Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
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이 연구의 부분적인 지원에 대해 식물및 토양 과학 및 면학과에 감사드립니다.

1. 실험 준비
<ol><li>말린 식물 재료를 미세 한 분말로 갈아 넣습니다.</li>
	<li>단백질 용해화 버퍼 (PSB): 1 M 트리 (pH 8.8), 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (pH 8.0)의 스톡 솔루션을 준비하고 오토클레이브. 멸균 물에 50mM Tris, 0.5mM EDTA 및 10% 나트륨 도데실 황산염(SDS)의 최종 농도로 이러한 스톡 솔루션에서 신선한 PSB 버퍼를 만듭니다.</li>
	<li>70% 에탄올(v/v)의 100mL준비: 100% 에탄올 70mL, 멸균수 30mL...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

면 섬유는 면씨에서 생산 된 천연 섬유입니다. 면섬유는 섬유 산업에서 광범위한 응용 분야와 높은 결정 셀룰로오스 함량을 가진 ~ 95 % 셀룰로오스 함량2를 가진 단일 셀입니다31. 면 섬유에는 ~95% 셀룰로오스가 함유되어 있으므로, 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 시연하기 위해 면 뿌리 조직을 사용했습니다. 면 뿌리 조직은 결정성 셀룰로오스 함량이 적당히 ...

셀룰로오스는 1차 세포벽과 이차 세포벽 모두에 존재하는 세포벽의 1차 하중 베어링 성분입니다. 세포벽은 식물 세포를 포위하는 세포외 매트릭스이며 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스, 펙틴 및 매트릭스 단백질로 구성됩니다. 식물 바이오매스의 약 1/3은 셀룰로오스1이며, 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 바이오틱 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장과 개발에 중요한 역할을 합니다. 면 섬유는 95% 셀룰로오스2 함량을 포함하고 있으며, 나무는 식물 종 및 장기 유형에 따라 셀룰로오스의 40 %에서 50 %를 함유하고있습니다3. 셀룰로오스는 β-1,4 글리코시딕 본드4에의해 연결된 포도당 잔류물의 불협화기인 셀로바이오제의 반복 단위로 구성된다. 셀룰로오스 에탄올은 식물 세포벽5에존재하는 셀룰로오스로부터 유래된 포도당으로부터 생산된다. 셀룰로오스 섬유는 각 마이크로 피브릴이 500-15000 포도당 단량제1,6을가진 코어 단위로 작용하는 몇몇 마이크로 피브릴로 구성됩니다. 셀룰로오스 모합합체는 플라즈마 멤브레인 임베디드 셀룰로오스 신타스 복합체(CSC)1,7에의해 합성된다. 개별 셀룰로오스 신타제 A(CESA) 단백질은 글루칸 사슬을 합성하고 인접한 글루칸 사슬은 수소 결합에 의해 연결되어 결정성 셀룰로오스1,8을형성한다. 셀룰로오스는 2개의 우세한 형태, 셀룰로오스 Iα 및 셀룰로오스 Iβ를 네이티브 형태9로여러 결정 형태로 존재한다. 더 높은 식물에서 셀룰로오스는 셀룰로오스 Iβ 형태로 존재하며, 낮은 식물 셀룰로오스는 Iα 형태10,11에존재한다. 전반적으로, 셀룰로오스는 식물 세포벽에 강도와 강성을 부여하는 데 중요한 역할을한다.
1세대 바이오 연료는 주로 옥수수 전분, 지팡이 설탕 및 사탕무 설탕에서 생산되며, 2세대 바이오 연료는 비식품 식물바이오매스 세포벽재료(12)의바이오 연료 생산에 주력하고 있다. 결정성 셀룰로오스 함량의 정확한 추정은 셀룰로오스 생합성 및 세포벽 역학에 대한 근본적인 연구뿐만 아니라 적용 된 바이오 연료 및 바이오 제품 연구에도 중요합니다. 식물 바이오매스의 셀룰로오스 추정에 최적화된 다양한 방법이 개발되고 최적화되어 있으며, Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 셀룰로오스 추정을 위한 첫번째 보고된 방법은 1908년13년에십자가와 베반에 의해 이었습니다. 이 방법은 황산나트륨에 의한 대체 염소화 및 추출 원리에 기초하였다. 그러나, 원래의 변형된 프로토콜뿐만 아니라 크로스 및 베반 방법의 변형된 프로토콜에 의해 얻어진 셀룰로오스는 상당한 양의 자일란과만난(14)에더하여 리그닌의 작은 분수의 오염을 보였다. 셀룰로오스 분획에서 리그닌과 헤미셀룰로스를 제거하기 위한 몇 가지 수정에도 불구하고, 크로스 베반 방법은 셀룰로오스와 함께 상당한 양의 만란을 유지했습니다. 나중에, 쿠르슈너의 방법은 셀룰로오스(15)를추출하기 위해 질산과 에탄올을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 총 리그닌과 펜토산의 75%가 제거되었지만 진정한 셀룰로오스 결과는 크로스와 베반의 염소화 방법에 의해 추정된 것과 동일하다고 명시하였다. 또 다른 방법(Norman 및 Jenkins)은셀룰로오스(16)를추출하기 위해 메탄올 벤젠, 황산나트륨 및 하이포염소산나트륨을 사용하여 개발되었다. 이 방법은 또한 리그닌의 일부 일부를 유지 (3%) 그리고 셀룰로오스의 정확한 추정으로 이어지는 펜토산의 상당한 금액. 나중에, 키젤과 Semiganowsky는 80% 농축 황산을 사용하여 셀룰로오스에 다른 접근 법을 사용했으며, 가수 분해 감소 된 설탕은 버트 랜드의 방법에 의해 추정되었다17. 두 가지 방법, 왁스맨스와 스티븐스18 과 살로14,19 키셀과 세미 가노우스키의 방법에 따라 개발 된, 또한 이전 방법에 비해 4-5 % 적은 셀룰로오스 함량을 산출20.
Updegraff 방법은 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 방법은 1969년21년셀룰로오스의 측정을 위해 Updegraff에 의해 처음 기술되었다. Updegraff 방법은 쿠르슈너 방법 (질산 사용), 키셀 및 세미노프스키 방법 (황산을 사용하여 포도당 모노머로 셀룰로오스의 가수 분해)를 통합하고, 포도당 및 결정 셀룰로오스 함량22의간단한 색소 추정을위한 빌스와 실버맨의 반위 분석법을 통합합니다. 이 방법의 원리는 아세트산과 질산(Updegraff 시약)을 사용하여 균질화된 식물 조직에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 것으로, 아세트/질산 내성 셀룰로오스를 더 처리 및 추정을 위한 세포산내성 셀룰로오스를잎입니다(15) 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 셀룰로오스를 포도당 단량체로 분해하기 위해 67%의 황산으로 처리되며, 방출된 포도당 단량제는 안계학적 분석21,23에의해 추정된다. 원래 Updegraff 방법의 몇 가지 수정은 anthrone분석서 (24)에의해 절차 및 셀룰로오스 추정을 단순화하는 데 사용되었다. 광범위하게 이 메서드는 5단계로 나눌 수 있습니다. 1단계에서는 식물 재료가 제조됩니다. 제2상에서, 조세포벽은 식물 세포벽의 핵심 성분이기 때문에 총 바이오매스로부터 분리된다. 나중에, 제 3 단계에서, 셀룰로오스는 Updegraff 시약으로 처리하여 비 셀룰로오스 세포벽 성분으로부터 분리된다. 네 번째 단계에서, 아세트/질산 내성 셀룰로오스는 황산 치료에 의해 포도당 단량체로 분해된다. 셀룰로오스의 황산 치료는 황산을 가진 포도당 단량제의 반응에서 5-하이드록시메틸푸르랄 화합물의 형성을 초래한다. 마지막으로, 마지막 단계에서, 왕좌는 이전 단계25에서생성된 모피 화합물로 끓여 서 녹색 의 푸른 복합체를 생성한다. 이 왕좌 기반 색법 방법은 드레이우드에 의해 1942 년에 처음 사용되었습니다. Anthrone는 산성 조건하에서 5-하이드록시메틸푸르랄과 같은 펜토스 및 헥소스 탈수 제품의 furfural 화합물을 식별하는 염료입니다. 헥소스를 가진 반응은 펜토스25에비해 강렬한 색상과 더 나은 반응을 생성합니다. 결합된 포도당의 양은 620nm에서 분광계 흡광도에 의해 측정되고 녹색 파란색 복합체의 강도는 시료의 설탕 양에 직접적으로 비례한다. 측정된 흡광도 값은 샘플의 포도당 농도를 계산하기 위해 포도당 표준 곡선 회귀 라인과 비교하였다. 측정된 포도당 함량은 식물 바이오매스의 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 사용되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

셀룰로오스는 광합성및 세포벽의 주요 하중 베어링 성분에 의해 생성되는 지구상에서 가장 풍부한 폴리머이다. 세포벽은 세포 성장의 강도, 강성, 속도 및 방향, 세포 모양 유지 보수 및 생체 및 무생물 스트레스요인으로부터의 보호를 제공함으로써 식물 성장 및 개발에 중요한 역할을 합니다. 세포벽은 주로 셀룰로오스, 리그닌, 헤미셀룰로오스 및 펙틴으로 구성됩니다. 최근 식물 세포벽은 2세대 바이오 연료 및 바이오 에너지 생산을 목표로 하고 있습니다. 구체적으로, 식물 세포벽의 셀룰로오스 성분은 셀룰로오스 에탄올의 생산에 사용된다. 바이오매스의 셀룰로오스 함량의 추정은 기본 및 적용 된 세포 벽 연구에 매우 중요합니다. Updegraff 방법은 간단하고 견고하며 식물 바이오매스의 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 가장 널리 사용되는 방법입니다. Updegraff 시약으로 치료시 알코올 불용성 조세포 벽 분획은 헤미셀룰로오스와 리그닌 분획을 제거합니다. 나중에, Updegraff 시약 저항하는 셀룰로오스 분획은 단황 포도당 단위로 셀룰로오스 균합고를 가수분해하기 위하여 황산 처리를 실시한다. 회귀 라인은 포도당의 다양한 농도를 사용하여 개발되고 실험 샘플에서 셀룰로오스 가수 분해시 방출되는 포도당의 양을 추정하는 데 사용된다. 마지막으로, 셀룰로오스 함량은 색칠성 앙위 분석에 의한 포도당 단량의 양을 기준으로 추정된다.

녹색 집에서 자란 면화 식물은이 연구를 위해 선택되었다. 두 개의 상이한 실험 용 회선은 셀룰로오스 함량의 비교 분석을 위해 선택되었다. 각 실험 라인에 대해, 루트 조직은 세 가지 생물학적 복제로부터 수집되었다. 총 500 mg의 조직이 균질화되었고 20 mg의 조세포 벽 추출에 사용되었습니다. 나중에, 5 mg의 조세포벽 추출물은 셀룰로오스로부터 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하기 위해 Updegraff...

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Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Updegraff 방법은 셀룰로오스 추정에 가장 널리 사용되는 방법입니다. 이 데모의 주요 목적은 식물 바이오매스 샘플에서 셀룰로오스 함량을 추정하기 위한 상세한 Updegraff 프로토콜을 제공하는 것입니다.

Updegraff 방법을 사용하여 식물 바이오매스의 크리스탈 셀룰로오스 함량 추정

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

여기서는 결정성 셀룰로오스 함량의 추정을 위해 세계에서 가장 널리 사용되는 방법인 Updegraff 방법을 시연합니다. 셀룰로오스는 기본적으로 베타-1, 4 글리코시딕 결합에 의해 연결된 포도당 단량으로 구성됩니다. 이 프로토콜을 5단계로 나누었습니다.1단계에서는 식물 바이오매스 물질을 준비합니다. 두 번째 단계에서는 조세포벽을 추출합니다. 3단계에서는 Updegraff가 아세트산과 질산으로 구성된 Updegraff 치료를 사용하여 샘플에서 헤미셀룰로오스와 리그닌을 제거하는 데 도움을 줍니다.네 번째 단계에서는 포도당 단량체를 생산하는 황산의 도움으로 산 성 가수 분해를 받습니다. 마지막으로, 다섯 번째 단계에서는 결정성 셀룰로오스 함량을 추정하기 위해 왕좌의 분석방법을 사용합니다. 온실에서 식물 재료를 수집하고, 물로 철저히 씻고, 2 일 동안 공기 건조하고, 조직을 분리하고 개별적으로 표시된 용기로 조직을 옮기고 10 일 동안 49도 Centigrade에서 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.그런 다음 마지막으로 가위 나 블레이드를 사용하여 조각으로 자른다. 조직을 동결하고 박격포에 적재하고 균일 한 분말로 미세 분쇄하거나 냉동고 / 밀을 사용하십시오. 여기에서는 냉동고/밀을 사용하여 티슈 샘플을 이 연삭 유리병에 적재하고 냉동고/밀에 넣고 3사이클동안 10CP 속도를 실행합니다.조직 분말은 여기에 표시된 대로 팔콘 튜브에서 수집됩니다. 20 mg의 티슈 파우더를 계량하고 미리 계량된 2mL 튜브로 전달합니다. 단백질 용해성 버퍼 1mL를 추가하여 단백질을 제거합니다. 소용돌이.원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.유지된 펠릿에 멸균 수1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.유지 된 펠릿에 70 %의 에탄올 1 ML을 추가합니다. 소용돌이. 예열된 70도 섭씨 블록으로 1시간 동안 동시 흔들림이 있는 블록으로 옮겨보겠습니다. 1시간 배양 후 원심분리기는 15, 000 RPM에서 5분간.이 단계를 한 번 더 반복합니다. 저장된 펠릿에 100% 메틸론1mL을 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분.클로로폼 메탄올 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 버리고 아세톤의 1mL를 추가합니다. 소용돌이.실온에서 5분간 배양하세요. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체를 다시 버리고 공기는 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하거나 진공 건조로 계속하십시오.샘플을 진공 건조기와 2~3시간 동안 또는 펠릿이 완전히 건조할 때까지 공기 건조에 실어 줍니다. 이전 단계에서 얻은 세포벽 추출물의 5 mg의 무게를 측정한다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.또한이 시점에서 긍정적 인 제어를 포함한다. 그 목적을 위해 Whatman 필터 용지의 두 mg을 사용합니다. 두 mL 나사 캡 튜브로 전송합니다.각 계량 세포벽 추출물에 Updegraff 시약 1.5mL를 추가합니다. 소용돌이와 30 분 동안 예열 된 블록에서 섭씨 100도에서 배양. 30분 간 인큐베이션 후 랙으로 옮김합니다.벤치에서 10분 동안 식힙니다. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.멸균 물 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 15, 000 RPM에서 10분 동안 원심분리기. 상수의 500 마이크로 리터를 폐기하십시오.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상체의 1mL를 폐기합니다.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상신을 완전히 버리십시오.아세톤 1mL를 추가합니다. 소용돌이. 원심분리기 15, 000 RPM5분. 상부체를 폐기합니다.하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 건조하십시오. 하룻밤 잠복 후 랙으로 옮김하십시오. 67%의 황산 1mL를 추가합니다. 소용돌이.동시 흔들림으로 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다. 1시간 동안 잠복한 후 펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 랙으로 옮기.이것은 셀룰로오스 추출의 마지막 단계입니다. 이제 샘플이 샘플 희석을 할 준비가 되었습니다. 시료 희석의 경우 이전 단계에서 각 샘플의 10 마이크로리터를 사용하고 멸균 수490 마이크로리터를 추가하십시오.모든 실험 샘플에 대해 이 것을 반복합니다. 포도당 표준 곡선 준비를 위해, mL 포도당 1 mg의 신선한 육수를 준비하고 20 마이크로 리터 단위로 mL 포도당 1 mg을 추가하여 20 마이크로 그램 농도에 0 마이크로 그램을 준비하고 멸균 물로 1 mL에 최종 볼륨을 구성합니다. 스크류 캡 튜브에 각 준비된 표준의 500 마이크로리터를 가지고 1 mL 0.2%의 왕좌를 추가하십시오.그리고 이제 샘플은 왕좌 분석에 대한 준비가되어 있습니다. 갓 준비된 왕좌 1mL을 추가합니다. 소용돌이를 통해 즉시 섞어서 얼음으로 옮으세요.동일한 방식으로 모든 표준 및 샘플을 반복합니다. 그런 다음 10 분 동안 예열 된 100도 섭씨 블록으로 옮겨. 10분 간 인큐베이션을 한 후 얼음으로 옮기고 얼음 위를 5분간 배양합니다.인큐베이션 후 각 샘플의 200 마이크로리터를 3개의 복제로 섭취하십시오. 동일한 방식으로 표준과 샘플 모두에 대해 반복합니다. 그리고 로드 된 96 웰 플레이트멀티 모드 검출기에로드되었다.스마트 맥스 프로 프로그램을 사용하여 필터 설정을 620나노미터로 설정했습니다. 플레이트 타입을 96웰 타입으로. 모든 읽기 영역을 선택합니다.확인을 클릭합니다. 읽다. 접시를 읽습니다. 셀룰로오스 함량의 추가 분석 및 추정을 위해 Excel 시트에서 수집되는 표준 및 샘플 모두의 흡광도 판독값을 얻을 수 있습니다.포도당 표준 곡선은 x 축에 mL 당 마이크로그램의 포도당 농도를 사용하고 y축에서 620 나노미터에서 각각농도의 정규화된 흡광도 값을 이용하여 제조된다. 샘플 결정 셀룰로오스 함량을 추정하는 데 사용하는 플롯된 산란 그래프에서 m 및 c 값으로 회귀 선을 얻습니다. 첫 번째 단계에서는 OD 값을 평균 620 나노미터로 측정했습니다.그런 다음 빈 값을 빼서 데이터를 정규화했습니다. 우리는 표준 곡선에서 회귀 라인의 이전 단계에서 c 및 m 값을 연결하는 OD 마이너스 c/m과 동일한 수식 x를 사용하여 포도당 농도를 계산합니다. 왕좌 분석에 사용 된 총 볼륨은 500 마이크로 리터이기 때문에 희석 계수 2로 나눕니다.사용된 견본 부피는 단지 10 마이크로리터이기 때문에, 우리는 mL 농도 당 mg과 동일한 포도당의 마이크로 리터 농도 당 마이크로 그램을 얻기 위하여 10에 의해 더 분할할 것입니다. 그리고 그 과정에서 수분 이득인 수분계 1.11을 사용했습니다. 그리고 마지막으로, 우리는 5 mg에 가까운 세포벽 무게로 분할하여 백분율 결정 셀룰로오스 함량을 계산하고, 백분율을 얻기 위해 100으로 곱합니다.그런 다음 3개의 생물학적 복제의 결정성 셀룰로오스 함량을 평균화하여 개별 샘플에 대한 값을 얻었으며, 이는 3개의 생물학적 복제의 또 다른 실험 라인 평균과 비교될 것입니다. 그리고 t-테스트는 그들의 중요성의 수준을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 표 A에서, 우리는 620 나노미터에서 각각의 OD의 테이블 값을 나타내며, 이는 두 실험 라인 간의 셀룰로오스 함량 차이를 얻기 위해 C에서 사용된 m 및 c 값으로 산란 그래프 및 회귀 라인을 더 플롯하는 데 사용되었다.결론적으로, 두 샘플 모두 셀룰로오스 차이를 보여줍니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

Research

JoVE Journal

Environment

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연구

환경과학

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암모니아 섬유 확장 (AFEX) 리그노셀룰로오스 바이오매스의 전처리

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