Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.

1. Eksperimentell forberedelse
<ol><li>Grind tørket plantemateriale i et fint pulver.</li>
	<li>Protein Solubilization Buffer (PSB): Klargjør lagerløsninger på 1 M Tris (pH 8,8), 0,5 M etylendimintetraketisk syre (EDTA) (pH 8,0) og autoklaver dem. Lag fersk PSB-buffer fra disse lagerløsningene med endelige konsentrasjoner på 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA og 10% natrium dodecylsulfat (SDS) i sterilt vann.</li>
	<li>Forbered 100 ml 70% etanol (v / v): 70 ml 100% etanol og 30 ml sterilt vann.</li>
	<li>Forbered 100 ml met...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Bomullsfibre er naturlige fibre produsert av bomullsseed. Bomullsfiber er en enkelt celle med ~ 95% celluloseinnhold2 med høyt krystallinsk celluloseinnhold med omfattende applikasjoner i tekstilindustrien31. Som, bomullsfiber inneholder ~ 95% cellulose, har vi brukt bomull rotvev for demonstrasjon av estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Bomullsrotvev er moderat rik på krystallinsk celluloseinnhold og representerer en vanlig tilgjengelig plantebiomasse. Mengden to...

Cellulose er den primære bærende komponenten av cellevegger, som finnes i både primære og sekundære cellevegger. Celleveggen er en ekstracellulær matrise som omgir planteceller og hovedsakelig består av cellulose, lignin, hemicellulose, pektin og matriseproteiner. Omtrent en tredjedel av plantene biomasse er cellulose1 og det spiller betydelige roller i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleform og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Bomullsfiber inneholder 95% cellulose2 innhold, mens trær inneholder 40% til 50% av cellulose avhengig av plantearter og organtyper3. Cellulosen består av gjentatte enheter av cellobiose, et disakkarid av glukoserester forbundet med β-1,4 glykosidiske bindinger4. Cellulosisk etanol produseres fra glukose avledet fra cellulosen som er tilstede i plantecelleveggene5. Cellulosisk fiber består av flere mikrofibriler der hver mikrofibril fungerer som kjerneenhet med 500-15000 glukosemonomerer1,6. Cellulose homopolymer syntetiseres av plasmamembran innebygde cellulosesyntasekomplekser (CSC)1,7. Individuelle cellulosesyntase A (CESA) proteiner syntetiserer glukankjeder og de tilstøtende glukankjedene er forbundet med hydrogenbindinger for å danne krystallinsk cellulose1,8. Cellulose finnes i flere krystallinske former med to dominerende former, cellulose Iα og cellulose Iβ som opprinnelige former9. I høyere planter finnes cellulose i cellulose Iβ-form mens lavere plantecellulose eksisterer i Iα form10,11. Totalt sett spiller cellulosen en betydelig rolle i å gi styrke og stivhet til plantecelleveggene.
Første generasjons biodrivstoff produseres hovedsakelig fra maisstivelse, sukkerrør og betesukker, som er matkilder, mens andre generasjons biodrivstoff fokuserer på biodrivstoffproduksjonen fra biomassemateriale fra ikke-matplantebiomassecelleveggmateriale12. Nøyaktig estimering av krystallinsk celluloseinnhold er ikke bare viktig for grunnleggende forskning på cellulosebiosyntese og celleveggdynamikk, men også for anvendt biodrivstoff- og bioproduktforskning. Ulike metoder er utviklet og optimalisert for estimering av cellulose i plantebiomassen, og Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Den første rapporterte metoden for celluloseestimering var av Cross og Bevan i 190813. Metoden var basert på prinsippet om alternativ klorering og ekstraksjon ved natriumsulfat. Cellulosen oppnådd av den opprinnelige så vel som modifiserte protokoller av Cross og Bevan-metoden viste imidlertid forurensning av små brøkdeler av lignin i tillegg til en betydelig mengde xylans og mannans14. Til tross for flere modifikasjoner for å fjerne lignin og hemicelluloses fra cellulosefraksjonen, beholdt Cross-Bevan-metoden en betydelig mengde mannans sammen med cellulose. Senere ble Kurschners metode utviklet ved å bruke salpetersyre og etanol for å trekke ut cellulose15. Denne metoden uttalte at total lignin og 75% av pentosanene ble fjernet, men de sanne celluloseresultatene var de samme som de som ble estimert ved kloreringsmetoden Cross og Bevan. En annen metode (Norman og Jenkins) ble utviklet ved å bruke metanol-benzen, natriumsulfat og natriumhypokloritt for å trekke ut cellulose16. Denne metoden beholdt også en brøkdel av lignin (3%) og betydelige mengder pentosaner som fører til nøyaktig estimering av cellulose. Senere brukte Kiesel og Semiganowsky en annen tilnærming til hydrolysert cellulose ved hjelp av 80% konsentrert svovelsyre, og de hydrolyserte reduserte sukkerene ble estimert av Bertrands metode17. De to metodene, Waksman's og Stevens18 og Salo14,19 som ble utviklet basert på Kiesel og Semiganowskys metode, ga også 4-5% mindre celluloseinnhold sammenlignet med tidligere metoder20.
Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Denne metoden ble først beskrevet av Updegraff for måling av cellulose i 196921. Updegraff-metoden integrerer Kurschner-metoden (bruk av salpetersyre), Kiesel- og Seminowsky-metoder (hydrolyse av cellulose i glukosemonomerer ved hjelp av svovelsyre) med noen modifikasjoner, og antronanalysen av Viles og Silverman for enkel kolorimetrisk estimering av glukose og krystallinsk celluloseinnhold22. Prinsippet for denne metoden er bruk av eddiksyre og salpetersyre (Updegraff reagens) for å eliminere hemicellulose og lignin fra det homogeniserte plantevevet, som etterlater eddiksyre / salpetersyreresistent cellulose for videre behandling og estimering15. Den eddiksyreresistente cellulosen behandles med 67% svovelsyre for å bryte cellulosen i glukosemonomerer, og de frigjorte glukosemonomerene er estimert av antronanalyse21,23. Flere modifikasjoner av den opprinnelige Updegraff-metoden ble brukt til å forenkle prosedyren og celluloseestimering ved antronanalyse24. Generelt kan denne metoden deles inn i fem faser. I den første fasen fremstilles plantematerialet. I den andre fasen er råcelleveggen skilt fra den totale biomassen, da cellulose er nøkkelkomponenten i plantecellevegger. Senere, i tredje fase, er cellulosen skilt fra de ikke-cellulosecelleveggkomponentene ved behandling med Updegraff-reagens. I fjerde fase brytes den eddiksyreresistente cellulosen inn i glukosemonomerer ved svovelsyrebehandling. Svovelsyrebehandling av cellulose resulterer i dannelse av 5-hydroksymetylfurfuralforbindelser fra reaksjonen av glukosemonomerer med svovelsyre. Til slutt, i den siste fasen, genererer anthronen et grønt blått kompleks ved å koke med furfuralforbindelsen generert i forrige fase25. Denne antronbaserte kolorimetriske metoden ble først brukt i 1942 av Dreywood. Anthron er et fargestoff som identifiserer furfuralforbindelser av pentose og heksose dehydrerte produkter som 5-hydroksymetylfurfural, under sure forhold. Reaksjon med heksose gir en intens farge og bedre respons sammenlignet med pentoser25. Mengden bundet glukose måles ved spektrofotometerabsorbering ved 620 nm og intensiteten av det grønne blå komplekset er direkte proporsjonal med mengden sukker i prøven. De målte absorbansverdiene ble sammenlignet med en glukosestandard regresjonslinje for å beregne glukosekonsentrasjonen av prøven. Det målte glukoseinnholdet ble brukt til å estimere celluloseinnholdet i plantebiomassen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

Cellulose er den mest tallrike polymeren på jorden generert av fotosyntese og den viktigste bærende komponenten av cellevegger. Celleveggen spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling ved å gi styrke, stivhet, hastighet og retning av cellevekst, vedlikehold av celleformer og beskyttelse mot biotiske og abiotiske stressfaktorer. Celleveggen består hovedsakelig av cellulose, lignin, hemicellulose og pektin. Nylig har plantecellevegger blitt målrettet for andre generasjons biodrivstoff- og bioenergiproduksjon. Spesielt brukes cellulosekomponenten til plantecelleveggen til produksjon av cellulosisk etanol. Estimering av celluloseinnhold i biomasse er avgjørende for grunnleggende og anvendt celleveggforskning. Updegraff-metoden er enkel, robust og den mest brukte metoden for estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse. Den alkoholløselige råcelleveggfraksjonen ved behandling med Updegraff-reagens eliminerer hemicellulose- og ligninfraksjonene. Senere blir Updegraff reagensresistent cellulosefraksjon utsatt for svovelsyrebehandling for å hydrolysere cellulose homopolymeren i monomeriske glukoseenheter. En regresjonslinje er utviklet ved hjelp av ulike konsentrasjoner av glukose og brukes til å estimere mengden glukose som frigjøres ved cellulosehydrolyse i eksperimentelle prøver. Til slutt er celluloseinnholdet estimert basert på mengden glukosemonomerer ved kolorimetrisk antronanalyse.

Bomullsplanter dyrket i det grønne huset ble valgt ut til denne studien. To forskjellige eksperimentelle linjer av bomull ble valgt for komparativ analyse av celluloseinnhold. For hver eksperimentell linje ble rotvevet samlet inn fra tre biologiske repliker. Totalt 500 mg vev ble homogenisert og 20 mg av det ble brukt til råcelleveggutvinning. Senere ble 5 mg råcellet veggekstrakt brukt til Updegraff reagensbehandling for å fjerne hemicellulose og lignin fra cellulose. Den rensede cellulosen ble hydrolysert ved svove...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Updegraff-metoden er den mest brukte metoden for celluloseestimering. Hovedformålet med denne demonstrasjonen er å gi en detaljert Updegraff-protokoll for estimering av celluloseinnhold i plantebiomasseprøver.

Estimering av krystallinsk celluloseinnhold av plantebiomasse ved hjelp av Updegraff-metoden

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Her demonstrerer vi Updegraff-metoden, verdens mest brukte metode for estimering av krystallinsk celluloseinnhold. Cellulose består i utgangspunktet av glukosemonomerer forbundet med beta-1, 4 glykosidiske bindinger. Vi delte denne protokollen i fem faser.I den første fasen forbereder vi plantebiomassematerialet. I den andre fasen trekker vi ut råcelleveggen. I den tredje fasen bruker vi Updegraff behandling der Updegraff består av eddiksyre og salpetersyre som hjelper til med fjerning av hemicellulose og lignin fra våre prøver.I fjerde fase utsetter vi det for syrehydrolyse ved hjelp av svovelsyre som produserer glukosemonomerer. Til slutt, i femte fase, bruker vi antronanalyse for å estimere det krystallinske celluloseinnholdet. Samle plantematerialet fra drivhuset, vask dem grundig med vann, lufttørk i to dager, skill vevet og overfør vevet til de individuelt merkede beholderne og inkuber i inkubatoren ved 49 grader Centigrade i 10 dager.Deretter til slutt, kutt i stykker ved hjelp av saks eller blad. Frys vevet og last inn i mørtel og pestle for fin sliping i ensartet pulver eller alternativt bruk Fryser / Mill. Her demonstrerer vi bruk av fryser / fres, så vi laster vevsprøvene våre inn i disse slipehettene og plasserer dem i fryseren / fresen og kjører 10 CP-hastigheten i tre sykluser.Vevspulveret samles i Falcon-røret som vist her. Vei 20 mg av vevspulveret og overfør til et forhåndsveid to mlrør. Tilsett en ml protein-solubiliseringsbuffer for å fjerne proteiner. virvel.Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast supernatanten. Gjenta dette trinnet to ganger til.Tilsett en ml sterilt vann til den beholdte pelletsen. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Gjenta dette trinnet to ganger til.Tilsett en ML på 70% etanol i den beholdte pelletsen. virvel. Overfør til en forvarmet 70 grader Centigrade blokk med samtidig risting i en time. Etter en times inkubasjon, sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter.Gjenta dette trinnet én gang til. Til den lagrede pellets, legg til en ml av 100% metylon. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter.Tilsett en ml kloroform metanol. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast supernatanten og tilsett en ml aceton. virvel.Inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast supernatanten og lufttørk dem på 37 grader Celsius over natten eller fortsett med vakuumtørking.Legg prøvene i vakuumtørkeren og lufttørk i to til tre timer eller til pelletsen er helt tørr. Vei fem mg av celleveggekstraktet hentet fra forrige trinn. Overfør til et to ml skruehettrør.Inkluder også positiv kontroll på dette tidspunktet. Bruk to mg Whatman-filterpapir til dette formålet. Overfør til et to ml skruehetterør.Tilsett 1,5 ml Updegraff-reagens i hvert veide celleveggekstrakt. Virvel og inkuber ved 100 grader Centigrade i en forvarmet blokk i 30 minutter. Etter 30 minutter inkubasjon, overfør til et stativ.La den avkjøles på benken i 10 minutter. Sentrifuge ved 15.000 RPM i 10 minutter. Kast supernatanten uten å forstyrre pelletsen.Tilsett en ml sterilt vann. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i 10 minutter. Kast 500 mikroliter av supernatanten.Tilsett en ml aceton. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast en ml av supernatanten.Tilsett en ml aceton. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast supernatanten helt.Tilsett en ml aceton. virvel. Sentrifuge ved 15.000 RPM i fem minutter. Kast supernatanten.Tørk ved 37 grader Centigrade over natten. Etter en en natt inkubasjon, overføring til et stativ. Tilsett en ml 67% svovelsyre. virvel.Inkuber ved 25 grader Centigrade i en time med samtidig risting. Etter en times inkubasjon må du sørge for at pelletsen er helt oppløst. Overfør til et stativ.Dette er det siste trinnet i celluloseutvinningen. Nå er prøvene klare for prøvefortynning. For prøvefortynning, bruk 10 mikroliter av hver prøve fra forrige trinn og tilsett 490 mikroliter sterilt vann.Gjenta dette for alle eksperimentelle prøver. For glukose standard kurve forberedelse, forberede en frisk lager av en mg per ml glukose og forberede null mikrogram til 200 mikrogram konsentrasjoner ved å legge til en mg per ml glukose i 20 mikroliter trinn og utgjør det endelige volumet til en ml med sterilt vann. Ta 500 mikroliter av hver tilberedt standard i et skruehettrør og tilsett en ml 0,2% anthrone.Og nå er prøvene klare for anthronanalyse. Tilsett en ml nylaget anthron. Bland umiddelbart ved å virvelere og overføre til is.Gjenta for alle standarder og prøver på samme måte. Deretter overføres til en forhåndsoppvarmet 100 grader Centigrade blokk i 10 minutter. Etter 10 minutter inkubasjon, overfør til is og inkuber i fem minutter på is.Etter inkubasjon, ta 200 mikroliter av hver prøve i tre replikeringer. Gjenta for både standarder og prøver på samme måte. Og en ladd 96-brønnsplate ble lastet inn i en multimodusdetektor.Ved hjelp av Smart Max Pro-programmet setter vi filterinnstillingen til 620 nanometer. Platetype til 96-brønns type. Merk hele leseområdet.Klikk OK. lese. Leseplate. Du får absorbansavlesningene til både standarder og prøver, som vil bli samlet inn i Excel-arket for videre analyse og estimering av celluloseinnhold.Glukosestandardkurve fremstilles ved å bruke glukosekonsentrasjonene i mikrogram per ml på x-aksen og de normaliserte absorbansverdiene til den respektive konsentrasjonen ved 620 nanometer på y-aksen. Vi får regresjonslinjen med m- og c-verdier i den plottede scatter-grafen vi bruker til å estimere prøven krystallinsk celluloseinnhold. I det første trinnet gjennomsnittet av OD-verdiene på 620 nanometer.Og så normaliserte vi dataene ved å trekke fra den tomme verdien. Vi beregner glukosekonsentrasjonen ved hjelp av formelen x er lik OD minus c / m der vi plugger inn c- og m-verdier fra forrige trinn i regresjonslinjen i standardkurven. Siden det totale volumet som ble brukt til antronanalyse er 500 mikroliter, deler vi det ved fortynningsfaktor to.Siden prøvevolumet som ble brukt bare var 10 mikroliter, vil vi videre dele med 10 for å få mikrogram per mikroliterkonsentrasjon av glukose som er lik mg per ml konsentrasjon. Og så brukte vi fuktighetsfaktoren 1,11 som er fuktighetsøkningen i prosessen. Og til slutt beregner vi prosentandelen krystallinsk celluloseinnhold ved å dele det med celleveggvekten, som er nær fem mg, og multiplisere med 100 for å få prosenten.Deretter gjennomsnittet vi det krystallinske celluloseinnholdet i tre biologiske repliker for å få verdien for individuelle prøver, som vil bli sammenlignet med et annet eksperimentelt linjegjennomsnitt på tre biologiske repliker. Og t-test kan brukes til å teste deres betydningsnivå. Her i tabell A viser vi tabellverdiene for konsentrasjonen og den respektive OD ved 620 nanometer, som videre ble brukt til å plotte en scatter-graf og en regresjonslinje med m- og c-verdiene som ble brukt i C for å oppnå celluloseinnholdsforskjellene mellom de to eksperimentelle linjene.Til slutt viser begge prøvene celluloseforskjeller. Takk for at du så på.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

En rask og effektiv metode for å vurdere patogenitet av Ustilago maydis på Maize og Teosinte Lines

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-anlegg, Sterile mikrokosmos for Nodulation og Vekst av legume Plant<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Med Rhizobial Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

Forbehandling av lignocellulose biomasse med Lavpris ioniske væsker

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammoniakk fiber ekspansjon (AFEX) Forbehandling av Lignocellulosic Biomass

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

En ny metode for Pentosan analyse i Jute biomasse og konvertering sin inn sukker monomerer med surt ioniske flytende

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Anlegget infeksjon testen: Spray og såret-mediert Inoculation med anlegget patogen Magnaporthe Grisea

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Kvantifisere anlegget løselig Protein og fordøyelige karbohydrater innhold, bruke korn (Zea mays) som en Exemplar

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

En Loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe) analysen for rask identifisering av Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, en rimelig åpen kildekode Datalogger å anslå vanninnholdet av Nonvascular Cryptogams

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Prøveforberedelsemetode for skanning og overføring elektron mikroskop for vedlegg av treboring beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...