adskilles cellulose fra de ikke-celluloseholdige cellevægkomponenter ved at behandle med Updegraff reagens. I fjerde fase nedbrydes den eddikesyre-/salpetersyreresistente cellulose i glukosemonomerer ved svovlsyrebehandling. Svovlsyrebehandling af cellulose resulterer i dannelse af 5-hydroxymethylfurfuralforbindelser fra reaktionen af glukosemonomerer med svovlsyre. Endelig genererer antronen i den sidste fase et grønligt blåt kompleks ved kogning med furfuralforbindelsen genereret i den foregående fase25. Denne anthrone baserede kolorimetriske metode blev første gang brugt i 1942 af Dreywood. Anthron er et farvestof, der identificerer furfuralforbindelser af pentose og hexose dehydrerede produkter såsom 5-hydroxymethylfurfural under sure forhold. Reaktion med hexose producerer en intens farve og bedre respons i forhold til pentoses25. Mængden af bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorptance ved 620 nm, og intensiteten af det grønlige blå kompleks er direkte proportional med mængden af sukker i prøven. De målte absorbansværdier blev sammenlignet med en regressionslinje for glukosekurven for at beregne prøvens glukosekoncentration. Det målte glukoseindhold blev anvendt til at estimere celleuloseindholdet i plantebiomassen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

Cellulose er den mest rigelige polymer på Jorden genereret af fotosyntese og den vigtigste bærende komponent af cellevægge. Cellevæggen spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling ved at give styrke, stivhed, hastighed og retning af cellevækst, celleformvedligeholdelse og beskyttelse mod biotiske og abiotiske stressorer. Cellevæggen består primært af cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. For nylig er plantecellevægge blevet målrettet mod andengenerationsbiobrændstof- og bioenergiproduktion. Specifikt anvendes cellulosekomponenten i plantecellevæggen til fremstilling af cellulosebaseret ethanol. Estimering af celluloseindholdet i biomasse er afgørende for grundlæggende forskning i cellevægge. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest anvendte metode til vurdering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse. Alkohol uopløselige rå cellevæg fraktion ved behandling med Updegraff reagens eliminerer hemicellulose og lignin fraktioner. Senere udsættes Updegraff-reagensresistent cellulosefraktionen for svovlsyrebehandling for at hydrolysere cellulosehompolymeren i monomere glukoseenheder. En regressionslinje udvikles ved hjælp af forskellige koncentrationer af glukose og bruges til at estimere mængden af glukose, der frigives ved cellulosehydrolyse i forsøgsprøverne. Endelig anslås celluloseindholdet baseret på mængden af glukosemonomer ved kolorometrisk anthronanalyse.

Bomuldsplanter dyrket i det grønne hus blev udvalgt til denne undersøgelse. Der blev udvalgt to forskellige forsøgslinjer for bomuld til komparativ analyse af celluloseindholdet. For hver eksperimentel linje blev rodvævet indsamlet fra tre biologiske replikater. I alt 500 mg væv blev homogeniseret, og 20 mg af det blev brugt til udvinding af rå cellevægge. Senere blev 5 mg råcellevægekstrakt brugt til Updegraff reagensbehandling for at fjerne hemicellulose og lignin fra cellulose. Den rensede cellulose blev hydr...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Updegraff-metoden er den mest anvendte metode til celluloseestimatet. Hovedformålet med denne demonstration er at tilvejebringe en detaljeret Updegraff-protokol til vurdering af celluloseindholdet i plantebiomasseprøver.

Estimering af krystallinsk celluloseindhold i plantebiomasse ved hjælp af Updegraff-metoden

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Her demonstrerer vi Updegraff-metoden, verdens mest anvendte metode til vurdering af krystallinsk celluloseindhold. Cellulose består dybest set af glukosemonomer forbundet med beta-1, 4 glycosidisk bindinger. Vi opdelte denne protokol i fem faser.I den første fase forbereder vi plantebiomassematerialet. I anden fase udtrækker vi den rå cellevæg. I tredje fase bruger vi Updegraff-behandling, hvor Updegraff består af eddikesyre og salpetersyre, der hjælper med at fjerne hemicellulose og lignin fra vores prøver.I fjerde fase udsætter vi det for syrehydrolyse ved hjælp af svovlsyre, der producerer glukosemonomererne. Endelig bruger vi i femte fase anthronanalyse til at estimere indholdet af krystallinsk cellulose. Opsaml plantematerialet fra drivhuset, vask dem grundigt med vand, lufttørre i to dage, adskil vævet og overfør vævet til de individuelt mærkede beholdere og inkubat i inkubatoren ved 49 grader Celsius i 10 dage.Så til sidst, skåret i stykker ved hjælp af en saks eller klinge. Frys vævet og læg det i mørtel og støder efter finslibning i ensartet pulver, eller brug fryser/mølle. Her demonstrerer vi ved hjælp af Fryser / Mill, så vi indlæser vores vævsprøver i disse slibeglas og placerer dem i fryseren / møllen og kører 10 CP-hastigheden i tre cyklusser.Vævspulveret opsamles i Falcon-røret som vist her. Der afvejes 20 mg af vævspulveret, og der overføres til et forvejet to mL-rør. Tilsæt en mL proteinopløselighedsbuffer for at fjerne proteiner. Vortex.Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér supernatanten. Gentag dette trin to gange mere.Tilsæt en mL sterilt vand til den tilbageholdte pellet. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Gentag dette trin to gange mere.Tilsæt en ML på 70% ethanol til den tilbageholdte pellet. Vortex. Overfør til en forvarmet 70 grader Celsius blok med samtidig rysten i en time. Efter en times inkubation, centrifuge ved 15.000 omdrejninger i fem minutter.Gentag dette trin endnu en gang. Til den gemte pellet tilsættes en mL på 100%methylon. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter.Der tilsættes en ml chloroform methanol. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér supernatanten og tilsæt en ml acetone. Vortex.Inkuber ved stuetemperatur i fem minutter. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér supernatanten igen, og lufttørre dem ved 37 grader Celsius natten over eller fortsætte ved vakuumtørring.Læg prøverne i vakuumtørreren og lufttørre i to til tre timer, eller indtil pellet er helt tør. Vejer fem mg af cellevægekstraktet opnået fra det foregående trin. Overfør til en to mL skrue hætte rør.Også inkludere positiv kontrol på dette punkt. Brug to mg Whatman-filterpapir til dette formål. Overfør til en to mL skrue hætte rør.Der tilsættes 1,5 mL Updegraff-reagens til hvert vejet cellevægekstrakt. Vortex og inkuber ved 100 grader Celsius i en forvarmet blok i 30 minutter. Efter 30 minutters inkubation overføres til et rack.Lad det køle af på bænken i 10 minutter. Centrifuge ved 15.000 omdrejninger i 10 minutter. Kassér supernatanten uden at forstyrre pelleten.Tilsæt en mL sterilt vand. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdrejninger i 10 minutter. Kassér 500 mikroliter af supernatanten.Tilføj en ml acetone. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér en mL af supernatanten.Tilføj en ml acetone. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér supernatanten helt.Tilføj en ml acetone. Vortex. Centrifuge ved 15.000 omdr./min. i fem minutter. Kassér supernatanten.Tør ved 37 grader Celsius natten over. Efter en inkubation en nat overføres til et rack. Der tilsættes en mL på 67% svovlsyre. Vortex.Inkuber ved 25 grader Celsius i en time med samtidig rysten. Efter en times inkubation skal du sørge for, at pellet er helt opløst. Overfør til et stativ.Dette er det sidste trin i celluloseudtrækningen. Nu er prøverne klar til prøvefortynding. Til prøvefortynding skal der anvendes 10 mikroliter af hver prøve fra det foregående trin, og der tilsættes 490 mikroliter sterilt vand.Gentag dette for alle forsøgsprøverne. Til glukosestandardkurvepræparatet skal der fremstilles en frisk bestand på 1 mg pr. mL glukose, og der fremstilles nul mikrogram til 200 mikrogramkoncentrationer ved at tilsætte en mg pr. mL glukose i 20 mikroliterintervaller og udgøre det endelige volumen til en mL med sterilt vand. Tag 500 mikroliter af hver forberedt standard i et skruehætterør og tilsæt en mL 0,2% anthrone.Og nu er prøverne klar til anthrone assay. Tilsæt en mL frisklavet anthron. Bland straks ved hvirvelstrømning og overførsel til is.Gentag for alle standarder og prøver på samme måde. Overfør derefter til en forvarmet 100 grader Celsius blok i 10 minutter. Efter 10 minutters inkubation overføres til is og inkuberes i fem minutter på is.Efter inkubationen tages 200 mikroliter af hver prøve i tre replikater. Gentag for både standarder og prøver på samme måde. Og en ladt 96-brønds plade blev lastet ind i en Multimode Detector.Ved hjælp af Smart Max Pro-programmet indstiller vi filterindstillingen til 620 nanometer. Pladetype til 96-brøndstype. Marker hele læseområdet.Klik på OK. læse. Læs plade. Du får absorberende aflæsninger af både standarder og prøver, som vil blive indsamlet i Excel-arket til yderligere analyse og estimering af celluloseindhold.Glukosestandardkurven fremstilles ved hjælp af glukosekoncentrationerne i mikrogram pr. mL på x-aksen og de normaliserede absorbansværdier for den respektive koncentration ved 620 nanometer på y-aksen. Vi får regressionslinjen med m- og c-værdierne i den afbildede scattergraf, vi bruger til at estimere prøvens krystallinske celluloseindhold. I det første trin, vi i gennemsnit OD værdier på 620 nanometer.Og så normaliserede vi dataene ved at trække den tomme værdi fra. Vi beregner glukosekoncentrationen ved hjælp af formlen x er lig med OD minus c/m, hvor vi tilslutter c- og m-værdier fra det foregående trin i regressionslinjen i standardkurven. Da det samlede volumen, der blev brugt til anthronanalyse, er 500 mikroliter, deler vi det med fortyndingsfaktor to.Da prøvevolumen, der blev brugt, kun var 10 mikroliter, vil vi yderligere dividere med 10 for at få mikrogram pr. mikroliterkoncentration af glukose, hvilket svarer til mg pr. mL-koncentration. Og så brugte vi fugtfaktoren 1,11, som er fugtforøgelsen i processen. Og endelig beregner vi procenten krystallinsk celluloseindhold ved at dividere det med cellevægsvægten, som er tæt på fem mg, og formere sig med 100 for at få procenten.Derefter beregnede vi gennemsnittet af det krystallinske celluloseindhold i tre biologiske replikater for at få værdien for individuelle prøver, som vil blive sammenlignet med et andet eksperimentelt linjegennemsnit på tre biologiske replikater. Og t-test kan bruges til at teste deres niveau af betydning. Her i tabel A viser vi tabelværdierne for koncentrationen og den respektive OD ved 620 nanometer, som yderligere blev brugt til at afbilde en scattergraf og en regressionslinje med de m- og c-værdier, der blev brugt i C til at opnå celluloseindholdsforskellene mellem de to eksperimentelle linjer.Afslutningsvis viser begge prøver celluloseforskelle. Tak, fordi du kiggede.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

En hurtig og effektiv metode til vurdering af Ustilago maydis's patogenitet på majs- og teosintelinjer

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-anlæg, Sterile mikrokosmos for rodknolddannelse og vækst af bælgplanter Plant<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Med Rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

Forbehandling af lignocellulose biomasse med Lavprisselskaber ioniske væsker

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammoniak Fiber Expansion (AFEX) Forbehandling af lignocellulosebiomasse

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

En ny metode til Pentosan analyse findes i Jute biomasse og deres omdannelse til sukker monomerer ved hjælp af sure ionisk væske

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plante infektion Test: Spray og sår-medieret podning med plante patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kvantificere plante opløseligt Protein og fordøjeligt kulhydrat indhold, ved hjælp af majs (Zea mays) som en eksemplarisk

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

En løkke-medieret isotermisk forstærkning (lampe) Assay til hurtig identifikation af Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, en lavpris-Open-source Datalogger til at anslå vandindholdet i Nonvascular Cryptogams

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Prøve forberedelse metode til scanning og transmission elektron mikroskop til tilhæng af træborebille

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...