Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
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Agradecemos ao Departamento de Ciência de Plantas & Solos e Cotton Inc. pelo apoio parcial deste estudo.

1. Preparação experimental
<ol><li>Triture material vegetal seco em um pó fino.</li>
	<li>Tampão de Solubilização de Proteínas (PSB): Preparar soluções de estoque de 1 M Tris (pH 8.8), 0,5 M ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA) (pH 8.0) e autoclave-os. Faça tampão PSB fresco a partir dessas soluções de estoque com concentrações finais de 50 mM Tris, 0,5 mM EDTA e 10% sulfato de dodecil de sódio (SDS) em água estéril.</li>
	<li>Prepare 100 mL de 70% de etanol (v/v): 70 mL de 100% etanol e 30 mL de...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

As fibras de algodão são fibras naturais produzidas a partir da semente de algodão. A fibra de algodão é uma única célula com ~95% de teor de celulose2 com alto teor de celulose cristalina com aplicações extensas na indústria têxtil31. Como, a fibra de algodão contém ~95% de celulose, temos usado tecidos radiculares de algodão para demonstração da estimativa do teor de celulose cristalina. Os tecidos radiculares de algodão são moderadamente ricos em teor d...

A celulose é o componente primário de suporte de carga das paredes celulares, que está presente tanto nas paredes celulares primárias quanto secundárias. A parede celular é uma matriz extracelular que envolve células vegetais e é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose, pectina e proteínas matriciais. Aproximadamente um terço da biomassa das plantas é acelulose 1 e desempenha papéis significativos no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A fibra de algodão contém 95% de teor decelulose 2, enquanto as árvores contêm de 40% a 50% de celulose, dependendo das espécies vegetais e dos tipos de órgãos3. A celulose é composta por unidades repetitivas de celobiose, um disscarido de resíduos de glicose conectados por β-1,4 ligações glicossídicas4. O etanol celulósico é produzido a partir da glicose derivada da celulose presente nas paredescelulares daplanta 5 . A fibra celulósica é composta por várias micro fibrilas nas quais cada micro fibril atua como unidade central com 500-15000 monômeros de glicose1,6. O homopolímero de celulose é sintetizado por complexos de sinthase de celulose incorporados de membrana plasmática (CSC's)1,7. Proteínas de celulose individual synthase A (CESA) sintetizam cadeias glucanas e as cadeias glucan adjacentes são conectadas por ligações de hidrogênio para formar celulose cristalina1,8. A celulose existe em várias formas cristalinas com duas formas predominantes, celulose Iα e celulose Iβ como formas nativas9. Em plantas mais altas, a celulose existe na forma de celulose Iβ, enquanto a celulose vegetal inferior existe na forma Iα10,11. No geral, a celulose desempenha um papel significativo na distribuição de força e rigidez para as paredes celulares da planta.
Os biocombustíveis de primeira geração são produzidos principalmente a partir de amido de milho, açúcares de cana e açúcares de beterraba, que são fontes de alimento, enquanto os biocombustíveis de segunda geração estão focando na produção de biocombustíveis a partir de material de parede celular de biomassa vegetal não-alimentar12. A estimativa precisa do conteúdo de celulose cristalina não é apenas importante para pesquisas fundamentais sobre biosíntese de celulose e dinâmica da parede celular, mas também para pesquisa aplicada de biocombustíveis e produtos biológicos. Vários métodos foram desenvolvidos e otimizados para estimativa de celulose na biomassa vegetal, e o método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O primeiro método relatado para estimativa de celulose foi por Cross e Bevan em 190813. O método baseou-se no princípio da cloração alternativa e extração por sulfato de sódio. No entanto, a celulose obtida pelos protocolos originais e modificados do método Cross e Bevan mostrou contaminação de pequenas frações de lignina, além de uma quantidade substancial de xilanas e mannans14. Apesar de várias modificações para remover lignina e hemicelluloses da fração de celulose, o método Cross-Bevan manteve uma quantidade considerável de mannans junto com celulose. Posteriormente, o método de Kurschner foi desenvolvido empregando ácido nítrico e etanol para extraircelulose 15. Este método afirmava que o total de lignina e 75% dos pentosanos foram removidos, mas os resultados verdadeiros da celulose foram os mesmos estimados pelo método de cloração de Cross e Bevan. Outro método (Norman e Jenkins) foi desenvolvido empregando metanol-benzeno, sulfato de sódio e hipoclorito de sódio para extraircelulose 16. Este método também reteve alguma fração de lignina (3%) e quantidades significativas de pentosanos levando a uma estimativa precisa da celulose. Mais tarde, Kiesel e Semiganowsky utilizaram uma abordagem diferente para hidrolisar a celulose usando ácido sulfúrico concentrado de 80%, e os açúcares reduzidos hidrolisados foram estimados pelo método de Bertrand17. Os dois métodos, Waksman e Stevens18 e Salo14,19 que foram desenvolvidos com base no método de Kiesel e Semiganowsky, também renderam 4-5% menos teor de celulose em comparação com os métodos anteriores20.
O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina. Este método foi descrito pela primeira vez pela Updegraff para a medição da celulose em 196921. O método Updegraff integra o método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel e Seminowsky (hidrólise da celulose em monômeros de glicose usando ácido sulfúrico) com algumas modificações, e o ensaio anthrone de Viles e Silverman para simples estimativa colorimétrica de glicose e teor de celulose cristalina22. O princípio deste método é o uso de ácido acético e ácido nítrico (reagente updeenxf) para eliminar hemicellulose e lignina dos tecidos vegetais homogeneizados, o que deixa celulose resistente a ácido acético/nítrico para posterior processamento e estimativa15. A celulose resistente a ácido actic/nítrico é tratada com ácido sulfúrico de 67% para quebrar a celulose em monômeros de glicose e os monômeros de glicose liberados são estimados pelo ensaio de anthrone21,23. Várias modificações do método updegraff original foram utilizadas para simplificar o procedimento e a estimativa de celulose pelo ensaio de anthrone24. Em linhas gerais, este método pode ser dividido em cinco fases. Na primeira fase, o material da planta é preparado. Na segunda fase, a parede celular bruta é separada da biomassa total, já que a celulose é o componente-chave das paredes celulares das plantas. Mais tarde, na terceira fase, a celulose é separada dos componentes da parede celular não celulósica, tratando com reagente Updegraff. Na quarta fase, a celulose resistente a ácido acético/nítrico é dividida em monômeros de glicose por tratamento de ácido sulfúrico. O tratamento de ácido sulfúrico da celulose resulta na formação de compostos 5-hidroximetilfurfurfural a partir da reação de monômeros de glicose com ácido sulfúrico. Finalmente, na última fase, o anthrone gera um complexo azul esverdeado fervendo com o composto furfural gerado na fase anterior25. Este método colorimétrico baseado em anthrone foi usado pela primeira vez em 1942 por Dreywood. Anthrone é um corante que identifica compostos furfurais de pentose e hexose produtos desidratados como 5-hidroximetilfurfural, em condições ácidas. A reação com hexose produz uma cor intensa e melhor resposta em comparação com as pentoses25. A quantidade de glicose encadernada é medida pela absorvância espectrofotômetro a 620 nm e a intensidade do complexo azul esverdeado é diretamente proporcional à quantidade de açúcar na amostra. Os valores medidos de absorvência foram comparados com uma linha de regressão padrão de glicose para calcular a concentração de glicose da amostra. O teor de glicose medido foi utilizado para estimar o teor de celulose da biomassa vegetal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

A celulose é o polímero mais abundante na Terra gerado pela fotossíntese e o principal componente de suporte de carga das paredes celulares. A parede celular desempenha um papel significativo no crescimento e desenvolvimento das plantas, fornecendo força, rigidez, taxa e direção do crescimento celular, manutenção da forma celular e proteção contra estressores bióticos e abióticos. A parede celular é composta principalmente de celulose, lignina, hemicellulose e pectina. Recentemente, as paredes celulares das plantas foram alvo da produção de biocombustível e bioenergia de segunda geração. Especificamente, o componente de celulose da parede celular da planta é usado para a produção de etanol celulósico. A estimativa do teor de celulose de biomassa é fundamental para pesquisas fundamentais e aplicadas na parede celular. O método Updegraff é simples, robusto e o método mais utilizado para a estimativa do teor de celulose cristalina da biomassa vegetal. A fração de parede celular bruta insolúvel de álcool após o tratamento com reagente Updegraff elimina as frações de hemicellulose e lignina. Mais tarde, a fração de celulose resistente ao reagente Updegraff é submetida ao tratamento de ácido sulfúrico para hidrolisar o homopolímero de celulose em unidades de glicose monomérica. Uma linha de regressão é desenvolvida utilizando várias concentrações de glicose e usada para estimar a quantidade de glicose liberada sobre a hidrólise da celulose nas amostras experimentais. Finalmente, o teor de celulose é estimado com base na quantidade de monômeros de glicose por ensaio de antrona colorimétrico.

Foram selecionadas plantas de algodão cultivadas na casa verde para este estudo. Duas diferentes linhas experimentais de algodão foram selecionadas para análise comparativa do teor de celulose. Para cada linha experimental, o tecido radicular foi coletado a partir de três réplicas biológicas. Um total de 500 mg de tecido foi homogeneizado e 20 mg dele foi utilizado para extração de parede celular bruta. Mais tarde, 5 mg de extrato de parede de célula bruta foi usado para o tratamento de reagente updegraff para r...

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Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

O método Updegraff é o método mais utilizado para a estimativa de celulose. O principal objetivo desta demonstração é fornecer um protocolo updegraff detalhado para estimativa de conteúdo de celulose em amostras de biomassa vegetal.

Estimativa do Teor de Celulose Cristalina de Biomassa Vegetal utilizando o Método Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Aqui, demonstramos o método Updegraff, o método mais utilizado no mundo para a estimativa do conteúdo de celulose cristalina. A celulose é basicamente composta de monômeros de glicose ligados por beta-1, 4 ligações glicossídicas. Dividimos este protocolo em cinco fases.Na primeira fase, preparamos o material de biomassa vegetal. Na segunda fase, extraímos a parede celular bruta. Na terceira fase, utilizamos o tratamento Updegraff no qual o Updeenxerf é composto de ácido acético e ácido nítrico que ajuda na remoção de hemicellulose e lignina de nossas amostras.Na quarta fase, submetemos-no à hidrólise ácida com a ajuda do ácido sulfúrico que produz os monômeros de glicose. Finalmente, na quinta fase, usamos ensaio de anthrone para estimar o conteúdo de celulose cristalina. Recolher o material vegetal da estufa, lavá-los cuidadosamente com água, secar o ar por dois dias, separar o tecido e transferir o tecido para os recipientes rotulados individualmente e incubar na incubadora a 49 graus centígrados por 10 dias.Então, finalmente, corte em pedaços usando tesoura ou lâmina. Congele o tecido e carregue em argamassa e pilão para moagem fina em pó uniforme ou, alternativamente, use freezer/mill. Aqui, demonstramos usando freezer/mill, por isso carregamos nossas amostras de tecido nesses frascos de moagem e as colocamos no Freezer/Mill e executamos a velocidade de 10 CP por três ciclos.O pó de tecido é coletado no tubo Falcão, como mostrado aqui. Pese 20 mg do pó de tecido e transfira para um tubo de dois mL pré-pesado. Adicione um mL de tampão de solubilização de proteínas para remover proteínas. vórtice.Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernaspeso. Repita este passo mais duas vezes.Adicione um mL de água estéril à pelota retida. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Repita este passo mais duas vezes.Adicione um ML de 70% de etanol à pelota retida. vórtice. Transfira para um bloco centígrado pré-aquecido de 70 graus com agitação simultânea por uma hora. Após uma hora de incubação, centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos.Repita este passo mais uma vez. À pelota salva, adicione um mL de 100% de metilona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos.Adicione um mL de metanol clorofórmio. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernatante e adicione um mL de acetona. vórtice.Incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Re-descarte o supernaspe e o ar seque-os a 37 graus centígrados durante a noite ou continue pela secagem a vácuo.Carregue suas amostras no secador de vácuo e o ar seque por duas a três horas ou até que a pelota esteja completamente seca. Pesar cinco mg do extrato da parede celular obtido da etapa anterior. Transfira para um tubo de tampa de parafuso de dois mL.Inclua também o controle positivo neste momento. Use dois mg de papel filtro Whatman para esse fim. Transfira para um tubo de tampa de parafuso de dois mL.Adicione 1,5 mL de reagente Updegraff a cada extrato de parede celular pesado. Vórtice e incubar a 100 graus centígrados em um bloco pré-aquecido por 30 minutos. Após 30 minutos de incubação, transfira para um rack.Deixe esfriar no banco por 10 minutos. Centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.Adicione um mL de água estéril. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por 10 minutos. Descarte 500 microliters do supernante.Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte um mL do supernaspe.Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernatante completamente.Adicione um mL de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM por cinco minutos. Descarte o supernaspeso.Seque a 37 graus centígrados durante a noite. Depois de uma incubação de uma noite, transfira para um rack. Adicione um mL de ácido sulfúrico de 67%. vórtice.Incubar a 25 graus centígrados por uma hora com agitação simultânea. Após uma hora de incubação, certifique-se de que a pelota está completamente dissolvida. Transfira para um rack.Este é o passo final da extração de celulose. Agora as amostras estão prontas para diluição amostral. Para diluição amostral, utilize 10 microliters de cada amostra da etapa anterior e adicione 490 microliters de água estéril.Repita isso para todas as amostras experimentais. Para a preparação da curva padrão de glicose, prepare um estoque fresco de uma mg por glicose de 1 mL e prepare zero microgramas para 200 concentrações de microgramas adicionando um mg por mL de glicose em incrementos de 20 microliter e compõem o volume final para um mL com água estéril. Pegue 500 microliter de cada padrão preparado em um tubo de tampa de parafuso e adicione um mL 0,2% anthrone.E agora as amostras estão prontas para o ensaio de anthrone. Adicione um mL de anthrone recém-preparado. Misture imediatamente por vórtice e transfira para o gelo.Repita para todos os padrões e amostras da mesma forma. Em seguida, transfira para um bloco centígrado pré-aquecido de 100 graus por 10 minutos. Após 10 minutos de incubação, transfira para o gelo e incubar por cinco minutos no gelo.Após a incubação, tome 200 microliters de cada amostra em três réplicas. Repita para ambos os padrões e amostras da mesma forma. E uma placa carregada de 96 poços foi carregada em um detector multimode.Usando o programa Smart Max Pro, definimos a configuração do filtro para 620 nanômetros. Tipo de placa para 96-bem tipo. Selecione toda a área de leitura.Clique em OK. ler. Leia a placa. Você obtém as leituras de absorvência de ambos os padrões e amostras, que serão coletadas na folha do Excel para análise e estimativa do conteúdo de celulose.A curva padrão de glicose é preparada utilizando-se as concentrações de glicose em microgramas por mL no eixo x e os valores de absorção normalizados da respectiva concentração em 620 nanômetros no eixo y. Temos a linha de regressão com valores m e c no gráfico de dispersão plotado que usamos para estimar o conteúdo de celulose cristalina amostral. Na primeira etapa, tivemos uma média dos valores de OD em 620 nanômetros.E então normalizamos os dados subtraindo o valor em branco. Calculamos que a concentração de glicose usando a fórmula x é igual a OD menos c/m onde conectamos os valores c e m da etapa anterior da linha de regressão na curva padrão. Como o volume total utilizado para o ensaio de anthrone é de 500 microliters, dividimos-o pelo fator de diluição dois.Como o volume amostral utilizado foi de apenas 10 microlitadores, vamos dividir ainda mais por 10 para obter microgramas por concentração de microliter de glicose que é igual a mg por mL concentração. E então usamos o fator umidade 1.11 que é o ganho de umidade no processo. E, finalmente, calculamos o percentual de teor de celulose cristalina dividindo-o com o peso da parede celular, que é perto de cinco mg, e multiplicamos por 100 para obter o percentual.Em seguida, fizemos uma média do teor de celulose cristalina de três réplicas biológicas para obter o valor das amostras individuais, que serão comparadas com outra média de linha experimental de três réplicas biológicas. E o teste t pode ser usado para testar seu nível de significância. Aqui na tabela A, mostramos os valores de tabela da concentração e os respectivos OD em 620 nanômetros, que foi ainda utilizado para traçar um gráfico de dispersão e uma linha de regressão com os valores m e c que foram utilizados no C para a obtenção das diferenças de teor de celulose entre as duas linhas experimentais.Em conclusão, ambas as amostras apresentam diferenças de celulose. Obrigado por assistir.

Research

JoVE Journal

Environment

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Single-plantas, estéreis Microcosmos para a nodulação e crescimento da planta da leguminosa<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Com o rizóbio Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

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