Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Ringraziamo il Dipartimento di Plant & Soil Science and Cotton Inc.

1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Macinare materiale vegetale essiccato in una polvere fine.</li>
	<li>Tampone di solubilizzazione proteica (PSB): Preparare soluzioni stock di 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M etilendiamminatetraacetico acido (EDTA) (pH 8.0) e autoclave. Creare tampone psb fresco da queste soluzioni stock con concentrazioni finali di Tris da 50 mM, EDTA da 0,5 mM e solfato di dodecil di sodio al 10% (SDS) in acqua sterile.</li>
	<li>Preparare 100 mL di etanolo al 70% (v/v): 70 mL di etanolo al 100% e 30 mL d...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Le fibre di cotone sono fibre naturali prodotte dal semi di cotone. La fibra di cotone è una singola cella con ~95% di contenuto di cellulosa2 con alto contenuto cristallino di cellulosa con ampie applicazioni nell'industriatessile 31. Poiché, la fibra di cotone contiene ~ 95% di cellulosa, abbiamo usato tessuti di radice di cotone per la dimostrazione della stima del contenuto cristallino di cellulosa. I tessuti di radice di cotone sono moderatamente ricchi di contenuto ...

La cellulosa è la componente portante primaria delle pareti cellulari, presente sia nelle pareti cellulari primarie che secondarie. La parete cellulare è una matrice extracellulare che circonda le cellule vegetali ed è composta principalmente da proteine di cellulosa, lignina, emicellulosa, pectina e matrice. Circa un terzo della biomassa vegetale è la cellulosa1 e svolge ruoli significativi nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La fibra di cotone contiene il 95% di contenuto di cellulosa2, mentre gli alberi contengono dal 40% al 50% di cellulosa a seconda delle specie vegetali e dei tipidi organo 3. La cellulosa è composta da unità ripetute di cellobiosio, un disaccaride di residui di glucosio collegato da β-1,4 legami glicosidici4. L'etanolo cellulosico è prodotto dal glucosio derivato dalla cellulosa presente nelle pareti cellulari delle piante5. La fibra cellulosica è composta da diverse micro fibrille in cui ogni micro fibrillazione funge da nucleo con monomeri di glucosio 500-150001,6. L'omopolimero della cellulosa è sintetizzato da complessi di cellulosa sintasi incorporati nella membrana plasmatica (CSC)1,7. Le singole proteine della cellulosa sintasi A (CESA) sintetizzano catene di glucano e le catene glucane adiacenti sono collegate da legami idrogeno per formare cellulosa cristallina1,8. La cellulosa esiste in diverse forme cristalline con due forme predominanti, la cellulosa Iα e la cellulosa Iβ come forme native9. Nelle piante superiori, la cellulosa esiste in forma di cellulosa Iβ mentre la cellulosa vegetale inferiore esiste nella forma Iα10,11. Nel complesso, la cellulosa svolge un ruolo significativo nell'impartire forza e rigidità alle pareti delle cellule vegetali.
I biocarburanti di prima generazione sono prodotti principalmente da amido di mais, zuccheri di canna e zuccheri di barbabietola, che sono fonti alimentari, mentre i biocarburanti di seconda generazione si concentrano sulla produzione di biocarburanti da materiale da parete a biomassa vegetale nonalimentare 12. Una stima accurata del contenuto cristallino di cellulosa è importante non solo per la ricerca fondamentale sulla biosintesi della cellulosa e sulla dinamica delle pareti cellulari, ma anche per la ricerca applicata sui biocarburanti e sui bio prodotti. Vari metodi sono stati sviluppati e ottimizzati per la stima della cellulosa nella biomassa vegetale, e il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Il primo metodo riportato per la stima della cellulosa fu quello di Cross e Bevan nel 190813. Il metodo si basava sul principio della clorazione alternativa e dell'estrazione mediante solfato di sodio. Tuttavia, la cellulosa ottenuta con i protocolli originali e modificati del metodo Cross e Bevan ha mostrato la contaminazione di piccole frazioni di lignina oltre a una notevole quantità di xili e mannani14. Nonostante diverse modifiche per rimuovere la lignina e le emicellulosi dalla frazione di cellulosa, il metodo Cross-Bevan mantenne una notevole quantità di mannani insieme alla cellulosa. Successivamente, il metodo di Kurschner fu sviluppato impiegando acido nitrico ed etanolo per estrarre la cellulosa15. Questo metodo affermava che la lignina totale e il 75% dei pentosani erano stati rimossi, ma i veri risultati della cellulosa erano gli stessi stimati con il metodo di clorazione di Cross e Bevan. Un altro metodo (Norman e Jenkins) è stato sviluppato impiegando metanolo-benzene, solfato di sodio e ipoclorito di sodio per estrarre la cellulosa16. Questo metodo ha anche mantenuto una frazione di lignina (3%) e quantità significative di pentosani che portano a una stima accurata della cellulosa. Più tardi, Kiesel e Semiganowsky usarono un diverso approccio alla cellulosa idrolizzata usando l'80% di acido solforico concentrato, e gli zuccheri ridotti idrolizzati furono stimati con il metodo17 diBertrand. I due metodi, Waksman's e Stevens18 e Salo14,19 chesono stati sviluppati sulla base del metodo di Kiesel e Semiganowsky, hanno anche prodotto il 4-5% in meno di contenuto di cellulosa rispetto ai metodiprecedenti 20.
Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. Questo metodo è stato descritto per la prima volta da Updegraff per la misurazione della cellulosa nel 196921. Il metodo Updegraff integra il metodo Kurschner (uso di acido nitrico), i metodi Kiesel e Seminowsky (idrolisi della cellulosa nei monomeri di glucosio usando acido solforico) con alcune modifiche, e il saggio di antronrone di Viles e Silverman per una semplice stima colorimetrica del contenuto di glucosio e cellulosa cristallina22. Il principio di questo metodo è l'uso di acido acetico e acido nitrico (reagente di Updegraff) per eliminare l'emicellulosa e la lignina dai tessuti vegetali omogeneizzati, che lascia cellulosa acetica / nitrica resistente all'acido per un'ulteriorelavorazione e stima 15. La cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene trattata con il 67% di acido solforico per rompere la cellulosa in monomeri di glucosio e i monomeri di glucosio rilasciati sono stimati per test di antronrone21,23. Diverse modifiche del metodo Updegraff originale sono state utilizzate per semplificare la procedura e la stima della cellulosa mediante test di antronrone24. In generale, questo metodo può essere suddiviso in cinque fasi. Nella prima fase, viene preparato il materiale vegetale. Nella seconda fase, la parete cellulare grezza è separata dalla biomassa totale, poiché la cellulosa è il componente chiave delle pareti cellulari delle piante. Più tardi, nella terza fase, la cellulosa viene separata dai componenti della parete cellulare non cellulosica trattando con reagente di Updegraff. Nella quarta fase, la cellulosa acetica/nitrica resistente all'acido viene suddivisa in monomeri di glucosio mediante trattamento con acido solforico. Il trattamento con acido solforico della cellulosa si traduce nella formazione di composti 5-idrossimetilfurfurali dalla reazione dei monomeri di glucosio con acido solforico. Infine, nell'ultima fase, l'antronrone genera un complesso blu verdastro bollendo con il composto furfurale generato nella faseprecedente 25. Questo metodo colorimetrico basato sull'antronrone fu usato per la prima volta nel 1942 da Dreywood. L'antronrone è un colorante che identifica composti furfurali di pentosio ed esosio disidratati come 5-idrossimetilfurfurolo, in condizioni acide. La reazione con esosio produce un colore intenso e una migliore risposta rispetto alle pentosi25. La quantità di glucosio legato viene misurata dall'assorbanza dello spettrofotometro a 620 nm e l'intensità del complesso blu verdastro è direttamente proporzionale alla quantità di zucchero nel campione. I valori di assorbanza misurati sono stati confrontati con una linea di regressione della curva standard di glucosio per calcolare la concentrazione di glucosio del campione. Il contenuto misurato di glucosio è stato utilizzato per stimare il contenuto di cellulosa della biomassa vegetale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

La cellulosa è il polimero più abbondante sulla Terra generato dalla fotosintesi e la componente portante principale delle pareti cellulari. La parete cellulare svolge un ruolo significativo nella crescita e nello sviluppo delle piante fornendo forza, rigidità, velocità e direzione della crescita cellulare, mantenimento della forma cellulare e protezione dagli stressanti biotici e abiotici. La parete cellulare è composta principalmente da cellulosa, lignina, emicellulosa e pectina. Recentemente le pareti cellulari delle piante sono state prese di mira per la produzione di biocarburanti e bioenergia di seconda generazione. In particolare, il componente di cellulosa della parete cellulare vegetale viene utilizzato per la produzione di etanolo cellulosico. La stima del contenuto di cellulosa nella biomassa è fondamentale per la ricerca fondamentale e applicata sulle pareti cellulari. Il metodo Updegraff è semplice, robusto e il metodo più utilizzato per la stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale. La frazione della parete cellulare grezza insolubile alcool al momento del trattamento con reagente di Updegraff elimina le frazioni di emicellulosa e lignina. Successivamente, la frazione di cellulosa resistente al reagente updegraff viene sottoposta a trattamento con acido solforico per idrolizzare l'omopolimero di cellulosa in unità di glucosio monomerico. Una linea di regressione viene sviluppata utilizzando varie concentrazioni di glucosio e utilizzata per stimare la quantità di glucosio rilasciato sull'idrolisi della cellulosa nei campioni sperimentali. Infine, il contenuto di cellulosa è stimato in base alla quantità di monomeri di glucosio per saggio di antronrone colorimetrico.

Per questo studio sono state selezionate piante di cotone coltivate nella casa verde. Per l'analisi comparativa del contenuto di cellulosa sono state selezionate due diverse linee sperimentali di cotone. Per ogni linea sperimentale, il tessuto radicale è stato raccolto da tre repliche biologiche. Un totale di 500 mg di tessuto è stato omogeneizzato e 20 mg di esso è stato utilizzato per l'estrazione di pareti cellulari grezze. Successivamente, 5 mg di estratto grezzo di parete cellulare sono stati utilizzati per il tr...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Il metodo Updegraff è il metodo più utilizzato per la stima della cellulosa. Lo scopo principale di questa dimostrazione è quello di fornire un protocollo Updegraff dettagliato per la stima del contenuto di cellulosa nei campioni di biomassa vegetale.

Stima del contenuto cristallino di cellulosa della biomassa vegetale utilizzando il metodo Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Qui, dimostriamo il metodo Updegraff, il metodo più utilizzato al mondo per la stima del contenuto cristallino di cellulosa. La cellulosa è fondamentalmente composta da monomeri di glucosio collegati da beta-1, 4 legami glicosidici. Abbiamo diviso questo protocollo in cinque fasi.Nella prima fase, prepariamo il materiale della biomassa vegetale. Nella seconda fase estraiamo la parete cellulare grezza. Nella terza fase, utilizziamo il trattamento Updegraff in cui Updegraff è composto da acido acetico e acido nitrico che aiuta nella rimozione di emicellulosa e lignina dai nostri campioni.Nella quarta fase, lo sottoscrivamo all'idrolisi acida con l'aiuto di acido solforico che produce i monomeri di glucosio. Infine, nella quinta fase, usiamo il saggio dell'antronrone per stimare il contenuto cristallino di cellulosa. Raccogliere il materiale vegetale dalla serra, lavarlo accuratamente con acqua, asciugare all'aria per due giorni, separare il tessuto e trasferire il tessuto nei contenitori etichettati individualmente e incubare nell'incubatrice a 49 gradi centigradi per 10 giorni.Quindi, infine, tagliare a pezzi usando forbici o lama. Congelare il tessuto e caricarlo in malta e pestello per la macinazione fine in polvere uniforme o, in alternativa, utilizzare Freezer / Mill. Qui dimostriamo di utilizzare Freezer / Mill, quindi carichiamo i nostri campioni di tessuto in queste fiale di rettifica e li posizionare nel congelatore / mulino ed eseguiamo la velocità di 10 CP per tre cicli.La polvere di tessuto viene raccolta nel tubo Falcon come mostrato qui. Pesare 20 mg di polvere di tessuto e trasferirlo in un tubo pre-pesato da due ml. Aggiungere un mL di tampone di solubilizzazione proteica per rimuovere le proteine. vortice.Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante. Ripetere questo passaggio altre due volte.Aggiungere un mL di acqua sterile al pellet trattenuto. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ripetere questo passaggio altre due volte.Aggiungere una ML di 70% di etanolo al pellet trattenuto. vortice. Trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 70 gradi con scuotimento simultaneo per un'ora. Dopo un'ora di incubazione, centrifugare a 15.000 giri/min per cinque minuti.Ripetere questo passaggio ancora una volta. Al pellet salvato aggiungere un mL di metile al 100%. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti.Aggiungere un mL di metanolo cloroformio. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un mL di acetone. vortice.Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Ri-scartare il supernatante e asciugarlo all'aria a 37 gradi centigradi durante la notte o continuare con l'essiccazione sottovuoto.Caricare i campioni nell'essiccatore sottovuoto e asciugare all'aria per due o tre ore o fino a quando il pellet non è completamente asciutto. Pesare cinque mg dell'estratto della parete cellulare ottenuto dal passaggio precedente. Trasferire in un tubo a vite da due ml.Includere anche il controllo positivo a questo punto. Usa due mg di carta filtrante Whatman per questo scopo. Trasferimento su un tubo a vite da due ml.Aggiungere 1,5 mL di reagente Updegraff a ogni estratto di parete cellulare pesato. Vortice e incubare a 100 gradi centigradi in un blocco preriscaldato per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, trasferire su un rack.Lasciare raffreddare in panchina per 10 minuti. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.Aggiungere un mL di acqua sterile. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per 10 minuti. Scartare 500 microlitri del supernatante.Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare un mL del supernatante.Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scarta completamente il supernatante.Aggiungere un mL di acetone. vortice. Centrifuga a 15.000 giri/min per cinque minuti. Scartare il supernatante.Asciugare a 37 gradi centigradi durante la notte. Dopo un'incubazione di una notte, trasferire su un rack. Aggiungere un mL di acido solforico al 67%. vortice.Incubare a 25 gradi centigradi per un'ora con scuotimenti simultanei. Dopo un'ora di incubazione, assicurarsi che il pellet sia completamente sciolto. Trasferimento su un rack.Questa è la fase finale dell'estrazione della cellulosa. Ora i campioni sono pronti per la diluizione del campione. Per la diluizione del campione, utilizzare 10 microlitri di ciascun campione del passaggio precedente e aggiungere 490 microlitri di acqua sterile.Ripetere questa procedura per tutti i campioni sperimentali. Per la preparazione della curva standard del glucosio, preparare uno stock fresco di un mg per mL di glucosio e preparare zero microgrammi a 200 microgrammi di concentrazioni aggiungendo un mg per mL di glucosio in incrementi di 20 microliter e copportare il volume finale a un mL con acqua sterile. Prendere 500 microliter di ogni standard preparato in un tubo a vite e aggiungere un mL 0,2% di antronrone.E ora i campioni sono pronti per il test dell'antronrone. Aggiungere un mL di antronrone appena preparato. Mescolare immediatamente con vortice e trasferimento sul ghiaccio.Ripetere per tutti gli standard e campioni allo stesso modo. Quindi trasferire in un blocco centigrado preriscaldato di 100 gradi per 10 minuti. Dopo 10 minuti di incubazione, trasferire sul ghiaccio e incubare per cinque minuti sul ghiaccio.Dopo l'incubazione, assumere 200 microlitri di ogni campione in tre repliche. Ripetere per entrambi gli standard e campioni allo stesso modo. E una piastra carica da 96 po' è stata caricata in un rilevatore multimodale.Utilizzando il programma Smart Max Pro, abbiamo impostato l'impostazione del filtro su 620 nanometri. Tipo di piastra a tipo 96-well. Selezionare tutta l'area di lettura.Fare clic su OK. leggere. Leggi il piatto. Si ottengono le letture di assorbanza di standard e campioni, che verranno raccolte nella scheda excel per ulteriori analisi e stime del contenuto di cellulosa.La curva standard del glucosio viene preparata utilizzando le concentrazioni di glucosio in microgrammi per mL sull'asse x e i valori di assorbanza normalizzati della rispettiva concentrazione a 620 nanometri sull'asse y. Otteniamo la linea di regressione con valori m e c nel grafico a dispersione tracciato che usiamo per stimare il contenuto di cellulosa cristallina del campione. Nel primo passo, abbiamo fatto una media dei valori di OD a 620 nanometri.E poi abbiamo normalizzato i dati sottraendo il valore vuoto. Calcoliamo la concentrazione di glucosio usando la formula x è uguale a OD meno c/m dove colleghiamo i valori c e m dal passo precedente della linea di regressione nella curva standard. Poiché il volume totale utilizzato per il test dell'antronrone è di 500 microlitri, lo dividiamo per fattore di diluizione due.Poiché il volume del campione utilizzato era di soli 10 microlitri, divideremo ulteriormente per 10 per ottenere microgrammi per concentrazione di microlitri di glucosio che è uguale a mg per concentrazione di mL. E poi abbiamo usato il fattore di umidità 1.11 che è il guadagno di umidità nel processo. E infine, calcoliamo il contenuto di cellulosa cristallina percentuale dividendolo con il peso della parete cellulare, che è vicino a cinque mg, e moltiplichiamo per 100 per ottenere la percentuale.Poi abbiamo mediato il contenuto cristallino di cellulosa di tre repliche biologiche per ottenere il valore per i singoli campioni, che verrà confrontato con un'altra media di linea sperimentale di tre repliche biologiche. E il test t può essere usato per testare il loro livello di significatività. Qui nella tabella A, mostriamo i valori della tabella della concentrazione e del rispettivo OD a 620 nanometri, che è stato ulteriormente utilizzato per tracciare un grafico a dispersione e una linea di regressione con i valori m e c che sono stati utilizzati in C per ottenere le differenze di contenuto di cellulosa tra le due linee sperimentali.In conclusione, entrambi i campioni mostrano differenze di cellulosa. Grazie per l'attenzione.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Ricerca

Ambiente

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Singola pianta, sterili Microcosmi per nodulazione e crescita della pianta delle leguminose<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Con il rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

Il pretrattamento di lignocellulosica biomassa con basso costo Liquidi Ionici

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Impenitta di espansione della fibra di Ammonia (AFEX) di biomassa lignocellulosica

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Un nuovo metodo per l'analisi di pentosano presente nella biomassa di iuta e la relativa conversione in monomeri di zucchero utilizzando acido liquido ionico

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

La prova di infezione di pianta: Spray e ferita-mediata di inoculazione con la pianta patogeno Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Quantificare la pianta proteina solubile e digeribile carboidrati contenuti, utilizzando mais (Zea mays) As an Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, un Datalogger di Open-source di basso costo per stimare il contenuto di acqua delle crittogame non vascolari

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Esempio di metodo di preparazione del microscopio elettronico di scansione e trasmissione per le appendici di Woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...