Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
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Nous remercions le ministère des Sciences des plantes et des sols et Cotton Inc. pour leur appui partiel à cette étude.

1. Préparation expérimentale
<ol><li>Moudre le matériel végétal séché en poudre fine.</li>
	<li>Tampon de solubilisation protéique (PSB) : Préparez des solutions de stock de 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M d’acide éthylèneediaminetétraacetic (EDTA) (pH 8.0) et autoclavez-les. Faites tampon PSB frais de ces solutions de stock avec des concentrations finales de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA et 10% de sulfate de dodecyl de sodium (SDS) dans l’eau stérile.</li>
	<li>Préparer 100 mL d’éthanol à 70 % (v/v) : 70 mL d...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. 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G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Les fibres de coton sont des fibres naturelles produites à partir des oléagineux. La fibre de coton est une cellule unique avec la teneur en cellulose ~95%2 avec la teneur élevée en cellulose cristalline avec des applications étendues dans l’industrie textile31. Comme, fibre de coton contient ~ 95% cellulose, nous avons utilisé des tissus de racine de coton pour la démonstration de l’estimation de la teneur en cellulose cristalline. Les tissus racinaires de coton...

La cellulose est le principal composant porteur de charges des parois cellulaires, qui est présent dans les parois cellulaires primaires et secondaires. La paroi cellulaire est une matrice extracellulaire qui entoure les cellules végétales et est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose, pectine et protéines matricielles. Environ un tiers de la biomasse végétale est la cellulose1 et elle joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La fibre de coton contient 95% de cellulose2 contenu, tandis que les arbres contiennent 40% à 50% de cellulose selon les espèces végétales et les typesd’organes 3. La cellulose est composée d’unités répétées de cellobiose, un disaccharide de résidus de glucose reliés par β-1,4 liaisons glycosidiques4. L’éthanol cellulosique est produit à partir du glucose dérivé de la cellulose présente dans les parois cellulairesvégétales 5. La fibre cellulosique est composée de plusieurs micro fibrilles dans lesquelles chaque micro fibril agit comme unité centrale avec 500-15000 monomères de glucose1,6. L’homopolymère de cellulose est synthétisé par des complexes de synthase de cellulose embarqués par membrane plasmatique (CSC)1,7. Les protéines individuelles de synthase de cellulose A (CESA) synthétisent des chaînes de glucane et les chaînes de glucanes adjacentes sont reliées par des liaisons hydrogène pour former la cellulose cristalline1,8. La cellulose existe sous plusieurs formes cristallines avec deux formes prédominantes, la cellulose Iα et la cellulose Iβ sous forme de formes indigènes9. Dans les plantes supérieures, la cellulose existe sous forme de cellulose Iβ tandis que la cellulose végétale inférieure existe sous forme Iα10,11. Dans l’ensemble, la cellulose joue un rôle important en donnant de la force et de la rigidité aux parois des cellules végétales.
Les biocarburants de première génération sont principalement produits à partir de amidon de maïs, de sucres de canne et de sucres de betterave, qui sont des sources alimentaires, tandis que les biocarburants de deuxième génération se concentrent sur la production de biocarburants à partir de matériaux non alimentaires de paroi cellulaire à base de cellules debiomasse végétale 12. L’estimation précise de la teneur en cellulose cristalline est non seulement importante pour la recherche fondamentale sur la biosynthèse de la cellulose et la dynamique des paroi cellulaires, mais aussi pour la recherche appliquée sur les biocarburants et les bioprodits. Diverses méthodes ont été développées et optimisées pour l’estimation de la cellulose dans la biomasse végétale, et la méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. La première méthode rapportée pour l’estimation de cellulose était par Croix et Bevan en 190813. La méthode était basée sur le principe de la chloration et de l’extraction alternatives par sulfate de sodium. Cependant, la cellulose obtenue par les protocoles originaux et modifiés de la méthode Cross et Bevan a montré la contamination de petites fractions de lignine en plus d’une quantité substantielle de xylans et mannans14. En dépit de plusieurs modifications pour enlever la lignine et les hémicelluloses de la fraction de cellulose, la méthode de Cross-Bevan a conservé une quantité considérable de mannans avec la cellulose. Plus tard, la méthode de Kurschner a été développée en employant l’acide nitrique et l’éthanol pour extraire la cellulose15. Cette méthode a déclaré que la lignine totale et 75% des pentosans ont été enlevés, mais les résultats réels de cellulose étaient les mêmes que ceux estimés par la méthode de chloration de Cross et Bevan. Une autre méthode (Norman et Jenkins) a été développée en employant le méthanol-benzène, le sulfate de sodium, et l’hypochlorite de sodium pour extraire la cellulose16. Cette méthode a également conservé une fraction de lignine (3%) et des quantités importantes de pentosans conduisant à une estimation précise de la cellulose. Plus tard, Kiesel et Semiganowsky ont utilisé une approche différente pour hydrolyser la cellulose en utilisant 80% d’acide sulfurique concentré, et les sucres réduits hydrolysés ont été estimés par la méthode de Bertrand17. Les deux méthodes, Waksman et Stevens18 et Salo14,19 quiont été développées sur la base de la méthode de Kiesel et Semiganowsky, ont également donné 4-5% moins de contenu en cellulose par rapport aux méthodes antérieures20.
La méthode Updegraff est la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Cette méthode a été décrite pour la première fois par Updegraff pour la mesure de la cellulose en 196921. La méthode Updegraff intègre la méthode Kurschner (utilisation d’acide nitrique), les méthodes Kiesel et Seminowsky (hydrolyse de cellulose dans les monomères de glucose utilisant de l’acide sulfurique) avec quelques modifications, et l’essai anthrone de Viles et Silverman pour une estimation colorimétrique simple du glucose et de la teneur en cellulose cristalline22. Le principe de cette méthode est l’utilisation de l’acide acétique et de l’acide nitrique (réagent updegraff) pour éliminer l’hémicellulose et la lignine des tissus végétaux homogénéisés, qui laisse la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique pour un traitement et une estimationultérieurs 15. La cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est traitée avec 67% d’acide sulfurique pour casser la cellulose en monomères de glucose et les monomères de glucose libérés sont estimés par essai anthrone21,23. Plusieurs modifications de la méthode originale d’Updegraff ont été employées pour simplifier la procédure et l’estimation de cellulose par l’essai anthrone24. Dans l’ensemble, cette méthode peut être divisée en cinq phases. Dans la première phase, le matériel végétal est préparé. Dans la deuxième phase, la paroi cellulaire brute est séparée de la biomasse totale, car la cellulose est le composant clé des parois cellulaires végétales. Plus tard, dans la troisième phase, la cellulose est séparée des composants non cellulosiques de la paroi cellulaire en traitant avec le réaccente Updegraff. Dans la quatrième phase, la cellulose résistante à l’acide acétique/nitrique est divisée en monomères de glucose par traitement à l’acide sulfurique. Le traitement acide sulfurique de la cellulose entraîne la formation de composés 5 hydroxyméthylfurfural de la réaction des monomères de glucose avec de l’acide sulfurique. Enfin, dans la dernière phase, l’anthrone génère un complexe bleu verdâtre en bouillant avec le composé furfural généré dans la phaseprécédente 25. Cette méthode colorimétrique à base d’anthrone a été utilisée pour la première fois en 1942 par Dreywood. Anthrone est un colorant qui identifie les composés furfural de pentose et de produits déshydratés à l’hexose tels que les produits déshydratés 5 hydroxyméthylfurfural, dans des conditions acides. La réaction avec l’hexose produit une couleur intense et une meilleure réponse comparée aux pentoses25. La quantité de glucose lié est mesurée par absorption du spectrophotomètre à 620 nm et l’intensité du complexe bleu verdâtre est directement proportionnelle à la quantité de sucre dans l’échantillon. Les valeurs d’absorption mesurées ont été comparées à une ligne standard de régression de courbe de glucose pour calculer la concentration de glucose de l’échantillon. La teneur mesurée en glucose a été utilisée pour estimer la teneur en cellulose de la biomasse végétale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

La cellulose est le polymère le plus abondant sur Terre généré par la photosynthèse et le principal composant porteur des parois cellulaires. La paroi cellulaire joue un rôle important dans la croissance et le développement des plantes en fournissant la force, la rigidité, le taux et la direction de la croissance cellulaire, le maintien de la forme cellulaire et la protection contre les facteurs de stress biotiques et abiotiques. La paroi cellulaire est principalement composée de cellulose, lignine, hémicellulose et pectine. Récemment, les parois cellulaires végétales ont été ciblées pour la production de biocarburants et de bioénergie de deuxième génération. Plus précisément, la composante cellulose de la paroi cellulaire végétale est utilisée pour la production d’éthanol cellulosique. L’estimation de la teneur en cellulose de biomasse est essentielle pour la recherche fondamentale et appliquée sur les paroi cellulaires. La méthode Updegraff est simple, robuste et la méthode la plus utilisée pour estimer la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale. La fraction insoluble de mur brut d’alcool de cellules au traitement avec le réagent d’Updegraff élimine les fractions d’hémicellulose et de lignine. Plus tard, la fraction résistante à la cellulose réaccétique Updegraff est soumise à un traitement à l’acide sulfurique pour hydrolyser l’homopolymère de cellulose en unités de glucose monomères. Une ligne de régression est développée en utilisant diverses concentrations de glucose et utilisée pour estimer la quantité de glucose libérée sur l’hydrolyse de cellulose dans les échantillons expérimentaux. Enfin, la teneur en cellulose est estimée en fonction de la quantité de monomères de glucose par essai colorimétrique anthrone.

Les plants de coton cultivés dans la maison verte ont été sélectionnés pour cette étude. Deux lignées expérimentales différentes de coton ont été sélectionnées pour l’analyse comparative de la teneur en cellulose. Pour chaque lignée expérimentale, le tissu racinaire a été prélevé à partir de trois répliques biologiques. Un total de 500 mg de tissu a été homogénéisé et 20 mg de celui-ci a été utilisé pour l’extraction de la paroi cellulaire brute. Plus tard, 5 mg d’extrait brut de paroi ...

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Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

La méthode Updegraff est la méthode la plus largement utilisée pour l’estimation de la cellulose. L’objectif principal de cette démonstration est de fournir un protocole updegraff détaillé pour l’estimation de la teneur en cellulose dans les échantillons de biomasse végétale.

Estimation de la teneur en cellulose cristalline de la biomasse végétale à l’aide de la méthode Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Ici, nous démontrons la méthode Updegraff, la méthode la plus largement utilisée au monde pour l’estimation de la teneur en cellulose cristalline. La cellulose est essentiellement composée de monomères de glucose liés par beta-1, 4 liaisons glycosidiques. Nous avons divisé ce protocole en cinq phases.Dans la première phase, nous préparons le matériau de biomasse végétale. Dans la deuxième phase, nous extrayons la paroi cellulaire brute. Dans la troisième phase, nous utilisons le traitement Updegraff dans lequel Updegraff est composé d’acide acétique et d’acide nitrique qui aide à l’élimination de l’hémicellulose et de la lignine de nos échantillons.Dans la quatrième phase, nous le soumettons à l’hydrolyse acide à l’aide d’acide sulfurique qui produit les monomères de glucose. Enfin, dans la cinquième phase, nous utilisons un test anthrone pour estimer la teneur en cellulose cristalline. Recueillir le matériel végétal de la serre, les laver soigneusement avec de l’eau, sécher à l’air pendant deux jours, séparer le tissu et transférer le tissu dans les contenants étiquetés individuellement et les incuber dans l’incubateur à 49 degrés Centigrade pendant 10 jours.Puis enfin, couper en morceaux à l’aide de ciseaux ou de lame. Congeler le tissu et le charger dans le mortier et le pilon pour le broyage fin en poudre uniforme ou utiliser alternativement congélateur / moulin. Ici, nous démontrons à l’aide de congélateur/moulin, donc nous chargeons nos échantillons de tissus dans ces flacons de broyage et les placeons dans le congélateur/moulin et utilisons la vitesse de 10 CP pendant trois cycles.La poudre de tissu est recueillie dans le tube falcon comme indiqué ici. Peser 20 mg de la poudre de tissu et transférer dans un tube pré-pesé de deux mL. Ajouter un mL de tampon de solubilisation des protéines pour éliminer les protéines. tourbillon.Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le surnatant. Répétez cette étape deux fois de plus.Ajouter un mL d’eau stérile à la pastille retenue. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Répétez cette étape deux fois de plus.Ajouter une ML de 70 % d’éthanol à la pastille retenue. tourbillon. Transférer dans un bloc centigrade préchauffé de 70 degrés avec secousse simultanée pendant une heure. Après une heure d’incubation, centrifugeuse à 15 000 RPM pendant cinq minutes.Répétez cette étape une fois de plus. À la pastille économisée, ajouter un mL de 100% méthylone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes.Ajouter un mL de méthanol chloroforme. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le supernatant et ajouter un mL d’acétone. tourbillon.Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Re-jeter le supernatant et l’air les sécher à 37 degrés Centigrade pendant la nuit ou continuer par séchage sous vide.Chargez vos échantillons dans le séchoir à vide et séchez l’air pendant deux à trois heures ou jusqu’à ce que la pastille soit complètement sèche. Pesez cinq mg de l’extrait de la paroi cellulaire obtenu à partir de l’étape précédente. Transférer dans un tube de bouchon à vis de deux mL.Incluez également un contrôle positif à ce stade. Utilisez deux mg de papier filtre Whatman à cette fin. Transférer dans un tube à bouchon à vis de deux mL.Ajouter 1,5 mL de réagencé Updegraff à chaque extrait de paroi cellulaire pesée. Vortex et incuber à 100 degrés Centigrade dans un bloc préchauffé pendant 30 minutes. Après 30 minutes d’incubation, transférer sur une grille.Laissez refroidir sur le banc pendant 10 minutes. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 10 minutes. Jeter le surnatant sans déranger la pastille.Ajouter un mL d’eau stérile. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 10 minutes. Jeter 500 microlitres du supernatant.Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter un mL du surnatant.Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jetez complètement le surnatant.Ajouter un mL d’acétone. tourbillon. Centrifugeuse à 15 000 RPM pendant 5 minutes. Jeter le surnatant.Sec à 37 degrés Centigrades durant la nuit. Après une incubation d’une nuit, transférer sur une grille. Ajouter un mL d’acide sulfurique à 67 %. tourbillon.Incuber à 25 degrés Centigrades pendant une heure avec secousses simultanées. Après une heure d’incubation, assurez-vous que la pastille est complètement dissoute. Transférer sur une grille.C’est la dernière étape de l’extraction de la cellulose. Maintenant, les échantillons sont prêts pour la dilution de l’échantillon. Pour la dilution de l’échantillon, utilisez 10 microlitres de chaque échantillon de l’étape précédente et ajoutez 490 microlitres d’eau stérile.Répétez cette demande pour tous les échantillons expérimentaux. Pour la préparation de courbe standard de glucose, préparez un stock frais d’un mg par mL de glucose et préparez zéro microgramme à 200 concentrations de microgrammes en ajoutant un mg par glucose mL en 20 incréments de microlitre et faites le volume final à un mL avec de l’eau stérile. Prenez 500 microlitres de chaque norme préparée dans un tube de bouchon à vis et ajoutez un mL 0,2% anthrone.Et maintenant, les échantillons sont prêts pour un essai anthrone. Ajouter un mL d’anthrone fraîchement préparé. Mélanger immédiatement par vortex et transférer sur la glace.Répétez pour toutes les normes et les échantillons de la même manière. Puis transférer à un bloc préchauffé 100 degrés Centigrade pendant 10 minutes. Après 10 minutes d’incubation, transférer sur la glace et incuber pendant cinq minutes sur la glace.Après l’incubation, prendre 200 microlitres de chaque échantillon en trois répliques. Répétez l’essai pour les normes et les échantillons de la même manière. Et une plaque chargée de 96 puits a été chargée dans un détecteur multimode.En utilisant le programme Smart Max Pro, nous avons réglé le réglage du filtre à 620 nanomètres. Type de plaque à 96-bien type. Sélectionnez toute la zone de lecture.Cliquez sur OK. lire. Lisez la plaque. Vous obtenez les lectures d’absorption des normes et des échantillons, qui seront collectés dans la feuille Excel pour une analyse et une estimation plus approfondies de la teneur en cellulose.La courbe standard de glucose est préparée en utilisant les concentrations de glucose dans les microgrammes par mL sur x-axe et les valeurs normalisées d’absorption de la concentration respective à 620 nanomètres sur l’axe y. Nous obtenons la ligne de régression avec des valeurs m et c dans le graphique de dispersion tracé que nous utilisons pour estimer la teneur en cellulose cristalline de l’échantillon. Dans la première étape, nous avons fait la moyenne des valeurs d’OD à 620 nanomètres.Et puis nous avons normalisé les données en soustrayant la valeur vierge. Nous calculons la concentration de glucose en utilisant la formule x est égale à OD moins c/m où nous branchons les valeurs c et m de l’étape précédente de la ligne de régression dans la courbe standard. Puisque le volume total qui a été employé pour l’essai d’anthrone est 500 microlitres, nous le divisons par le facteur de dilution deux.Puisque le volume d’échantillon qui a été employé était seulement 10 microlitres, nous diviserons encore par 10 pour obtenir des microgrammes par concentration de microlitre de glucose qui est égale à mg par concentration de mL. Et puis nous avons utilisé le facteur d’humidité 1.11 qui est le gain d’humidité dans le processus. Et enfin, nous calculons la teneur en cellulose cristalline pour cent en la divisant avec le poids de la paroi cellulaire, qui est proche de cinq mg, et se multiplient par 100 pour obtenir le pour cent.Ensuite, nous avons fait la moyenne de la teneur en cellulose cristalline de trois répliques biologiques pour obtenir la valeur pour les échantillons individuels, qui seront comparés à une autre moyenne de ligne expérimentale de trois répliques biologiques. Et t-test peut être utilisé pour tester leur niveau de signification. Ici, dans le tableau A, nous montrons les valeurs de table de la concentration et de l’OD respectif à 620 nanomètres, qui a été utilisé pour tracer un graphique de dispersion et une ligne de régression avec les valeurs m et c qui ont été utilisées dans le C pour obtenir les différences de contenu de cellulose entre les deux lignées expérimentales.En conclusion, les deux échantillons montrent des différences de cellulose. Merci d’avoir regardé.

Research

JoVE Journal

Environment

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Recherche

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