Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
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Wir danken dem Department of Plant & Soil Science und Cotton Inc. für die teilweise Unterstützung dieser Studie.

1. Experimentelle Zubereitung
<ol><li>Getrocknetes Pflanzenmaterial zu einem feinen Pulver mahlen.</li>
	<li>Protein-Solubilisationspuffer (PSB): Bereiten Sie Lagerlösungen von 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (pH 8.0) vor und autoklavn Sie sie. Machen Sie aus diesen Lagerlösungen einen frischen PSB-Puffer mit Endkonzentrationen von 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA und 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) in sterilem Wasser.</li>
	<li>100 ml 70% Ethanol (v/v): 70 ml 100% Ethanol und 30 ml steriles Wasse...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Baumwollfasern sind Naturfasern, die aus dem Baumwollsaat hergestellt werden. Baumwollfaser ist eine Einzelzelle mit einem Cellulosegehalt von95 % 2 mit hohem kristallinem Zellulosegehalt mit umfangreichen Anwendungen in der Textilindustrie31. Da Baumwollfasern 95 % Cellulose enthalten, haben wir Baumwollwurzelgewebe verwendet, um die Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts zu demonstrieren. Baumwollwurzelgewebe sind mäßig reich an kristallinem Zellulosegehalt und st...

Cellulose ist die primäre tragende Komponente von Zellwänden, die sowohl in primären als auch in sekundären Zellwänden vorhanden ist. Die Zellwand ist eine extrazelluläre Matrix, die Pflanzenzellen umgibt und hauptsächlich aus Zellulose, Lignin, Hemicellulose, Pektin und Matrixproteinen besteht. Ungefähr ein Drittel der Pflanzenbiomasse ist Cellulose1 und sie spielt eine wichtige Rolle beim Pflanzenwachstum und der Pflanzenentwicklung, indem sie Stärke, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Baumwollfasern enthalten 95%Cellulose-2-Gehalt, während Bäume 40% bis 50% Zellulose je nach Pflanzenart und Organtypen3enthalten. Die Cellulose besteht aus sich wiederholenden Einheiten von Cellobiose, einem Disaccharid von Glukoserückständen, die durch β-1,4 glykosidische Bindungen4verbunden sind. Cellulose-Ethanol wird aus der Glukose hergestellt, die aus der in den Pflanzenzellwänden vorhandenen Zellulose gewonnen wird5. Cellulose Faser besteht aus mehreren Mikrofibrillen, in denen jedes Mikrofibril als Kerneinheit mit 500-15000 Glukosemonomeren1,6fungiert. Das Cellulose-Homopolymer wird durch Plasmamembran-eingebettete Cellulose-Synthase-Komplexe (CSC's)1,7synthetisiert. Individuelle Cellulosesynthase A (CESA) Proteine synthetisieren Glucanketten und die angrenzenden Glucanketten sind durch Wasserstoffbindungen zu kristalliner Cellulose1,8verbunden. Cellulose existiert in mehreren kristallinen Formen mit zwei vorherrschenden Formen, Cellulose I und Cellulose I als native Formen9. In höheren Pflanzen existiert Cellulose in Zellulose-I-Form, während untere Pflanzenzellulose in I-Form10,11existiert. Insgesamt spielt die Zellulose eine wichtige Rolle bei der Stärkung und Steifigkeit der Pflanzenzellwände.
Biokraftstoffe der ersten Generation werden hauptsächlich aus Maisstärke, Rohrzucker und Rübenzucker hergestellt, die Nahrungsquellen sind, während Biokraftstoffe der zweiten Generation sich auf die Biokraftstoffproduktion aus Biomasse-Zellwandmaterial von Non-Food-Pflanzen konzentrieren12. Die genaue Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts ist nicht nur für die Grundlagenforschung zur Zellulosebiosynthese und Zellwanddynamik wichtig, sondern auch für die Forschung über angewandte Biokraftstoffe und Bioprodukte. Verschiedene Methoden wurden entwickelt und optimiert für die Abschätzung von Zellulose in der pflanzlichen Biomasse, und die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Zelluloseschätzung. Die erste gemeldete Methode zur Zelluloseschätzung wurde von Cross und Bevan 190813gemeldet. Das Verfahren beruhte auf dem Prinzip der alternativen Chlorierung und Extraktion durch Natriumsulfat. Die durch die ursprüngliche sowie modifizierte Protokolle der Cross- und Bevan-Methode erhaltene Cellulose zeigte jedoch eine Kontamination kleiner Ligninfraktionen zusätzlich zu einer erheblichen Menge an Xylanen und Mannanen14. Trotz mehrerer Modifikationen zur Entfernung von Lignin und Hemicellulosen aus der Zellulosefraktion behielt die Cross-Bevan-Methode zusammen mit Cellulose eine beträchtliche Menge an Mannanen bei. Später wurde Kurschners Methode unter Verwendung von Salpetersäure und Ethanol zur Extraktion von Cellulose15entwickelt. Diese Methode besagte, dass die gesamte Lignin und 75% der Pentosane entfernt wurden, aber die wahren Cellulose-Ergebnisse waren die gleichen wie die durch Chlorierungsmethode von Cross und Bevan geschätzt. Eine andere Methode (Norman und Jenkins) wurde unter Verwendung von Methanol-Benzol, Natriumsulfat und Natriumhypochlorit zur Extraktion von Cellulose16entwickelt. Diese Methode behielt auch einen Bruchteil von Lignin (3%) und signifikante Mengen an Pentosanen, die zu einer genauen Schätzung der Zellulose führen. Später verwendeten Kiesel und Semiganowsky einen anderen Ansatz, um Cellulose mit 80% konzentrierter Schwefelsäure zu hydrolysieren, und die hydrolysierten reduzierten Zucker wurden nach Bertrands Methode17geschätzt. Die beiden Methoden, Waksman es und Stevens18 und Salo14,19, die auf der Grundlage der Kiesel- und Semiganowsky-Methode entwickelt wurden, ergaben ebenfalls 4-5% weniger Zellulosegehalt im Vergleich zu früheren Methoden20.
Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode zur Schätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Diese Methode wurde erstmals von Updegraff für die Messung von Zellulose im Jahr 1969beschrieben 21. Die Updegraff-Methode integriert die Kurschner-Methode (Verwendung von Salpetersäure), Kiesel- und Seminowsky-Methoden (Hydrolyse von Cellulose in Glukosemonomere mit Schwefelsäure) mit einigen Modifikationen und den Anthron-Assay von Viles und Silverman zur einfachen kolorimetrischen Abschätzung des Glukose- und kristallinen Cellulosegehalts22. Das Prinzip dieser Methode ist die Verwendung von Essigsäure und Salpetersäure (Updegraff Reagenz), um Hemicellulose und Lignin aus den homogenisierten Pflanzengeweben zu entfernen, die essig/Salpetersäure-resistente Cellulose zur Weiterverarbeitung und Schätzung15zurücklassen. Die essigsäure-/salpetersäureresistente Cellulose wird mit 67% Schwefelsäure behandelt, um die Cellulose in Glukosemonomere zu brechen und die freigesetzten Glukosemonomere werden durch Anthron-Assay21,23geschätzt. Mehrere Modifikationen der ursprünglichen Updegraff-Methode wurden verwendet, um das Verfahren und die Zelluloseabschätzung durch Anthron-Assay24zu vereinfachen. Im Großen und Ganzen kann diese Methode in fünf Phasen unterteilt werden. In der ersten Phase wird das Pflanzenmaterial vorbereitet. In der zweiten Phase wird die Rohzellwand von der gesamten Biomasse getrennt, da Zellulose der Schlüsselbestandteil von Pflanzenzellwänden ist. Später, in der dritten Phase, wird die Zellulose durch Behandlung mit Updegraff-Reagenz von den nicht-zelluloseischen Zellwandkomponenten getrennt. In der vierten Phase wird die essigsäure-/stickstoffsäureresistente Cellulose durch Schwefelsäurebehandlung in Glukosemonomere gebrochen. Die Schwefelsäurebehandlung von Cellulose führt zur Bildung von 5-Hydroxymethylfurfuralverbindungen aus der Reaktion von Glukosemonomeren mit Schwefelsäure. Schließlich erzeugt der Anthron in der letzten Phase einen grünlich-blauen Komplex durch Kochen mit der furfuralen Verbindung, die in der vorherigen Phase25erzeugt wurde. Diese anthronbasierte kolorimetrische Methode wurde erstmals 1942 von Dreywood verwendet. Anthrone ist ein Farbstoff, der Furfuralverbindungen von Pentose und Hexose dehydrierte Produkte wie 5-Hydroxymethylfurfural identifiziert, unter sauren Bedingungen. Reaktion mit Hexose produziert eine intensive Farbe und bessere Reaktion im Vergleich zu Pentoses25. Die Menge der gebundenen Glukose wird durch Spektralphotometer-Absorption bei 620 nm gemessen und die Intensität des grünlich-blauen Komplexes ist direkt proportional zur Zuckermenge in der Probe. Die gemessenen Absorptionswerte wurden mit einer Regressionslinie der Glukose-Standardkurve verglichen, um die Glukosekonzentration der Probe zu berechnen. Der gemessene Glukosegehalt wurde verwendet, um den Zellulosegehalt der pflanzenden Biomasse zu schätzen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

Cellulose ist das am häufigsten vorkommende Polymer auf der Erde, das durch Photosynthese erzeugt wird, und die Haupttragende Komponente von Zellwänden. Die Zellwand spielt eine wichtige Rolle für das Pflanzenwachstum und die Entwicklung, indem sie Kraft, Steifigkeit, Geschwindigkeit und Richtung des Zellwachstums, Zellformerhaltung und Schutz vor biotischen und abiotischen Stressoren bietet. Die Zellwand besteht hauptsächlich aus Cellulose, Lignin, Hemicellulose und Pektin. Kürzlich wurden Pflanzenzellwände für die Biokraftstoff- und Bioenergieproduktion der zweiten Generation ins Visier genommen. Insbesondere wird die Zellulosekomponente der Pflanzenzellwand zur Herstellung von Celluloseethanol verwendet. Die Abschätzung des Zellulosegehalts von Biomasse ist für die grundlagende und angewandte Zellwandforschung von entscheidender Bedeutung. Die Updegraff-Methode ist einfach, robust und die am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse. Die alkoholunlösliche rohzellige Wandfraktion bei behandlung mit Updegraff-Reagenz eliminiert die Hemicellulose- und Ligninfraktionen. Später wird die Updegraff Reagenz-resistente Cellulosefraktion einer Schwefelsäurebehandlung unterzogen, um das Cellulose-Homopolymer in monomere Glukoseeinheiten zu hydrolysieren. Eine Regressionslinie wird mit verschiedenen Glukosekonzentrationen entwickelt und verwendet, um die Menge der Glukose zu schätzen, die bei der Zellulosehydrolyse in den Versuchsproben freigesetzt wird. Schließlich wird der Cellulosegehalt anhand der Menge an Glukosemonomeren durch farbmetrischen Anthronassay geschätzt.

Für diese Studie wurden Baumwollpflanzen ausgewählt, die im grünen Haus angebaut wurden. Für die vergleichende Analyse des Zellulosegehalts wurden zwei verschiedene Versuchslinien aus Baumwolle ausgewählt. Für jede versuchsweise Linie wurde das Wurzelgewebe aus drei biologischen Repliken entnommen. Insgesamt 500 mg Gewebe wurde homogenisiert und 20 mg davon wurde für die Rohzellwandextraktion verwendet. Später wurden 5 mg Rohzell-Wandextrakt zur Behandlung von Updegraff-Reagenzien verwendet, um Hemicellulose und ...

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Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Die Updegraff-Methode ist die am weitesten verbreitete Methode für die Zelluloseschätzung. Der Hauptzweck dieser Demonstration besteht darin, ein detailliertes Updegraff-Protokoll zur Schätzung des Zellulosegehalts in pflanzlichen Biomasseproben bereitzustellen.

Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts pflanzlicher Biomasse nach der Updegraff-Methode

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Hier zeigen wir die Updegraff-Methode, die weltweit am weitesten verbreitete Methode zur Abschätzung des kristallinen Zellulosegehalts. Cellulose besteht im Wesentlichen aus Glucosemonomeren, die durch Beta-1, 4 glykodidische Bindungen verbunden sind. Wir haben dieses Protokoll in fünf Phasen unterteilt.In der ersten Phase bereiten wir den pflanzlichen Biomassematerial vor. In der zweiten Phase extrahieren wir die rohe Zellwand. In der dritten Phase verwenden wir updegraff-Behandlung, bei der Updegraff aus Essigsäure und Salpetersäure besteht, die bei der Entfernung von Hemicellulose und Lignin aus unseren Proben hilft.In der vierten Phase unterziehen wir sie einer sauren Hydrolyse mit Hilfe von Schwefelsäure, die die Glukosemonomere produziert. Schließlich verwenden wir in der fünften Phase einen Anthron-Assay, um den kristallinen Zellulosegehalt zu schätzen. Sammeln Sie das Pflanzenmaterial aus dem Gewächshaus, waschen Sie es gründlich mit Wasser, trocknen Sie es zwei Tage lang, trennen Sie das Gewebe und übertragen Sie das Gewebe in die individuell gekennzeichneten Behälter und inkubieren Sie im Inkubator bei 49 Grad Celsius für 10 Tage.Dann schließlich in Stücke schneiden mit Schere oder Klinge. Einfrieren des Gewebes und laste in Mörtel und Stößel für feines Schleifen in gleichmäßiges Pulver oder alternativ verwenden Freezer / Mühle. Hier demonstrieren wir mit Freezer/Mill, also laden wir unsere Gewebeproben in diese Schleiffläschchen und legen sie in den Gefrierschrank/Mühle und führen die 10 CP-Geschwindigkeit für drei Zyklen aus.Das Gewebepulver wird in der Falcon-Röhre gesammelt, wie hier gezeigt. Wiegen Sie 20 mg des Gewebepulvers und übertragen Sie in ein vorgewogenes zwei ml-Rohr. Fügen Sie einen ml Protein-Löslichkeitspuffer hinzu, um Proteine zu entfernen. Vortex.Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male.Fügen Sie dem zurückgehaltenen Pellet ein ml steriles Wasser hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei Weitere Male.Fügen Sie dem zurückgehaltenen Pellet einen ML 70% Ethanol hinzu. Vortex. Transfer in einen vorgeheizten 70 Grad Celsius Block bei gleichzeitigem Schütteln für eine Stunde. Nach einer Stunde Inkubation zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 15.000 U/min.Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal. Zum gespeicherten Pellet einen ml 100%Methylon hinzufügen. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten.Fügen Sie ein ml Chloroform-Methanol hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex.Bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubieren. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Den Überstand wieder entsorgen und bei 37 Grad Celsius über Nacht trocknen oder durch Vakuumtrocknung fortsetzen.Laden Sie Ihre Proben in den Vakuumtrockner und trocknen Sie zwei bis drei Stunden trocken oder bis das Pellet vollständig trocken ist. Wiegen Sie fünf mg des Zellwandextrakts aus dem vorherigen Schritt. In ein zwei ml Schraubverschlussrohr übertragen.Auch positive Kontrolle an dieser Stelle enthalten. Verwenden Sie zwei mg Whatman Filterpapier für diesen Zweck. Auf ein zwei ml Schraubverschlussrohr übertragen.Fügen Sie 1,5 ml Updegraff-Reagenz zu jedem gewogenen Zellwandextrakt hinzu. Wirbel und inkubieren bei 100 Grad Celsius in einem vorgeheizten Block für 30 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation in ein Rack übertragen.Lassen Sie es auf der Bank für 10 Minuten abkühlen. Zentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.Fügen Sie ein ml steriles Wasser hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für 10 Minuten. Entsorgen Sie 500 Mikroliter des Überstandes.Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie einen ml des Überstandes.Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand vollständig.Fügen Sie einen ML Aceton hinzu. Vortex. Zentrifuge bei 15.000 U/min für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.Trocknen Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht. Nach einer eintägigen Inkubation in ein Rack übertragen. Fügen Sie ein ml 67%Schwefelsäure hinzu. Vortex.Bei 25 Grad Celsius eine Stunde bei gleichzeitigem Schütteln inkubieren. Stellen Sie nach einer Einstündigen Inkubation sicher, dass das Pellet vollständig aufgelöst ist. Transfer in ein Rack.Dies ist der letzte Schritt der Zelluloseextraktion. Nun sind die Proben zur Probenverdünnung bereit. Für die Probenverdünnung 10 Mikroliter jeder Probe aus dem vorherigen Schritt verwenden und 490 Mikroliter steriles Wasser hinzufügen.Wiederholen Sie dies für alle experimentellen Proben. Für die Glukose-Standardkurvenzubereitung einen frischen Vorrat von einem mg pro ml Glukose zubereiten und null Mikrogramm auf 200 Mikrogramm Konzentrationen vorbereiten, indem man ein mg pro ml Glukose in 20 Mikroliter-Schritten hinzufügt und das Endvolumen zu einem ml mit sterilem Wasser zusammenstellt. Nehmen Sie 500 Mikroliter von jedem vorbereiteten Standard in einem Schraubverschlussrohr und fügen Sie eine ml 0,2%anthron.Und jetzt sind die Proben bereit für den Anthron-Assay. Fügen Sie einen ml frisch zubereiteten Anthron. Mischen Sie sofort durch Wirbeln und auf Eis übertragen.Wiederholen Sie dies für alle Standards und Beispiele auf die gleiche Weise. Dann in einen vorgeheizten 100 Grad Celsius Block für 10 Minuten übertragen. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis übertragen und fünf Minuten auf Eis brüten.Nach der Inkubation nehmen Sie 200 Mikroliter jeder Probe in drei Replikationen. Wiederholen Sie dies sowohl für Standards als auch für Beispiele auf die gleiche Weise. Und eine geladene 96-Well-Platte wurde in einen Multimode-Detektor geladen.Mit dem Smart Max Pro-Programm stellen wir die Filtereinstellung auf 620 Nanometer ein. Plattentyp bis 96-Well-Typ. Wählen Sie den gesamten Lesebereich aus.Klicken Sie auf OK. Lesen. Leseplatte. Sie erhalten die Absorptionswerte sowohl von Standards als auch von Proben, die im Excel-Blatt zur weiteren Analyse und Abschätzung des Zellulosegehalts gesammelt werden.Die Glukose-Standardkurve wird unter Verwendung der Glukosekonzentrationen in Mikrogramm pro ml auf der x-Achse und der normalisierten Absorptionswerte der jeweiligen Konzentration bei 620 Nanometern auf der y-Achse hergestellt. Wir erhalten die Regressionslinie mit m- und c-Werten im geplotteten Streudiagramm, das wir verwenden, um den gehaltalen Zellulosegehalt der Probe zu schätzen. Im ersten Schritt haben wir die OD-Werte auf 620 Nanometer gemittelt.Und dann normalisierten wir die Daten, indem wir den leeren Wert subtrahierten. Wir berechnen die Glukosekonzentration mit der Formel x ist gleich OD minus c/m, wo wir c und m Werte aus dem vorherigen Schritt der Regressionslinie in der Standardkurve einstecken. Da das Gesamtvolumen, das für den Anthrontest verwendet wurde, 500 Mikroliter beträgt, teilen wir es durch Verdünnungsfaktor zwei.Da das verwendete Probenvolumen nur 10 Mikroliter betrug, werden wir weiter um 10 dividieren, um Mikrogramm pro Mikroliter Glukosekonzentration zu erhalten, die mg pro ml Konzentration entspricht. Und dann haben wir den Feuchtigkeitsfaktor 1.11 verwendet, der der Feuchtigkeitsgewinn im Prozess ist. Und schließlich berechnen wir den prozentualen kristallinen Zellulosegehalt, indem wir ihn mit dem Zellwandgewicht dividieren, das nahe fünf mg beträgt, und multiplizieren mit 100, um den Prozentsatz zu erhalten.Dann haben wir den kristallinen Zellulosegehalt von drei biologischen Replikationen gemittelt, um den Wert für einzelne Proben zu erhalten, der mit einem anderen experimentellen Liniendurchschnitt von drei biologischen Replikationen verglichen wird. Und t-test kann verwendet werden, um ihre Signifikanz zu testen. Hier in Tabelle A zeigen wir die Tabellenwerte der Konzentration und der jeweiligen OD bei 620 Nanometern, die weiter verwendet wurden, um ein Streudiagramm und eine Regressionslinie mit den m- und c-Werten darzustellen, die im C zur Erlangung der Zellulosegehaltsunterschiede zwischen den beiden Versuchslinien verwendet wurden.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass beide Proben Zelluloseunterschiede aufweisen. Danke fürs Zuschauen.

Research

JoVE Journal

Environment

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Umwelt

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

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Einzel-Anlage, steril Mikrokosmen für Knöllchenbildung und des Wachstums der Pflanze Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Mit dem Rhizobia Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

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Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

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Ammoniakfaserausdehnung (AFEX) Vorbehandlung von lignozellulosehaltiger Biomasse

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Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

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Quantifizierung der Pflanze lösliche Protein und verdauliche Kohlenhydrate Inhalt, Verwendung von Mais (Zea Mays) als ein Exemplar

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This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...