Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

אנו מודים למחלקה למדעי הקרקע והכותנה בע"מ על תמיכתם החלקית במחקר זה.

1. הכנה ניסיונית
<ol><li>טוחנים חומר צמחי מיובש לאבקה דקה.</li>
	<li>מאגר סולובליזציה של חלבונים (PSB): הכינו פתרונות מלאי של 1 M Tris (pH 8.8), 0.5 M חומצה אתילנדיאמיאנטטראקטית (EDTA) (pH 8.0) ומובלעת אותן אוטומטית. הפוך מאגר PSB טרי מפתרונות מלאי אלה עם ריכוזים סופיים של 50 mM Tris, 0.5 מ"מ EDTA ו 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) במים ...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

סיבי כותנה הם סיבים טבעיים המיוצרים מן זרעי הכותנה. סיבי כותנה הוא תא יחיד עם ~ 95% תוכן תאית2 עם תוכן תאית גבישי גבוה עם יישומים נרחבים בתעשיית הטקסטיל31. כמו, סיבי כותנה מכיל ~ 95% תאית, השתמשנו ברקמות שורש כותנה להדגמה של הערכת תוכן תאית גבישית. רקמות שורש כותנה עשירו?...

תאית היא המרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא, אשר קיים הן בקירות התא הראשי והן בקירות התא המשני. דופן התא היא מטריצה חוץ-תאית המקיפה תאי צמחים ומורכבת בעיקר מחלבוני תאית, ליגנין, המיצלולוז, פקטין ומטריצה. כשליש מהביומסה של הצמחים היא תאית1 והיא ממלאת תפקידים משמעותיים בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני גורמי לחץ ביוטיים ואביוטיים. סיבי כותנה מכילים 95% תאית2 תוכן, בעוד עצים מכילים 40% עד 50% של תאית בהתאם למין הצמח וסוגי איברים3. התאית מורכבת מיחידות חוזרות של צ'לוביוז, מפרק של שאריות גלוקוז המחוברות על ידי β-1,4 קשרים גליקופידיים4. אתנול צלולוסי מופק מן הגלוקוז נגזר תאית נוכח בקירות תא הצמח5. סיבים צלולוסיים מורכבים ממספר סיבי מיקרו שבהם כל סיב מיקרו פועל כיחידת ליבה עם מונומרים גלוקוז 500-150001,6. homopolymer תאית מסונתז על ידי קרום פלזמה מוטבע קומפלקסים סינתאז תאית (CSC)1,7. חלבוני סינתאז תאית בודדים A (CESA) מסנתזים שרשראות גלוקן ושרשראות הגלוקן הסמוכות מחוברות באמצעות קשרי מימן ליצירת תאית גבישית1,8. תאית קיימת במספר צורות גבישיות עם שתי צורות דומיננטיות, תאית Iα ו תאית Iβ כצורות מקוריות9. בצמחים גבוהים יותר, תאית קיימת בצורת תאית Iβ בעוד תאית הצמח התחתון קיים בצורת Iα10,11. בסך הכל, התאית ממלאת תפקיד משמעותי בהקניית כוח ונוקשות לקירות תאי הצמח.
דלקים ביולוגיים מהדור הראשון מיוצרים בעיקר מעמילן תירס, סוכרי קנים וסוכרי סלק, שהם מקורות מזון, ואילו דלקים ביולוגיים מהדור השני מתמקדים בייצור דלק ביולוגי מחומר קיר תא ביומסה שאינו מזון12. הערכה מדויקת של תכולת תאית גבישית חשובה לא רק למחקר בסיסי על ביוסינתזה תאית ודינמיקה של דופן התא, אלא גם למחקר יישומי של דלק ביולוגי ומוצרי ביו. שיטות שונות פותחו ואופטימיזציה להערכת תאית בביומסה הצמחית, ושיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. השיטה המדווחת הראשונה להערכת תאית הייתה על ידי קרוס ובבן בשנת 190813. השיטה התבססה על העיקרון של כלור חלופי ומיצוי על ידי נתרן גופרתי. עם זאת, תאית שהושגה על ידי המקורי, כמו גם פרוטוקולים שונה של שיטת קרוס בוואן הראה זיהום של שברים קטנים של ליגנין בנוסף כמות משמעותית של xylans ו mannans14. למרות מספר שינויים להסרת ליגנין והמיצלולוזים מהשבר התאי, שיטת Cross-Bevan שמרה על כמות ניכרת של מנאנים יחד עם תאית. מאוחר יותר, השיטה של Kurschner פותחה על ידי שימוש בחומצה חנקתית ואתנול כדי לחלץ תאית15. שיטה זו קבעה כי סך ליגנין ו 75% של pentosans הוסרו אבל התוצאות תאית האמיתית היו זהים לאלה המוערכים על ידי שיטת כלור של קרוס בוואן. שיטה נוספת (נורמן וג'נקינס) פותחה על ידי שימוש במתנול-בנזן, נתרן סולפט ונתרן היפוכלוריט לחילוץ תאית16. שיטה זו גם שמרה על חלק קטן של ליגנין (3%) וכמויות משמעותיות של פנטוסנים המובילות להערכת תאית מדויקת. מאוחר יותר, Kiesel ו Semiganowsky השתמשו בגישה שונה כדי הידרוליזה תאית באמצעות 80% מרוכז חומצה גופרתית, ואת סוכרים מופחתים הידרוליזה הוערכו על ידי השיטה של ברטרנד17. שתי השיטות, של וקסמן וסטיבנס18 וסאלו14,19 שפותחו על בסיס השיטה של קיזל וסמיגנובסקי, הניבו גם 4-5% פחות תוכן תאית בהשוואה לשיטותקודמות 20.
שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תכולת תאית גבישית. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Updegraff למדידת תאית בשנת 196921. שיטת Updegraff משלבת את שיטת קורשנר (שימוש בחומצה חנקתית), שיטות קיזל וסמינובסקי (הידרוליזה של תאית לתוך מונומרים של גלוקוז באמצעות חומצה גופרתית) עם כמה שינויים, ואת מבחני האנתרון של ויילס וסילברמן להערכת צבעים פשוטה של גלוקוז ותכולת תאית גבישית22. העיקרון של שיטה זו הוא השימוש בחומצה אצטית וחומצה חנקתית (מגיב Updegraff) כדי לחסל hemicellulose ו ליגנין מרקמות הצמח הומוגנית, אשר משאיר תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית לעיבוד נוסף והערכת15. תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מטופלת עם 67% חומצה גופרתית כדי לשבור את תאית לתוך מונומרים גלוקוז מונומרים גלוקוז שוחרר מוערך על ידי anthrone assay21,23. מספר שינויים בשיטת Updegraff המקורית שימשו כדי לפשט את ההליך ואת הערכת תאית על ידי anthrone assay24. באופן כללי, ניתן לחלק שיטה זו לחמישה שלבים. בשלב הראשון, החומר הצמחי מוכן. בשלב השני, קיר התא הגולמי מופרד מן הביומסה הכוללת, כמו תאית היא המרכיב העיקרי של קירות התא הצמח. מאוחר יותר, בשלב השלישי, התאית מופרדת מרכיבי דופן התא הלא צלולוסי על ידי טיפול עם ריאגנט Updegraff. בשלב הרביעי, תאית עמידה חומצה אצטית / חנקתית מחולק מונומרים גלוקוז על ידי טיפול חומצה גופרתית. טיפול חומצה גופרתית של תוצאות תאית היווצרות של תרכובות 5-hydroxymethylfurfural מהתגובה של מונומרים גלוקוז עם חומצה גופרתית. לבסוף, בשלב האחרון, האנתרון יוצר קומפלקס כחול ירקרק על ידי רותחים עם תרכובת furfural שנוצר בשלב הקודם25. שיטה קוורימטרית מבוססת אנתרון זו שימשה לראשונה בשנת 1942 על ידי דרייווד. אנתרון הוא צבע המזהה תרכובות פורפורליות של מוצרים מיובשים פנטוז ו hexose כגון 5-hydroxymethylfurfural, בתנאים חומציים. תגובה עם הקסוס מייצרת צבע אינטנסיבי ותגובה טובה יותר בהשוואה pentoses25. כמות הגלוקוז המאוגד נמדדת על ידי ספיגת ספקטרופוטומטר ב 620 ננומטר ואת עוצמת קומפלקס כחול ירקרק הוא פרופורציונלי ישירות לכמות הסוכר במדגם. ערכי הספיגה הנמדדים הושוו לקו רגרסיה של עקומת גלוקוז סטנדרטית לחישוב ריכוז הסוכר של המדגם. תכולת הגלוקוז הנמדדת שימשה להערכת תכולת תאית של ביומסה הצמח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

תאית היא הפולימר הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ שנוצר על ידי פוטוסינתזה והמרכיב העיקרי נושא העומס של קירות התא. קיר התא ממלא תפקיד משמעותי בצמיחה ובהתפתחות הצמח על ידי מתן כוח, קשיחות, קצב וכיוון של צמיחת תאים, תחזוקת צורת תאים והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים. דופן התא מורכבת בעיקר תאית, ליגנין, hemicellulose ופקטין. לאחרונה קירות תאי הצמח היו ממוקדים לייצור דלק ביולוגי וביו-אנרגיה מהדור השני. באופן ספציפי, רכיב תאית של דופן התא הצמח משמש לייצור אתנול צלולוסי. הערכה של תוכן תאית של ביומסה היא קריטית למחקר בסיסי ויישומי של דופן התא. שיטת Updegraff היא פשוטה, חזקה, ואת השיטה הנפוצה ביותר להערכת תוכן תאית גבישית של ביומסה צמחית. האלכוהול מסיסים תאים גולמיים החלק על הטיפול עם ריאגנט Updegraff מבטל את שברי hemicellulose ו ליגנין. מאוחר יותר, חלק תאית עמיד ריאגנט Updegraff נתון לטיפול חומצה גופרתית כדי הידרוליזה הומופולימר תאית ליחידות גלוקוז מונומרי. קו רגרסיה מפותח באמצעות ריכוזים שונים של גלוקוז ומשמש להערכת כמות הגלוקוז המשתחרר על הידרוליזה תאית בדגימות הניסוי. לבסוף, התוכן תאית מוערך בהתבסס על כמות מונומרים גלוקוז על ידי בדיקת אנתרון צבעוני.

צמחים כותנה גדל בבית הירוק נבחרו למחקר זה. שני קווים ניסיוניים שונים של כותנה נבחרו לניתוח השוואתי של תכולת תאית. עבור כל קו ניסיוני, רקמת השורש נאספה משלושה משכפלים ביולוגיים. סך של 500 מ ג של רקמה היה הומוגני ו 20 מ ג של זה שימש להפקת דופן התא הגולמי. מאוחר יותר, 5 מ"ג של תמצית דופן התא הגולמי שי...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

שיטת Updegraff היא השיטה הנפוצה ביותר להערכת תאית. המטרה העיקרית של הדגמה זו היא לספק פרוטוקול Updegraff מפורט להערכת תכולת תאית בדגימות ביומסה צמחית.

הערכת תכולת תאית גבישית של ביומסה צמחית בשיטת Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

כאן, אנו מדגימים את שיטת Updegraff, השיטה הנפוצה ביותר בעולם להערכת תוכן תאית גבישית. תאית מורכבת בעצם מונומרים גלוקוז מקושר על ידי בטא 1, 4 קשרים גליקוסידיים. חילקנו את הפרוטוקול הזה לחמישה שלבים.בשלב הראשון, אנו מכינים את החומר ביומסה הצמח. בשלב השני, אנחנו מוציאים את קיר התא הגולמי. בשלב השלישי, אנו משתמשים בטיפול Updegraff שבו Updegraff מורכב חומצה אצטית וחומצה חנקתית המסייעת בהסרת hemicellulose ו lignin מהדגימות שלנו.בשלב הרביעי, אנו כפופים אותו חומצה הידרוליזה בעזרת חומצה גופרתית המייצרת מונומרים גלוקוז. לבסוף, בשלב החמישי, אנו משתמשים ב-anthrone assay כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית. לאסוף את החומר הצמחי מהחממה, לשטוף אותם ביסודיות עם מים, אוויר יבש במשך יומיים, להפריד את הרקמה ולהעביר את הרקמה למיכלים המסומנים בנפרד דגירה באינקובטור ב 49 מעלות צלזיוס במשך 10 ימים.ואז לבסוף, לחתוך לחתיכות באמצעות מספריים או להב. להקפיא את הרקמה ולהעמיס לתוך מרגמה ועלי לטחינה עדינה לתוך אבקה אחידה או לחילופין להשתמש מקפיא / טחנה. כאן, אנו מדגימים באמצעות מקפיא / מיל, אז אנחנו מעמיסים את דגימות הרקמה שלנו לתוך בקבוקונים שחיקה אלה ומניחים אותם במקפיא / מיל ולהפעיל את מהירות 10 CP במשך שלושה מחזורים.אבקת הרקמות נאספת בצינור פלקון כפי שמוצג כאן. שוקלים 20 מ"ג של אבקת הרקמה ומעבירים לצינור שני מ"ל שקל מראש. הוסיפו מ"ל אחד של מאגר סולובליזציה של חלבונים להסרת חלבונים. מערבולת.צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים לכדור השמור. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.הוסף ML אחד של 70% אתנול לכדור שנשמר. מערבולת. מעבירים לבלוק צלזיוס שחומם מראש ב-70 מעלות עם רעידות בו זמנית למשך שעה. לאחר דגירה של שעה, צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך חמש דקות.חזור על שלב זה פעם נוספת. לכדור שנשמר, להוסיף מ"ל אחד של 100% מתילון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות.הוסף ML אחד של מתנול כלורופורם. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את supernatant ולהוסיף mL אחד של אצטון. מערבולת.דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. להשליך מחדש את supernatant ואוויר לייבש אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה או להמשיך על ידי ייבוש ואקום.לטעון את הדגימות שלך לתוך מייבש ואקום ואוויר יבש במשך שעתיים עד שלוש שעות או עד גלולה יבש לחלוטין. לשקול חמישה מ"ג של תמצית דופן התא המתקבל מהשלב הקודם. העברה לצינור כובע בורג 2 מ"ל.כלול גם שליטה חיובית בשלב זה. השתמש בשני מ"ג של נייר מסנן Whatman למטרה זו. העבר לצינור כובע בורג של שני מ"ל.הוסף 1.5 מ"ל של ריאגנט Updegraff לכל תמצית קיר התא שקל. וורטקס ודגרת ב 100 מעלות צלזיוס בבלוק שחומם מראש במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה, להעביר למדף.אפשר לו להתקרר על הספסל במשך 10 דקות. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. להשליך את supernatant מבלי להפריע גלולה.מוסיפים מ"ל אחד של מים סטריליים. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד ל-10 דקות. השלך 500 מיקרוליטרים של העל-טבעי.הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך ML אחד של העל-טבעי.הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את העל-טבעי לחלוטין.הוסף מ"ל אחד של אצטון. מערבולת. צנטריפוגה ב-15,000 סל"ד לחמש דקות. השלך את הסופרנט.יבש ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר דגירה של לילה אחד, העבר למדף. הוסף מ"ל אחד של 67% חומצה גופרתית. מערבולת.דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת עם רעידות בו זמנית. לאחר דגירה של שעה, ודא את גלולה מומס לחלוטין. העבר למדף.זהו השלב האחרון של החילוץ תאית. עכשיו הדגימות מוכנות לדילול דגימה. לדילול הדגימה, השתמשו ב-10 מיקרוליטרים של כל דגימה מהשלב הקודם והוסיפו 490 מיקרוליטרים של מים סטריליים.חזור על זה לכל הדגימות הניסיוניות. להכנת עקומת הגלוקוז הסטנדרטית, הכינו מלאי טרי של מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז והכינו אפס מיקרוגרם ל-200 ריכוזי מיקרוגרם על ידי הוספת מ"ג אחד לכל מ"ל גלוקוז במרווחים של 20 מיקרוליטר והגדלת הנפח הסופי ל-mL אחד עם מים סטריליים. יש ליטול 500 מיקרוליטר מכל תקן מוכן בצינור כובע בורג ולהוסיף 0.2% אנתרון מ"ל אחד.ועכשיו הדגימות מוכנות לבדיקת אנתרון. הוסף מ"ל אחד של אנתרון שהוכן טרי. מערבבים מיד על ידי מערבולת ומעבירים לקרח.חזור על הפעולה עבור כל הסטנדרטים והדגימות באותו אופן. לאחר מכן העבר לגוש צלזיוס שחומם מראש ל-100 מעלות למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות דגירה, להעביר קרח דגירה במשך חמש דקות על הקרח.לאחר הדגירה, יש ליטול 200 מיקרוליטרים של כל דגימה בשלושה עותקים משוכפלים. חזור על הפעולה הן עבור תקנים והן עבור דוגמאות באותו אופן. וצלחת טעונה של 96 באר הועמסה לגלאי רב-מוד.באמצעות תוכנית Smart Max Pro, הגדרנו את הגדרת המסנן ל- 620 ננומטר. סוג לוח לסוג של 96 באר. בחר את כל אזור הקריאה.לחץ על אישור. קרא. קרא צלחת. אתה מקבל את קריאות הספיגה הן של תקנים והן של דוגמאות, שייאספו בגיליון Excel לצורך ניתוח נוסף והערכת תוכן תאית.עקומת תקן גלוקוז מוכנה באמצעות ריכוזי הגלוקוז במיקרוגרם ל-mL על ציר x וערכי הספיגה המנורמלים של הריכוז המתאים ב-620 ננומטר על ציר ה-y. אנחנו מקבלים את קו הרגרסיה עם ערכי m ו- c בגרף הפיזור התואם שאנו משתמשים בו כדי להעריך את תכולת התאית הגבישית לדוגמה. בשלב הראשון, אנחנו ממוצע ערכי OD ב 620 ננומטר.ואז נרמלנו את הנתונים על ידי חיסור הערך הריק. אנו מחשבים את ריכוז הסוכר באמצעות הנוסחה x שווה OD מינוס c/m שבו אנו מחברים c ו- m ערכים מהשלב הקודם של קו הרגרסיה בעקומה הסטנדרטית. מכיוון שהנפח הכולל ששימש לבדיקת אנתרון הוא 500 מיקרוליטרים, אנו מחלקים אותו בגורם דילול 2.מכיוון שנפח הדגימה שהיה בשימוש היה רק 10 מיקרוליטרים, נתחלק עוד יותר ב-10 כדי לקבל מיקרוגרם לריכוז מיקרוליטר של גלוקוז השווה לריכוז מ"ג ל-mL. ואז השתמשנו בגורם הלחות 1.11 שהוא רווח הלחות בתהליך. ולבסוף, אנו מחשבים את אחוז התוכן תאית גבישית על ידי חלוקת אותו עם משקל דופן התא, אשר קרוב לחמישה מ"ג, ולהתרבות על ידי 100 כדי לקבל את האחוז.ואז אנחנו ממוצע התוכן תאית גבישית של שלושה משכפלים ביולוגיים כדי לקבל את הערך עבור דגימות בודדות, אשר יושוו מול ממוצע קו ניסיוני אחר של שלושה משכפלים ביולוגיים. וניתן להשתמש במבחן t כדי לבחון את רמת המשמעות שלהם. כאן בטבלה A, אנו מציגים את ערכי הטבלה של הריכוז ואת OD בהתאמה ב 620 ננומטר, אשר שימש עוד יותר להתוות גרף פיזור וקו רגרסיה עם ערכי m ו- c ששימשו C להשגת הבדלי התוכן תאית בין שני קווי הניסוי.לסיכום, שתי הדגימות מראות הבדלים בתאית. תודה שצפית.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

שיטה מהירה ויעילה להערכת פתוגניות של מיאדי אוסטילגו על קווי תירס וטוסינטה

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-צמח, סטרילי מיקרוקוסמוס לNodulation וצמיחה של צמח הקטניות<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; עם סימביונט Rhizobial<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

המקדים של ביומסה Lignocellulosic עם נוזלים יוניים בעלות נמוכה

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

אמוניה הרחבת סיבים (AFEX) טרום טיפול של ליגנותאית ביומסה

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

שיטה לניתוח Pentosan נוכח יוטה ביומסה והמרה שלה לתוך מונומרים סוכר באמצעות נוזל חומצי יוניים

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

הבדיקה זיהום צמח: ריסוס, בתיווך הפצע חיסון עם הפתוגן של צמח Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

לכימות הצמח חלבון מסיס והתוכן לעיכול פחמימות, באמצעות תירס (זיה מייז) כמו שיוצרו

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

בתיווך לולאה Assay איזותרמי הגברה (מנורה), עבור זיהוי מהיר של כנימת עש הטבק

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, אוגר נתונים קוד פתוח בעלות נמוכה כדי להעריך את תכולת המים Nonvascular Cryptogams

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

הכנה לדוגמה שיטת סריקה ומיקרוסקופ אלקטרון שידור לתוספות של החיפושית המשעממת

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...