Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

We danken het Department of Plant &Soil Science en Cotton Inc. voor hun gedeeltelijke steun aan deze studie.

1. Experimentele voorbereiding
<ol><li>Maal gedroogd plantmateriaal tot een fijn poeder.</li>
	<li>Protein Solubilization Buffer (PSB): Bereid stamoplossingen van 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (pH 8,0) en autoclaaf ze. Maak verse PSB-buffer van deze voorraadoplossingen met eindconcentraties van 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA en 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) in steriel water.</li>
	<li>Bereid 100 ml 70% ethanol (v/v): 70 ml 100% ethanol en 30 ml steriel water.</li>
	<li>Bereid 100 ml methanol:...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Katoenvezels zijn natuurlijke vezels die worden geproduceerd uit het katoenzaad. Katoenvezel is een enkele cel met ~95% cellulosegehalte2 met een hoog kristallijn cellulosegehalte met uitgebreide toepassingen in de textielindustrie31. Omdat katoenvezel ~ 95% cellulose bevat, hebben we katoenwortelweefsels gebruikt om de schatting van het kristallijne cellulosegehalte te demonstreren. Katoenwortelweefsels zijn matig rijk aan kristallijne cellulose en vertegenwoordigen een al...

Cellulose is de primaire dragende component van celwanden, die aanwezig is in zowel primaire als secundaire celwanden. De celwand is een extracellulaire matrix die plantencellen omringt en bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose, pectine en matrixeiwitten. Ongeveer een derde van de biomassa van planten is cellulose1 en het speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. Katoenvezel bevat 95% cellulose2-gehalte, terwijl bomen 40% tot 50% cellulose bevatten, afhankelijk van de plantensoort en orgaantypen3. De cellulose bestaat uit herhalende eenheden cellobiose, een disaccharide van glucoseresiduen verbonden door β-1,4 glycosidische bindingen4. Cellulose-ethanol wordt geproduceerd uit de glucose die is afgeleid van de cellulose die aanwezig is in de plantencelwanden5. Cellulosevezel bestaat uit verschillende microfibrils waarin elke microfibril fungeert als kerneenheid met 500-15000 glucosemonomeren1,6. Het cellulosehopolymeer wordt gesynthetiseerd door plasmamembraan ingebedde cellulosesynthasecomplexen (CSC's)1,7. Individuele cellulosesynthase A (CESA)-eiwitten synthetiseren glucanketens en de aangrenzende glucanketens worden door waterstofbindingen verbonden tot kristallijne cellulose1,8. Cellulose bestaat in verschillende kristallijne vormen met twee overheersende vormen, cellulose Iα en cellulose Iβ als inheemse vormen9. In hogere installaties bestaat cellulose in cellulose Iβ-vorm, terwijl lagere plantaardige cellulose bestaat in Iα-vorm10,11. Over het algemeen speelt de cellulose een belangrijke rol bij het overbrengen van sterkte en stijfheid aan de celwanden van de plant.
Biobrandstoffen van de eerste generatie worden voornamelijk geproduceerd uit maïszetmeel, rietsuikers en bietensuikers, die voedselbronnen zijn, terwijl biobrandstoffen van de tweede generatie zich richten op de productie van biobrandstoffen uit niet-voedsel plantaardig biomassacelwandmateriaal12. Een nauwkeurige schatting van het kristallijne cellulosegehalte is niet alleen belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar cellulosebiosynthese en celwanddynamiek, maar ook voor toegepast onderzoek naar biobrandstof en bioproducten. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld en geoptimaliseerd voor het schatten van cellulose in de biomassa van de installatie, en de Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor celluloseschatting. De eerste gerapporteerde methode voor de schatting van cellulose was door Cross en Bevan in 190813. De methode was gebaseerd op het principe van alternatieve chlorering en extractie door natriumsulfaat. De cellulose verkregen door de oorspronkelijke en gewijzigde protocollen van de Cross- en Bevan-methode vertoonde echter verontreiniging van kleine fracties lignine naast een aanzienlijke hoeveelheid xylanen en mannans14. Ondanks verschillende modificaties om lignine en hemicelluloses uit de cellulosefractie te verwijderen, behield de Cross-Bevan-methode een aanzienlijke hoeveelheid mannans samen met cellulose. Later werd Kurschner's methode ontwikkeld door salpeterzuur en ethanol te gebruiken om cellulose15te extraheren. Deze methode verklaarde dat de totale lignine en 75% van de pentosans werden verwijderd, maar de werkelijke celluloseresultaten waren dezelfde als die welke werden geschat met de chloreringsmethode van Cross en Bevan. Een andere methode (Norman en Jenkins) werd ontwikkeld door gebruik te maken van methanol-benzeen, natriumsulfaat en natriumhypochloriet om cellulose te extraheren16. Deze methode behield ook een fractie lignine (3%) en aanzienlijke hoeveelheden pentosans die leiden tot een nauwkeurige schatting van cellulose. Later gebruikten Kiesel en Semiganowsky een andere benadering van hydrolysecellulose met behulp van 80% geconcentreerd zwavelzuur, en de gehydrolyseerde gereduceerde suikers werden geschat door Bertrand's methode17. De twee methoden, Waksman's en Stevens18 en Salo14,19 die werden ontwikkeld op basis van kiesel en Semiganowsky's methode, leverden ook 4-5% minder cellulosegehalte op in vergelijking met eerdere methoden20.
De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Updegraff voor de meting van cellulose in 196921. De Updegraff-methode integreert de Kurschner-methode (gebruik van salpeterzuur), Kiesel- en Seminowsky-methoden (hydrolyse van cellulose in glucosemonomeren met behulp van zwavelzuur) met enkele wijzigingen, en de antroposinetest van Viles en Silverman voor een eenvoudige colorimetrische schatting van het glucose- en kristallijne cellulosegehalte22. Het principe van deze methode is het gebruik van azijnzuur en salpeterzuur (Updegraff-reagens) om hemicellulose en lignine uit de gehomogeniseerde plantenweefsels te verwijderen, waardoor azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose voor verdere verwerking en schatting15. De azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose wordt behandeld met 67% zwavelzuur om de cellulose in glucosemonomeren te breken en de vrijgekomen glucosemonomeren worden geschat door antroposofie21,23. Verschillende wijzigingen van de oorspronkelijke Updegraff-methode werden gebruikt om de procedure en de celluloseraming te vereenvoudigen door antroposofie24. In grote lijnen kan deze methode worden onderverdeeld in vijf fasen. In de eerste fase wordt het plantmateriaal bereid. In de tweede fase wordt de ruwe celwand gescheiden van de totale biomassa, omdat cellulose het belangrijkste onderdeel is van plantencelwanden. Later, in de derde fase, wordt de cellulose gescheiden van de niet-cellulosecelwandcomponenten door behandeling met Updegraff-reagens. In de vierde fase wordt de azijnzuur/salpeterzuurresistente cellulose door zwavelzuurbehandeling in glucosemonomeren afgebroken. Zwavelzuurbehandeling van cellulose resulteert in de vorming van 5-hydroxymethylfurfurale verbindingen uit de reactie van glucosemonomeren met zwavelzuur. Ten slotte genereert het anthrone in de laatste fase een groenblauw complex door te koken met de furfurale verbinding die in de vorige fase25werd gegenereerd . Deze antroposofische colorimetrische methode werd voor het eerst gebruikt in 1942 door Dreywood. Anthrone is een kleurstof die furfurale verbindingen van pentose en hexose gedehydrateerde producten zoals 5-hydroxymethylfurfural identificeert, onder zure omstandigheden. Reactie met hexose produceert een intense kleur en een betere respons in vergelijking met pentoses25. De hoeveelheid gebonden glucose wordt gemeten door spectrofotometerabsorptie bij 620 nm en de intensiteit van het groenblauwe complex is direct evenredig met de hoeveelheid suiker in het monster. De gemeten absorptiewaarden werden vergeleken met een glucosestandaard curveregressielijn om de glucoseconcentratie van het monster te berekenen. Het gemeten glucosegehalte werd gebruikt om het cellulosegehalte van de plantaardige biomassa te schatten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

Cellulose is het meest voorkomende polymeer op aarde dat wordt gegenereerd door fotosynthese en de belangrijkste dragende component van celwanden. De celwand speelt een belangrijke rol in de groei en ontwikkeling van planten door het bieden van kracht, stijfheid, snelheid en richting van celgroei, onderhoud van celvorm en bescherming tegen biotische en abiotische stressoren. De celwand bestaat voornamelijk uit cellulose, lignine, hemicellulose en pectine. Onlangs zijn de celwanden van planten gericht op de productie van biobrandstof en bio-energie van de tweede generatie. In het bijzonder wordt de cellulosecomponent van de plantencelwand gebruikt voor de productie van cellulose-ethanol. Schatting van het cellulosegehalte van biomassa is van cruciaal belang voor fundamenteel en toegepast celwandonderzoek. De Updegraff-methode is eenvoudig, robuust en de meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa. De alcohol onoplosbare ruwe celwandfractie bij behandeling met Updegraff reagens elimineert de hemicellulose- en ligninefracties. Later wordt de Updegraff reagensresistente cellulosefractie onderworpen aan zwavelzuurbehandeling om het cellulosehomopolymeer te hydrolyseren tot monomere glucose-eenheden. Een regressielijn wordt ontwikkeld met behulp van verschillende concentraties glucose en gebruikt om de hoeveelheid glucose te schatten die vrijkomt bij hydrolyse van cellulose in de experimentele monsters. Ten slotte wordt het cellulosegehalte geschat op basis van de hoeveelheid glucosemonomeren door colorimetrische antroposofietest.

Katoenplanten die in het groene huis werden gekweekt, werden geselecteerd voor deze studie. Voor de vergelijkende analyse van het cellulosegehalte werden twee verschillende experimentele katoenlijnen geselecteerd. Voor elke experimentele lijn werd het wortelweefsel verzameld uit drie biologische replica's. In totaal werd 500 mg weefsel gehomogeniseerd en 20 mg ervan werd gebruikt voor extractie van ruwe celwanden. Later werd 5 mg ruw celwandextract gebruikt voor updegraff-reagensbehandeling om hemicellulose en lignine ui...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

De Updegraff-methode is de meest gebruikte methode voor de celluloseschatting. Het belangrijkste doel van deze demonstratie is om een gedetailleerd Updegraff-protocol te bieden voor de schatting van het cellulosegehalte in biomassamonsters van planten.

Schatting van het kristallijne cellulosegehalte van plantaardige biomassa met behulp van de Updegraff-methode

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Hier demonstreren we de Updegraff-methode, 's werelds meest gebruikte methode voor de schatting van het kristallijne cellulosegehalte. Cellulose bestaat in principe uit glucosemonomeren verbonden door bèta-1, 4 glycosidische bindingen. We hebben dit protocol in vijf fasen verdeeld.In de eerste fase bereiden we het biomassamateriaal van de installatie voor. In de tweede fase halen we de ruwe celwand eruit. In de derde fase gebruiken we een Updegraff-behandeling waarbij Updegraff bestaat uit azijnzuur en salpeterzuur dat helpt bij het verwijderen van hemicellulose en lignine uit onze monsters.In de vierde fase onderwerpen we het aan zure hydrolyse met behulp van zwavelzuur dat de glucosemonomeren produceert. Ten slotte gebruiken we in de vijfde fase een antroposofie om het kristallijne cellulosegehalte te schatten. Verzamel het plantmateriaal uit de kas, was ze grondig met water, droog ze twee dagen aan de lucht, scheid het weefsel en breng het weefsel over naar de individueel gelabelde containers en incubeer gedurende 10 dagen in de incubator bij 49 graden Celsius.Snijd vervolgens in stukken met een schaar of mes. Vries het weefsel in en laad het in mortel en stamper voor fijn malen tot uniform poeder of gebruik als alternatief Freezer/Mill. Hier demonstreren we met freezer/mill, dus laden we onze weefselmonsters in deze maalflacons en plaatsen ze in de Freezer /Mill en draaien de 10 CP-snelheid gedurende drie cycli.Het weefselpoeder wordt verzameld in de Falcon-buis zoals hier getoond. Weeg 20 mg van het weefselpoeder en breng over in een voorgewogen buis van twee ml. Voeg een ml eiwitslubilisatiebuffer toe om eiwitten te verwijderen. draaikolk.Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap nog twee keer.Voeg een ml steriel water toe aan de vastgehouden pellet. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Herhaal deze stap nog twee keer.Voeg een ML 70% ethanol toe aan de vastgehouden pellet. draaikolk. Breng over naar een voorverwarmd blok van 70 graden Celsius met gelijktijdig schudden gedurende een uur. Na een incubatietijd van een uur centrifugeer je gedurende vijf minuten bij 15.000 rpm.Herhaal deze stap nog een keer. Voeg aan de opgeslagen pellet een ml 100% methylone toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten.Voeg één ml chloroform methanol toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en voeg een ml aceton toe. draaikolk.Incubeer vijf minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant opnieuw weg en droog ze 's nachts aan de lucht bij 37 graden Celsius of ga verder met vacuümdrogen.Plaats uw monsters in de vacuümdroger en droog ze twee tot drie uur aan de lucht of totdat de pellet volledig droog is. Weeg vijf mg van het celwandextract verkregen uit de vorige stap. Breng over in een schroefdopbuis van twee ml.Neem op dit moment ook positieve controle op. Gebruik daarvoor twee mg Whatman-filterpapier. Breng over op een schroefdopbuis van twee ml.Voeg 1,5 ml Updegraff-reagens toe aan elk gewogen celwandextract. Vortex en incubeer bij 100 graden Celsius in een voorverwarmd blok gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie, overbrengen naar een rek.Laat het 10 minuten afkoelen op de bank. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren.Voeg één ml steriel water toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende 10 minuten. Gooi 500 microliter van het supernatant weg.Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi een ml van het supernatant weg.Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant volledig weg.Voeg een ml aceton toe. draaikolk. Centrifugeer bij 15.000 rpm gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg.'s Nachts drogen bij 37 graden Celsius. Na een incubatie van één nacht, breng je over naar een rek. Voeg een ml zwavelzuur van 67% toe. draaikolk.Incubeer een uur lang bij 25 graden Celsius met gelijktijdig schudden. Zorg er na een incubatietijd van een uur voor dat de pellet volledig is opgelost. Overzetten naar een rek.Dit is de laatste stap van de cellulose-extractie. Nu zijn de monsters klaar voor monsterverdunning. Gebruik voor monsterverdunning 10 microliter van elk monster uit de vorige stap en voeg 490 microliter steriel water toe.Herhaal dit voor alle experimentele monsters. Bereid voor het glucosestandaardcurvepreparaat een verse voorraad van één mg per ml glucose en bereid nul microgram tot 200 microgram concentraties voor door één mg per ml glucose in stappen van 20 microliter toe te voegen en het uiteindelijke volume samen te stellen tot één ml met steriel water. Neem 500 microliter van elke voorbereide standaard in een schroefdopbuis en voeg een ml 0,2% antroposine toe.En nu zijn de monsters klaar voor antroposofie. Voeg een ml vers bereid antroposofie toe. Meng onmiddellijk door vortexen en breng over op ijs.Herhaal dit voor alle standaarden en monsters op dezelfde manier. Breng vervolgens gedurende 10 minuten over naar een voorverwarmd blok van 100 graden Celsius. Na 10 minuten incubatie, breng over op ijs en incubeer gedurende vijf minuten op ijs.Neem na incubatie 200 microliter van elk monster in drie replicaties. Herhaal dit voor zowel standaarden als monsters op dezelfde manier. En een geladen 96-put plaat werd geladen in een Multimode Detector.Met het Smart Max Pro-programma stellen we de filterinstelling in op 620 nanometer. Plaattype naar 96-well type. Selecteer het hele leesgebied.Klik op OK. lezen. Lees plaat. U verkrijgt de absorptiewaarden van zowel standaarden als monsters, die worden verzameld in het Excel-blad voor verdere analyse en schatting van het cellulosegehalte.De glucosestandaardcurve wordt bereid met behulp van de glucoseconcentraties in microgram per ml op de x-as en de genormaliseerde absorptiewaarden van de respectieve concentratie op 620 nanometer op de y-as. We krijgen de regressielijn met m- en c-waarden in de uitgeplotste spreidingsgrafiek die we gebruiken om het kristallijne cellulosegehalte van het monster te schatten. In de eerste stap hebben we de OD-waarden gemiddeld op 620 nanometer.En toen normaliseerden we de gegevens door de lege waarde af te trekken. We berekenen de glucoseconcentratie met behulp van de formule x is gelijk aan OD minus c/m waarbij we c- en m-waarden van de vorige stap van de regressielijn in de standaardcurve aansluiten. Aangezien het totale volume dat werd gebruikt voor antroposofie 500 microliter is, delen we het door verdunningsfactor twee.Aangezien het gebruikte monstervolume slechts 10 microliter was, delen we verder door 10 om microgram per microliterconcentratie glucose te krijgen, wat gelijk is aan mg per ml concentratie. En toen gebruikten we de vochtfactor 1.11, de vochttoename in het proces. En ten slotte berekenen we het kristallijne cellulosegehalte van het percentage door het te delen met het celwandgewicht, dat dicht bij vijf mg ligt, en vermenigvuldigen we ons met 100 om het percentage te krijgen.Vervolgens hebben we het kristallijne cellulosegehalte van drie biologische duplo's gemiddeld om de waarde voor individuele monsters te krijgen, wat zal worden vergeleken met een ander experimenteel lijngemiddelde van drie biologische replica's. En t-test kan worden gebruikt om hun niveau van betekenis te testen. Hier in tabel A tonen we de tabelwaarden van de concentratie en de respectieve OD op 620 nanometer, die verder werd gebruikt om een spreidingsgrafiek en een regressielijn te plotten met de m- en c-waarden die in de C werden gebruikt voor het verkrijgen van de cellulosegehalteverschillen tussen de twee experimentele lijnen.Concluderend kunnen worden weergegeven dat beide monsters celluloseverschillen vertonen. Bedankt voor het kijken.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Een snelle en efficiënte methode voor het beoordelen van pathogeniteit van Ustilago maydis op maïs- en teosintelijnen

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Met de stikstofbindende Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

Voorbehandeling van lignocellulose met Low-cost ionische vloeistoffen

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammoniak Fiber Expansion (AFEX) Voorbehandeling van Lignocellulosic Biomassa

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Een nieuwe methode voor de analyse van de Pentosan aanwezig in Jute biomassa en de omzetting in suiker monomeren met zure Ionische vloeistof

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kwantificeren van de Plant oplosbaar eiwit en verteerbare koolhydraten inhoud, met behulp van maïs (Zea mays) als een Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

Een lus-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) Assay voor snelle identificatie van Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, een Low-cost Open-source Datalogger te schatten het watergehalte van Nonvascular cryptogamen

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Monster voorbereiding methode van scannen en transmissie elektronenmicroscoop voor de aanhangsels van woodboring Kever

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...