Name: estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method
Uploaded: 2021-05-15T14:00:00
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Agradecemos al Departamento de Ciencia de Plantas y Suelos y Cotton Inc. por su apoyo parcial a este estudio.

1. Preparación experimental
<ol><li>Moler el material vegetal seco en un polvo fino.</li>
	<li>Buffer de solubilización de proteínas (PSB): Preparar soluciones de stock de 1 M Tris (pH 8.8), ácido etilenodiaminetetraacetic de 0,5 M (EDTA) (pH 8.0) y autoclavarlos. Haga un amortiguador PSB fresco a partir de estas soluciones de stock con concentraciones finales de Tris de 50 mM, 0,5 mM EDTA y 10% de sulfato de dodecilo sódico (SDS) en agua estéril.</li>
	<li>Preparar 100 ml de etanol del 70% (v/v): 70 ml de etanol...

<ol>
	<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthesis+in+higher+plants.">Cellulose synthesis in higher plants.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 53-78 (2006).</li><li>Balasubramanian, V. K., Rai, K. M., Thu, S. W., Hii, M. M., Mendu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+multifunctional+laccase+gene+family+in+cotton+(Gossypium+spp.);+expression+and+biochemical+analysis+during+fiber+development.">Genome-wide identification of multifunctional laccase gene family in cotton (Gossypium spp.); expression and biochemical analysis during fiber development.</a> Scientific Reports. 6, 34309 (2016).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Kraszkiewicz, A., Kachel-Jakubowska, M., Lorencowicz, E., Przywara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cellulose+content+in+plant+biomass+on+selected+qualitative+traits+of+pellets.">Influence of cellulose content in plant biomass on selected qualitative traits of pellets.</a> Agriculture and Agricultural Science Procedia. 7, 125-130 (2015).</li><li>Jordan, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+walls+to+ethanol.">Plant cell walls to ethanol.</a> Biochemical Journal. 442, 241-252 (2012).</li><li>Brett, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+microfibrils+in+plants:+biosynthesis,+deposition,+and+integration+into+the+cell+wall.">Cellulose microfibrils in plants: biosynthesis, deposition, and integration into the cell wall.</a> International Review of Cytology. 199, 161-199 (2000).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+synthase+complexes+act+in+a+concerted+fashion+to+synthesize+highly+aggregated+cellulose+in+secondary+cell+walls+of+plants.">Cellulose synthase complexes act in a concerted fashion to synthesize highly aggregated cellulose in secondary cell walls of plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 11348-11353 (2016).</li><li>Polko, J. K., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+cellulose+biosynthesis+in+plants.">The regulation of cellulose biosynthesis in plants.</a> The Plant Cell. 31, 282-296 (2019).</li><li>Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+cellulose.">The biosynthesis of cellulose.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 33, 1345-1373 (1996).</li><li>Gautam, S. P., Bundela, P. S., Pandey, A. K., Jamaluddin, M. K., Sarsaiya, A., Sarsaiya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+systematic+study+of+cellulose.">A review on systematic study of cellulose.</a> Journal of Applied and Natural Science. 2, (2010).</li><li>Coughlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+hydrolysis+of+cellulose:+An+overview.">Enzymic hydrolysis of cellulose: An overview.</a> Bioresource Technology. 39, 107-115 (1992).</li><li>Robak, K., Balcerek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+second+generation+bioethanol+production+from+residual+biomass.">Review of second generation bioethanol production from residual biomass.</a> Food Technology and Biotechnology. 56, 174-187 (2018).</li><li>Cross, C. F., Bevan, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+and+chemical+industry.">Cellulose and chemical industry.</a> Journal of the Society of Chemical Industry. 27, 1187-1193 (1908).</li><li>Paloheimo, L., Eine, H., Kero, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cellulose+determination.">A method for cellulose determination.</a> Agricultural and Food Science. 34, (1962).</li><li>Kurschner, K., Hanak, A., Diese, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zeitschrift f&#252;r Lebensmittel-Untersuchung und-Forschung. 59, 448-485 (1930).</li><li>Norman, A. G., Jenkins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+determination+of+cellulose,+based+upon+observations+on+the+removal+of+lignin+and+other+encrusting+materials.">A new method for the determination of cellulose, based upon observations on the removal of lignin and other encrusting materials.</a> Biochemical Journalournal. 27, (1933).</li><li>Kiesel, A., Semiganowsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose-Bestimmung+durch+quantitative+verzuckerung.">Cellulose-Bestimmung durch quantitative verzuckerung.</a> Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft (A and B Series). 60, 333-338 (1927).</li><li>Waksman, S. A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+of+proximate+chemical+analysis+of+plant+materials.">A system of proximate chemical analysis of plant materials.</a> Industrial Engineering Chemistry and Analytical Edition. 2, 167-173 (1930).</li><li>Salo, M. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+carbohydrates+in+animal+foods+as+seven+fractions.">Determination of carbohydrates in animal foods as seven fractions.</a> Agricultural and Food Science. , 32-38 (1961).</li><li>Giger-Reverdin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+main+methods+of+cell+wall+estimation:+interest+and+limits+for+ruminants.">Review of the main methods of cell wall estimation: interest and limits for ruminants.</a> Animal Feed Science and Technology. 55, 295-334 (1995).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+inbiological+materials.">Semimicro determination of cellulose inbiological materials.</a> Analytical Biochemistry. 32, 420-424 (1969).</li><li>Viles, F. J., Silverman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+starch+and+cellulose+with+anthrone.">Determination of starch and cellulose with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 21, 950-953 (1949).</li><li>Scott, T. A., Melvin, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+dextran+with+anthrone.">Determination of dextran with anthrone.</a> Analytical Chemistry. 25, 1656-1661 (1953).</li><li>Kumar, M., Turner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol:+a+medium-throughput+method+for+determination+of+cellulose+content+from+single+stem+pieces+of+Arabidopsis+thaliana.">Protocol: a medium-throughput method for determination of cellulose content from single stem pieces of Arabidopsis thaliana.</a> Plant Methods. 11, 46 (2015).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extractsby+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extractsby anthrone.</a> Biochemical Journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Houston, K., Tucker, M. R., Chowdhury, J., Shirley, N., Little, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+cell+wall:+A+complex+and+dynamic+structure+as+revealed+by+the+responses+of+genes+under+Stress+conditions.">The plant cell wall: A complex and dynamic structure as revealed by the responses of genes under Stress conditions.</a> Frontiers in Plant Science. 7, (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomass+extraction+using+non-chlorinated+solvents+for+biocompatibility+improvement+of+polyhydroxyalkanoates.">Biomass extraction using non-chlorinated solvents for biocompatibility improvement of polyhydroxyalkanoates.</a> Polymers. 10, 731 (2018).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+saponification+method+for+chlorophyll+removal+from+microalgae+biomass+as+oil+feedstock.">A saponification method for chlorophyll removal from microalgae biomass as oil feedstock.</a> Marine Drugs. 14, 162 (2016).</li><li>Wiltshire, K. H., Boersma, M., M&#246;ller, A., Buhtz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+pigments+and+fatty+acids+from+the+green+alga+Scenedesmus+obliquus+(Chlorophyceae).">Extraction of pigments and fatty acids from the green alga Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae).</a> Aquatic Ecology. 34, 119-126 (2000).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+plant+cell+walls+(lignocellulosic+biomass)+part+II:+carbohydrates.">Comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part II: carbohydrates.</a> Journal of Visualized Experiments. (1837), (2010).</li><li>Haigler, C., Betancur, L., Stiff, M., Tuttle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotton+fiber:+a+powerful+single-cell+model+for+cell+wall+and+cellulose+research.">Cotton fiber: a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research.</a> Frontiers in Plant Science. 3, (2012).</li><li>Spirk, S., Nypel&#246;, T., Kontturi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+Biopolymer+thin+films+and+coatings.">Editorial: Biopolymer thin films and coatings.</a> Frontiers in Chemistry. 7, (2019).</li><li>Long, L. -. Y., Weng, Y. -. X., Wang, Y. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+aerogels:+Synthesis,+applications,+and+prospects.">Cellulose aerogels: Synthesis, applications, and prospects.</a> Polymers. 10, 623 (2018).</li></ol>

Las fibras de algodón son fibras naturales producidas a partir de la semilla de algodón. La fibra de algodón es una sola célula con ~95% contenido de celulosa2 con alto contenido de celulosa cristalina con amplias aplicaciones en la industria textil31. Como, fibra de algodón contiene ~ 95% celulosa, hemos utilizado tejidos de raíz de algodón para la demostración de la estimación del contenido de celulosa cristalina. Los tejidos de raíz de algodón son moderadament...

La celulosa es el componente principal de carga de las paredes celulares, que está presente en las paredes celulares primarias y secundarias. La pared celular es una matriz extracelular que rodea las células vegetales y está compuesta principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa, pectina y proteínas matriciales. Aproximadamente un tercio de la biomasa de las plantas es celulosa1 y desempeña un papel importante en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La fibra de algodón contiene 95% de celulosa2 contenido, mientras que los árboles contienen 40% a 50% de celulosa dependiendo de las especies vegetales y los tipos de órganos3. La celulosa se compone de unidades repetidas de celobiosa, un disacárido de residuos de glucosa conectados por β-1,4 enlaces glicosidos4. El etanol celulósico se produce a partir de la glucosa derivada de la celulosa presente en las paredes celulares de la planta5. La fibra celulósica se compone de varias micro fibrillas en las que cada micro fibril actúa como unidad central con monómeros de glucosa 500-150001,6. El homopolímero de celulosa se sintetiza mediante complejos de celulosa sintasa incrustados por membrana plasmática (CSC)1,7. Las proteínas de celulosa individual sintasa A (CESA) sintetizan cadenas de glucano y las cadenas de glucano adyacentes están conectadas por enlaces de hidrógeno para formar celulosa cristalina1,8. La celulosa existe en varias formas cristalinas con dos formas predominantes, la celulosa Iα y la celulosa Iβ como formas nativas9. En plantas superiores, la celulosa existe en forma de celulosa Iβ mientras que la celulosa vegetal inferior existe en Iα forma10,11. En general, la celulosa desempeña un papel importante en la impartición de fuerza y rigidez a las paredes de las células vegetales.
Los biocombustibles de primera generación se producen principalmente a partir de almidón de maíz, azúcares de caña y azúcares de remolacha, que son fuentes de alimentos, mientras que los biocombustibles de segunda generación se centran en la producción de biocombustibles a partir del material celular de biomasa de plantas no alimentarias12. La estimación precisa del contenido de celulosa cristalina no sólo es importante para la investigación fundamental sobre la biosíntesis de celulosa y la dinámica de la pared celular, sino también para la investigación aplicada de biocombustibles y bioproductos. Varios métodos han sido desarrollados y optimizados para la estimación de la celulosa en la biomasa vegetal, y el método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El primer método notificado para la estimación de celulosa fue por Cross y Bevan en 190813. El método se basó en el principio de cloración y extracción alternativa por sulfato de sodio. Sin embargo, la celulosa obtenida por el método original, así como modificado de Cross y Bevan, mostró contaminación de pequeñas fracciones de lignina, además de una cantidad sustancial de xylans y mannans14. A pesar de varias modificaciones para eliminar la lignina y hemicellulosa de la fracción de celulosa, el método Cross-Bevan retuvo una cantidad considerable de mannans junto con celulosa. Más tarde, el método de Kurschner fue desarrollado mediante el empleo de ácido nítrico y etanol para extraer celulosa15. Este método indicó que se eliminaron el total de lignina y el 75% de los pentosanos, pero los verdaderos resultados de celulosa fueron los mismos que los estimados por el método de cloración de Cross y Bevan. Otro método (Norman y Jenkins) fue desarrollado mediante el empleo de metanol-benceno, sulfato de sodio, e hipoclorito de sodio para extraer celulosa16. Este método también retuvo alguna fracción de lignina (3%) y cantidades significativas de pentosanos que conducen a una estimación precisa de la celulosa. Más tarde, Kiesel y Semiganowsky utilizaron un enfoque diferente para hidrolizar la celulosa utilizando ácido sulfúrico concentrado al 80%, y los azúcares reducidos hidrolizados fueron estimados por el método17de Bertrand. Los dos métodos, Waksman's y Stevens18 y Salo14,19 que fueron desarrollados sobre la base del método de Kiesel y Semiganowsky, también produjeron un 4-5% menos de contenido de celulosa en comparación con los métodos anteriores20.
El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación del contenido de celulosa cristalina. Este método fue descrito por primera vez por Updegraff para la medición de celulosa en 196921. El método Updegraff integra el método Kurschner (uso de ácido nítrico), métodos Kiesel y Seminowsky (hidrólisis de celulosa en monómeros de glucosa utilizando ácido sulfúrico) con algunas modificaciones, y el ensayo de antronosis de Viles y Silverman para una estimación colorimétrica simple de glucosa y contenido de celulosa cristalina22. El principio de este método es el uso de ácido acético y ácido nítrico (reactivo updegraff) para eliminar la hemicellulosa y la lignina de los tejidos vegetales homogeneizados, que deja celulosa resistente a ácido acético/nítrico para su posterior procesamiento y estimación15. La celulosa resistente a los ácidos acéticos/nítricos se trata con un 67% de ácido sulfúrico para romper la celulosa en monómeros de glucosa y los monómeros de glucosa liberados se estiman mediante ensayo de antronidad21,23. Se utilizaron varias modificaciones del método Updegraff original para simplificar el procedimiento y la estimación de celulosa mediante ensayo de antronérona24. En términos generales, este método se puede dividir en cinco fases. En la primera fase, se prepara el material vegetal. En la segunda fase, la pared de células brutas está separada de la biomasa total, ya que la celulosa es el componente clave de las paredes celulares de las plantas. Más tarde, en la tercera fase, la celulosa se separa de los componentes de la pared celular no celulósica mediante el tratamiento con reactivo Updegraff. En la cuarta fase, la celulosa resistente al ácido acético/nítrico se divide en monómeros de glucosa mediante el tratamiento con ácido sulfúrico. El tratamiento con ácido sulfúrico de la celulosa da lugar a la formación de compuestos 5-hidroximetilfurfurales a partir de la reacción de monómeros de glucosa con ácido sulfúrico. Finalmente, en la última fase, la antrone genera un complejo azul verdoso hirviendo con el compuesto furfural generado en la fase anterior25. Este método colorimétrico basado en antrones fue utilizado por primera vez en 1942 por Dreywood. La antronétesis es un tinte que identifica compuestos furfurales de productos deshidratados de pentosa y hexose como 5-hidroximetilfurfurfural, en condiciones ácidas. La reacción con hexasa produce un color intenso y una mejor respuesta en comparación con las pentoses25. La cantidad de glucosa encuadernada se mide mediante absorbancia de espectrofotómetro a 620 nm y la intensidad del complejo azul verdoso es directamente proporcional a la cantidad de azúcar en la muestra. Los valores de absorbancia medidos se compararon con una línea de regresión de curva estándar de glucosa para calcular la concentración de glucosa de la muestra. El contenido medido de glucosa se utilizó para estimar el contenido de celulosa de la biomasa vegetal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A18-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>90-44-8</td>
			<td>For colorimetric assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>67-66-3</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>EM-EX0276-4S</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-090</td>
			<td>Positive control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SKU A6283</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For controlled temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>Used for drying plant sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Scale</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For specific quantities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol 100 %</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412-500</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate (96 well)</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>222-8030-01F</td>
			<td>For anthrone assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695041</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Microvials (2 mL) / screw capped tubes</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>10831</td>
			<td>For high temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer(Multimode Detector)</td>
			<td>Beckmancoulter DTX880</td>
			<td>1000814</td>
			<td>For measuring absorbances</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spex SamplePrep 6870 Freezer / Mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For grinding plant tissues into fine powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulphuric acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>02-004-382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151-21-3</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>&#160;1185-53-1</td>
			<td>Used in the PSB buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer (vacufuge plus)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>For drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>14-955-151</td>
			<td>For mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterbath</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>TSGP02PM05</td>
			<td>For temperature controlled conditions at specific steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-898-12A</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of crystalline cellulose content of plant biomass using the updegraff method

La celulosa es el polímero más abundante de la Tierra generado por la fotosíntesis y el principal componente portador de carga de las paredes celulares. La pared celular desempeña un papel significativo en el crecimiento y desarrollo de la planta al proporcionar fuerza, rigidez, tasa y dirección del crecimiento celular, mantenimiento de la forma celular, y la protección contra factores de estrés bióticos y abióticos. La pared celular se compone principalmente de celulosa, lignina, hemicellulosa y pectina. Recientemente, las paredes de las células vegetales han sido objeto de la producción de biocombustibles y bioenergía de segunda generación. Específicamente, el componente de celulosa de la pared celular de la planta se utiliza para la producción de etanol celulósico. La estimación del contenido de celulosa de la biomasa es fundamental para la investigación fundamental y aplicada de la pared celular. El método Updegraff es simple, robusto y el método más utilizado para la estimación del contenido cristalino de celulosa de la biomasa vegetal. La fracción de pared celular cruda insoluble en alcohol tras el tratamiento con reactivo Updegraff elimina las fracciones de hemicellulosa y lignina. Más tarde, la fracción de celulosa resistente a reactivos Updegraff se somete a un tratamiento con ácido sulfúrico para hidrolizador del homopolímero de celulosa en unidades monómeros de glucosa. Una línea de regresión se desarrolla utilizando varias concentraciones de glucosa y se utiliza para estimar la cantidad de glucosa liberada sobre la hidrólisis de celulosa en las muestras experimentales. Por último, el contenido de celulosa se estima en función de la cantidad de monómeros de glucosa mediante ensayo de antronétesis colorimétrica.

Las plantas de algodón cultivadas en la casa verde fueron seleccionadas para este estudio. Se seleccionaron dos líneas experimentales diferentes de algodón para el análisis comparativo del contenido de celulosa. Para cada línea experimental, el tejido radicular se recogió de tres réplicas biológicas. Un total de 500 mg de tejido fue homogeneizado y 20 mg de él se utilizó para la extracción de pared de células crudas. Más tarde, 5 mg de extracto de pared celular cruda se utilizó para el tratamiento reactivo ...

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Estimation of Crystalline Cellulose Content of Plant Biomass using the Updegraff Method

El método Updegraff es el método más utilizado para la estimación de celulosa. El objetivo principal de esta demostración es proporcionar un protocolo detallado de Updegraff para la estimación del contenido de celulosa en muestras de biomasa vegetal.

Estimación del contenido de celulosa cristalina de biomasa vegetal utilizando el método Updegraff

Cellulose is the most abundant polymer on Earth generated by photosynthesis and the main load-bearing component of cell walls. The cell wall plays a ...

Aquí, demostramos el método Updegraff, el método más utilizado del mundo para la estimación del contenido de celulosa cristalina. La celulosa se compone básicamente de monómeros de glucosa vinculados por enlaces beta-1, 4 glicosidos. Dividimos este protocolo en cinco fases.En la primera fase, preparamos el material de biomasa vegetal. En la segunda fase, extraemos la pared de la célula cruda. En la tercera fase, utilizamos el tratamiento updegraff en el que Updegraff se compone de ácido acético y ácido nítrico que ayuda en la eliminación de hemicelulosa y lignina de nuestras muestras.En la cuarta fase, lo sometemos a hidrólisis ácida con la ayuda de ácido sulfúrico que produce los monómeros de glucosa. Finalmente, en la quinta fase, utilizamos ensayos de antrones para estimar el contenido cristalino de celulosa. Recoger el material vegetal del invernadero, lavarlos a fondo con agua, secar al aire durante dos días, separar el tejido y transferir el tejido a los recipientes etiquetados individualmente e incubar en la incubadora a 49 grados centígrados durante 10 días.A continuación, corte en pedazos con tijeras o cuchilla. Congele el tejido y cargue en mortero y pestle para moler finamente en polvo uniforme o, alternativamente, utilice congelador/molino. Aquí, demostramos el uso de congelador / molino, por lo que cargamos nuestras muestras de tejido en estos viales de molienda y las colocamos en el congelador / molino y ejecutar la velocidad de 10 CP durante tres ciclos.El polvo de tejido se recoge en el tubo Falcon como se muestra aquí. Pesar 20 mg del tejido en polvo y transferir en un tubo de dos ml prepesado. Añadir un ml de tampón de solubilización proteica para eliminar las proteínas. vórtice.Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Repita este paso dos veces más.Añadir un ml de agua estéril al pellet retenido. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Repita este paso dos veces más.Agregue un ML de 70% de etanol al pellet retenido. vórtice. Transfiéralo a un bloque precalentado de 70 grados centígrados con agitación simultánea durante una hora. Después de una hora de incubación, centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos.Repita este paso una vez más. Al pellet salvado, añadir un mL de 100% metillona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos.Añadir un ml de metanol cloroformo. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue un ml de acetona. vórtice.Incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Vuelva a desechar el sobrenadante y seque al aire a 37 grados centígrados durante la noche o continúe secando al vacío.Cargue sus muestras en el secador de vacío y seque al aire durante dos o tres horas o hasta que el pellet esté completamente seco. Pesar cinco mg del extracto de pared celular obtenido del paso anterior. Transfiéralo a un tubo de tapa de tornillo de dos ml.También incluya un control positivo en este punto. Utilice dos mg de papel filtrante Whatman para ese propósito. Transfiéralo a un tubo de tapa de tornillo de dos ml.Agregue 1,5 ml de reactivo Updegraff a cada extracto de pared celular pesada. Vórtice e incubar a 100 grados centígrados en un bloque precalentado durante 30 minutos. Después de 30 minutos de incubación, transfiéralo a un estante.Deje que se enfríe en el banco durante 10 minutos. Centrífuga a 15.000 RPM durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar al pellet.Agregue un ml de agua estéril. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante 10 minutos. Deseche 500 microlitros del sobrenadante.Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche un ml del sobrenadante.Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante por completo.Añadir un ml de acetona. vórtice. Centrífuga a 15.000 RPM durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante.Secar a 37 grados centígrados durante la noche. Después de una incubación de una noche, transfiéralo a un estante. Añadir un ml de ácido sulfúrico al 67%. vórtice.Incuba a 25 grados centígrados durante una hora con temblores simultáneos. Después de una hora de incubación, asegúrese de que el pellet esté completamente disuelto. Transfiéralo a un estante.Este es el paso final de la extracción de celulosa. Ahora las muestras están listas para la dilución de la muestra. Para la dilución de muestras, utilice 10 microlitros de cada muestra del paso anterior y agregue 490 microlitros de agua estéril.Repita esto para todas las muestras experimentales. Para la preparación de curva estándar de glucosa, preparar un caldo fresco de un mg por ml de glucosa y preparar cero microgramos a 200 microgramos concentraciones mediante la adición de un mg por ml de glucosa en 20 incrementos de microlitro y hacer el volumen final a un mL con agua estéril. Tome 500 microlitros de cada estándar preparado en un tubo de tapa de tornillo y agregue un mL 0.2% de antronérona.Y ahora las muestras están listas para el ensayo de antrones. Agregue un ml de antronérona recién preparada. Mezcle inmediatamente con el vórtice y transfiéralo al hielo.Repita para todos los estándares y muestras de la misma manera. A continuación, transfiéralo a un bloque precalentado de 100 grados centígrados durante 10 minutos. Después de 10 minutos de incubación, transfiéralo al hielo e incuba durante cinco minutos sobre hielo.Después de la incubación, tome 200 microlitros de cada muestra en tres réplicas. Repita tanto para estándares como para muestras de la misma manera. Y una placa cargada de 96 pozos fue cargada en un detector multimodo.Con el programa Smart Max Pro, establecemos la configuración del filtro en 620 nanómetros. Tipo de placa a tipo de 96 pozos. Seleccione toda el área de lectura.Haga clic en Aceptar. leer. Lea la placa. Obtendrá las lecturas de absorbancia de estándares y muestras, que se recopilarán en la hoja de Excel para su posterior análisis y estimación del contenido de celulosa.La curva estándar de glucosa se prepara utilizando las concentraciones de glucosa en microgramos por ml en el eje X y los valores de absorbancia normalizados de la concentración respectiva a 620 nanómetros en el eje y. Obtenemos la línea de regresión con valores m y c en el gráfico de dispersión trazado que usamos para estimar el contenido de celulosa cristalina de muestra. En el primer paso, promediamos los valores de OD en 620 nanómetros.Y luego normalizamos los datos restando el valor en blanco. Calculamos que la concentración de glucosa utilizando la fórmula x es igual a OD menos c/m donde conectamos valores c y m del paso anterior de la línea de regresión en la curva estándar. Dado que el volumen total que se utilizó para el ensayo de antrones es de 500 microlitros, lo dividimos por el factor dos de dilución.Dado que el volumen de la muestra que se utilizó fue de sólo 10 microlitros, dividiremos aún más por 10 para obtener microgramos por concentración de microlitro de glucosa que es igual a mg por concentración de ml. Y luego usamos el factor de humedad 1.11 que es la ganancia de humedad en el proceso. Y finalmente, calculamos el porcentaje de contenido de celulosa cristalina dividiéndolo con el peso de la pared celular, que está cerca de cinco mg, y multiplicar por 100 para obtener el porcentaje.Luego promediamos el contenido de celulosa cristalina de tres réplicas biológicas para obtener el valor de las muestras individuales, que se compararán con otro promedio de línea experimental de tres réplicas biológicas. Y la prueba t se puede utilizar para probar su nivel de importancia. Aquí, en la tabla A, mostramos los valores de tabla de la concentración y el OD respectivo en 620 nanómetros, que se utilizó aún más para trazar un gráfico de dispersión y una línea de regresión con los valores m y c que se utilizaron en la C para obtener las diferencias de contenido de celulosa entre las dos líneas experimentales.En conclusión, ambas muestras muestran diferencias de celulosa. Gracias por mirar.

Research

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