Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Мы благодарим Департамент растений и почвоведения и хлопка инк за их частичную поддержку этого исследования.

1. Экспериментальная подготовка
<ol><li>Измельчить сушеный растительный материал в мелкий порошок.</li>
	<li>Белка Solubilization Buffer (PSB): Подготовка фондовых растворов 1 M Tris (рН 8,8), 0,5 М этилендиаминтетраатетической кислоты (EDTA) (рН 8,0) и автоклав их. Сделайте свежий буфер PSB из этих фондовых растворов ?...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Хлопковые волокна являются натуральными волокнами, произведенными из хлопчатобумажного семе. Хлопковое волокно является одной клеткой с содержанием целлюлозы 95%2 с высоким содержанием кристаллической целлюлозы с обширным применением в текстильнойпромышленно?...

Целлюлоза является основным нагрузоносным компонентом клеточных стенок, который присутствует как в первичных, так и в вторичных клеточных стенках. Клеточная стенка является внеклеточной матрицей, которая окружает растительные клетки и в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемицеллюлозы, пектина и матричных белков. Приблизительно одна треть биомассы растений целлюлозы1 и играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Хлопковое волокно содержит 95% целлюлозы2 содержание, в то время как деревья содержат от 40% до 50% целлюлозы в зависимости от видов растений итипов органов 3. Целлюлоза состоит из повторяющихся единиц целлобиозы, дисахарид остатков глюкозы, соединенных β-1,4 гликозидионыхсвязей 4. Целлюлозный этанол производится из глюкозы, полученной из целлюлозы, присутствуют в стенках клеток растений5. Целлюлозное волокно состоит из нескольких микро фибрилляций, в которых каждый микро фибриллятор действует как основной блок с 500-15000 мономеровглюкозы 1,6. Целлюлозный гомополимер синтезируется плазменной мембраной встроенных целлюлозно-синтазных комплексов (CSC's)1,7. Индивидуальные целлюлозные синтазы (CESA) белки синтезируют глюкановые цепи и прилегающие к ним глюкановые цепи соединены водородными связями для формирования кристаллическойцеллюлозы 1,8. Целлюлоза существует в нескольких кристаллических формах с двумя преобладающими формами, целлюлозой I и целлюлозой I, как родные формы9. В высших растениях целлюлоза существует в форме целлюлозы I, в то время как нижняя целлюлоза растений существует вформе I q 10,11. В целом, целлюлоза играет значительную роль в придав прочности и жесткости стенок клеток растений.
Биотопливо первого поколения в основном производится из кукурузного крахмала, тростникового сахара и свеклы сахаров, которые являются источниками пищи, в то время как биотопливо второго поколения фокусируется на производстве биотоплива из непродовольственных растений биомассы клеточный материалстены 12. Точная оценка содержания кристаллической целлюлозы важна не только для фундаментальных исследований биосинтеза целлюлозы и динамики клеточных стенок, но и для прикладных исследований биотоплива и био продуктов. Разработаны и оптимизированы различные методы оценки целлюлозы в биомассе растений, а метод Ульдеграффа является наиболее широко используемым методом оценки целлюлозы. Первый зарегистрированный метод оценки целлюлозы был Кросс и Беван в 1908году 13. Метод был основан на принципе альтернативного хлорирования и экстракции сульфатом натрия. Тем не менее, целлюлоза, полученная в оригинале, а также измененные протоколы Креста и Беван метод показал загрязнение небольших фракций лигнина в дополнение к значительному количеству ксиланов и маннан14. Несмотря на несколько изменений для удаления лигнина и гемичеллозы из целлюлозной фракции, метод Кросс-Беван сохранил значительное количество маннан вместе с целлюлозой. Позже метод Куршнера был разработан с использованием азотной кислоты и этанола для извлечения целлюлозы15. Этот метод заявил, что общий лигнин и 75% пентозанов были удалены, но истинные результаты целлюлозы были такими же, как те, которые оцениваются методом хлорирования Креста и Бевана. Другой метод (Норман и Дженкинс) был разработан с использованием метанола-бензола, сульфата натрия и гипохлорита натрия для извлеченияцеллюлозы 16. Этот метод также сохранил некоторую долю лигнина (3%) и значительное количество пентозанов, что приводит к точной оценке целлюлозы. Позже Кизель и Семигановский использовали другой подход к гидролизной целлюлозе, используя 80% концентрированной серной кислоты, а гидролизированные пониженные сахара оценивались методомБертрана 17. Два метода, Waksman и Стивенс18 и Сало 14,19, которые были разработаны на основе метода Kiesel и Semiganowsky, также дали 4-5% меньше содержания целлюлозы по сравнению с предыдущими методами20.
Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Этот метод был впервые описан Updegraff для измерения целлюлозы в 1969году 21. Метод Updegraff интегрирует метод Kurschner (использование азотной кислоты), методы Кизела и Семиновского (гидролиз целлюлозы в мономеры глюкозы с использованием серной кислоты) с некоторыми модификациями, и антронный анализ Viles и Silverman для простой колоритной оценки содержания глюкозы икристаллической целлюлозы 22. Принцип этого метода является использование уксусной кислоты и азотной кислоты (Updegraff реагент) для устранения гемичеллозы и лигнина из гомогенизированных тканей растений, что оставляет уксусной / азотной кислоты устойчивых целлюлозы для дальнейшей обработки иоценки 15. Ацетическая/азотная кислотная устойчивая целлюлоза лечится 67% серной кислотой, чтобы разбить целлюлозу на мономерыглюкозы,а выпущенные мономеры глюкозы оцениваются по анализу21,23. Несколько модификаций оригинального метода Updegraff были использованы для упрощения процедуры и оценки целлюлозы с помощью анализа24. В целом этот метод можно разделить на пять этапов. На первом этапе готовится растительный материал. На втором этапе стена сырой клетки отделяется от общей биомассы, так как целлюлоза является ключевым компонентом стенок клеток растений. Позже, в третьей фазе, целлюлоза отделяется от неклеточных компонентов клеточной стенки путем лечения реагентом Updegraff. В четвертой фазе устойчивая к уксусу/азотной кислоте целлюлоза разбита на мономеры глюкозы путем лечения серной кислотой. Серная кислота лечения целлюлозы приводит к образованию 5-гидроксиметилфурфальных соединений от реакции мономеров глюкозы с серной кислотой. Наконец, на последнем этапе, антрон генерирует зеленовато-голубой комплекс путем кипения с меховым соединением, генерируемым в предыдущей фазе25. Этот цветометрический метод на основе антрона был впервые использован в 1942 году Дрейвудом. Антрон является красителем, который определяет меховые соединения пентозы и шестинозных обезвоженных продуктов, таких как 5-гидроксиметилфурфурурал, в кислых условиях. Реакция с шестиосной производит интенсивный цвет и лучший ответ по сравнению с пентозами25. Количество связанной глюкозы измеряется абсорбации спектрофотометра на уровне 620 нм, а интенсивность зеленовато-голубого комплекса прямо пропорциональна количеству сахара в образце. Измеренные значения абсорбции сравнивались со стандартной линией регрессии кривой глюкозы для расчета концентрации глюкозы в образце. Измеренное содержание глюкозы было использовано для оценки содержания целлюлозы в биомассе растения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

Целлюлоза является наиболее распространенным полимером на Земле, генерируемым фотосинтезом и основным несущим компонентом клеточных стенок. Клеточная стенка играет значительную роль в росте и развитии растений, обеспечивая прочность, жесткость, скорость и направление роста клеток, поддержание формы клеток, а также защиту от биотических и абиотических стрессоров. Клеточная стенка в основном состоит из целлюлозы, лигнина, гемичеллозы и пектина. Недавно стенки клеток растений были ориентированы на производство биотоплива и биоэнергии второго поколения. В частности, целлюлозный компонент стенки клеток растения используется для производства целлюлозного этанола. Оценка содержания целлюлозы в биомассе имеет решающее значение для фундаментальных и прикладных исследований клеточной стенки. Метод Updegraff прост, надежн и наиболее широко используется метод для оценки кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений. Алкоголь нерастворимых сырой фракции стенки клетки при лечении реагентом Updegraff устраняет гемичеллулозы и лигнина фракций. Позже, Updegraff реагент устойчивых целлюлозы фракция подвергается серной кислоты лечения гидролизов целлюлозы гомополимера в мономерных единиц глюкозы. Регрессионная линия разработана с использованием различных концентраций глюкозы и используется для оценки количества глюкозы, высвобождаемой при целлюлозном гидролизе в экспериментальных образцах. Наконец, содержание целлюлозы оценивается на основе количества мономеров глюкозы по колоритическому анализу антрона.

Хлопковые растения, выращенные в зеленом доме, были отобраны для этого исследования. Для сравнительного анализа содержания целлюлозы были отобраны две различные экспериментальные линии хлопка. Для каждой экспериментальной линии корневая ткань была собрана из трех биологических репл...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method at JoVE.com

Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

Метод Updegraff является наиболее широко используемым методом для оценки целлюлозы. Основная цель этой демонстрации заключается в предоставлении подробного протокола Updegraff для оценки содержания целлюлозы в образцах биомассы растений.

Оценка кристаллического содержания целлюлозы биомассы растений с использованием метода Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Здесь мы демонстрируем метод Updegraff, наиболее широко используемый в мире метод оценки кристаллического содержания целлюлозы. Целлюлоза в основном состоит из мономеров глюкозы, связанных бета-1, 4 гликозидных связей. Мы разделили этот протокол на пять этапов.На первом этапе мы готовим материал из биомассы растения. На втором этапе мы извлекаем сырую клеточной стенки. На третьем этапе мы используем лечение Updegraff, в котором Updegraff состоит из уксусной кислоты и азотной кислоты, которая помогает в удалении гемичеллозы и лигнина из наших образцов.На четвертой фазе мы подвергаем его кислотный гидролиз с помощью серной кислоты, которая производит мономеры глюкозы. Наконец, на пятом этапе мы используем анализ антрона для оценки кристаллического содержания целлюлозы. Соберите растительный материал из теплицы, тщательно промойте их водой, высушите воздух в течение двух дней, разделите ткань и перенесите ткань в индивидуально маркированную тару и инкубировать в инкубаторе при 49 градусах по Цельсию в течение 10 дней.Затем, наконец, разрезать на куски с помощью ножниц или лезвия. Заморозить ткани и нагрузки в раствор и пестик для тонкой шлифовки в единый порошок или же использовать морозильник / мельница. Здесь мы демонстрируем использование морозильника / мельницы, поэтому мы загружаем наши образцы тканей в эти шлифовальные флаконы и поставить их в морозильной камере / мельницы и запустить 10 CP скорость в течение трех циклов.Порошок ткани собирается в трубке Falcon, как показано здесь. Взвесь 20 мг порошка ткани и перенесите в предварительно взвешенную трубку из двух мл. Добавьте один мл буфера солюбилизации белка для удаления белков. вихрь.Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант. Повторите этот шаг еще два раза.Добавьте одну мл стерильной воды в сохраненную гранулу. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Повторите этот шаг еще два раза.Добавьте один МЛ 70% этанола в сохраненные гранулы. вихрь. Передача в разогретый 70 градусов по Цельсию блок с одновременным встряхивания в течение одного часа. После часовой инкубации центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут.Повторите этот шаг еще раз. К сохраненной грануле добавьте один мл 100%-метилона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут.Добавьте один мл хлороформа метанола. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и добавьте один мл ацетона. вихрь.Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Повторно отбросьте супернатант и высушите их при 37 градусах по Цельсию на ночь или продолжайте вакуумную сушку.Загрузите образцы в вакуумную сушилку и высушите воздух в течение двух-трех часов или до тех пор, пока гранулы полностью высохнут. Взвесь пять мг экстракта клеточной стенки, полученного с предыдущего шага. Передача в две трубки крышки винта МЛ.Также включите положительный контроль на данный момент. Используйте два мг фильтровальной бумаги Whatman для этой цели. Переход на две трубки крышки винта МЛ.Добавьте 1,5 мл реагента Updegraff к каждому взвешенной экстракту клеточной стенки. Вихрь и инкубировать при 100 градусах по Цельсию в разогретом блоке в течение 30 минут. Через 30 минут инкубации перенесите на стойку.Дайте ему остыть на скамейке в течение 10 минут. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта, не нарушая гранулы.Добавьте один мл стерильной воды. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Отбросьте 500 микролитров супернатанта.Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте один мл супернатанта.Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант полностью.Добавьте один мл ацетона. вихрь. Центрифуга при 15 000 об/мин в течение пяти минут. Отбросьте супернатант.Высушите при 37 градусах по Цельсию на ночь. После ночной инкубации перенесите на стойку. Добавьте один мл 67%серной кислоты. вихрь.Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение одного часа с одновременным встряхивания. После часовой инкубации убедитесь, что гранулы полностью растворяются. Перенесите на стойку.Это последний шаг экстракции целлюлозы. Теперь образцы готовы к разбавлению образца. Для разбавления образца используйте 10 микролитров каждого образца предыдущего шага и добавьте 490 микролитров стерильной воды.Повторите это для всех экспериментальных образцов. Для стандартного препарата кривой глюкозы приготовьте свежий запас в один мг на мЛ глюкозы и приготовьте ноль микрограммов до 200 микрограммов концентрации, добавив одну мг на глюкозу мл в 20 микролитровых приращениях и составить окончательный объем до одного мл со стерильной водой. Возьмите 500 микролитров каждого подготовленного стандарта в винтовой крышке трубки и добавьте один мл 0,2% антрона.И теперь образцы готовы к анализу. Добавьте один мл свежеприготовленного антрона. Смешайте сразу же вихрем и перенесите на лед.Повторите для всех стандартов и образцов таким же образом. Затем перенесите в разогретый 100 градусов по Цельсию блок в течение 10 минут. Через 10 минут инкубации перенесите на лед и инкубировать в течение пяти минут на льду.После инкубации возьмите 200 микролитров каждого образца в трех репликациях. Повторите как для стандартов, так и для образцов одинаково. А загруженная пластина из 96 колодец была загружена в мультимодный детектор.Используя программу Smart Max Pro, мы устанавливаем настройку фильтра до 620 нанометров. Тип плиты до 96-наилучшим образом типа. Выберите всю область чтения.Нажмите OK. читать. Прочитайте тарелку. Вы получаете показания абсорбанса как стандартов, так и образцов, которые будут собраны в листе Excel для дальнейшего анализа и оценки содержания целлюлозы.Стандартная кривая глюкозы готовится с помощью концентраций глюкозы в микрограммах на мл на х-оси и нормализованных значений поглощения соответствующей концентрации на уровне 620 нанометров на оси. Мы получаем линию регрессии с значениями m и c в графике рассеяния, который мы используем для оценки кристаллического содержания целлюлозы образца. На первом этапе мы усреднили значения OD на уровне 620 нанометров.А потом мы нормализовали данные, вычитая пустое значение. Мы вычисляем концентрацию глюкозы по формуле x равна OD минус c/m, где мы подключаем значения c и m от предыдущего шага линии регрессии в стандартной кривой. Так как общий объем, который был использован для анализа антрона составляет 500 микролитров, мы делим его на фактор разбавления два.Так как объем выборки, который был использован было только 10 микролитров, мы будем далее разделить на 10, чтобы получить микрограмм на микролитер концентрации глюкозы, которая равна мг на мЛ концентрации. И тогда мы использовали фактор влаги 1.11, который является увеличение влаги в этом процессе. И, наконец, мы вычисляем процентное содержание кристаллической целлюлозы, разделив ее с весом клеточной стенки, которая близка к пяти мг, и умножаемся на 100, чтобы получить процент.Затем мы усредили содержание кристаллической целлюлозы в трех биологических репликациях, чтобы получить значение для отдельных образцов, которое будет сравниться с другой экспериментальной линией в среднем из трех биологических репликаций. И t-test можно использовать для того чтобы испытать их уровень значения. Здесь, в таблице А, мы показываем значения таблицы концентрации и соответствующих OD на 620 нанометров, который был далее использован для построения графика рассеяния и регрессионные линии с значениями m и c, которые использовались в C для получения различий в содержании целлюлозы между двумя экспериментальными линиями.В заключение, оба образца показывают различия целлюлозы. Спасибо за просмотр.

Research

JoVE Journal

Environment

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

Быстрый и эффективный метод оценки патогенности Ustilago maydis на линиях кукурузы и teosinte

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Одно-растений, Стерильные Микрокосмы для нодуляции и рост бобовых растений<em&gt; Люцерна truncatula</em&gt; С ризобиальных симбионта<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Pretreatment of Lignocellulosic Biomass with Low-cost Ionic Liquids

Предварительная обработка биомассы лигноцеллюлозы с недорогими Ионные жидкости

A number of ionic liquids (ILs) with economically attractive production costs have recently received growing interest as media for the delignification of ...

Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Ammonia Fiber Expansion AFEX Pretreatment of Lignocellulosic Biomass

Расширение аммиачной клетчатки (AFEX) Предварительная обработка лигноцеллюлезной биомассы

Lignocellulosic materials are plant-derived feedstocks, such as crop residues (e.g., corn stover, rice straw, and sugar cane bagasse) and purpose-grown ...

A Novel Method for the Pentosan Analysis Present in Jute Biomass and Its Conversion into Sugar Monomers Using Acidic Ionic Liquid

Новый метод для анализа Пентозанполисульфат в джута биомассы и превращения его в сахар мономеров, с использованием кислой ионные жидкости

Recently, ionic liquids (ILs) are used for biomass valorization into valuable chemicals because of their remarkable properties such as thermal stability, ...

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Inoculation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea

Завод инфекции тест: Спрей и Рана опосредованной прививка с завода возбудителя Magnaporthe мурены

Plants possess a powerful system to defend themselves against potential threats by pathogenic fungi. For agriculturally important plants, however, current ...

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn (Zea mays) As an Exemplar

Quantifying Plant Soluble Protein and Digestible Carbohydrate Content, Using Corn Zea mays As an Exemplar

Количественная оценка завод растворимого белка и усваиваемых углеводов контента, используя кукурузы (Zea mays) как образец

Elemental data are commonly used to infer plant quality as a resource to herbivores. However, the ubiquity of carbon in biomolecules, the presence of ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

Петля опосредованной Assay изотермической амплификация (лампа) для быстрой идентификации Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

BtM, a Low-cost Open-source Datalogger to Estimate the Water Content of Nonvascular Cryptogams

BtM, открытым исходным кодом измерители лоу кост оценить содержание воды Nonvascular Cryptogams

Communities of nonvascular cryptogams, such as mosses or lichens, are an important part of the Earth's biodiversity, contributing to the regulation of the ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Метод подготовки образцов сканирующего и трансмиссионного электронного микроскопа для придатков woodboring Beetle

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...