Name: assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم (#1827521 #1827521 #1450370) والمعاهد الوطنية للصحة (U01HL127518). تم توفير خدمات التصوير الضوئي من قبل جامعة لويز مايكرو / نانو مركز التكنولوجيا.

تم جمع تبرعات الدم الكاملة من المتبرعين الأصحاء بعد البروتوكولات التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية في جامعة لويز.
1. تصنيع الجهاز acoustofluidic
<ol><li>الحصول على قناع ضوئي مع تصميم حلزوني متحد المركز يحتوي على قنوات بقطر 500 ميكرومتر. يتم توفير ملف CAD في الملفات التكمي?...

<ol>
	<li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy.">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li><li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells.">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li><li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery.">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li><li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+and+experimental+demonstration+of+the+electric+field+assisted+electroporation+microchip+for+in+vitro+gene+delivery+enhancement.">Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement.</a> Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).</li><li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.">Stochastic model for electric field-induced membrane pores.</a> Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues.">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li><li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR/Cas9-based+genome+editing.">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315 (2015).</li><li>Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+contrast+agents:+targeted+ultrasound+imaging+and+ultrasound-assisted+drug-delivery+applications.">Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.</a> Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).</li><li>Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-triggered+release+of+materials+entrapped+in+microbubble-liposome+constructs:+a+tool+for+targeted+drug+delivery.">Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).</li><li>Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+microbubble-facilitated+sonoporation+for+drug+and+gene+delivery.">Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery.</a> Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).</li><li>Secomski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultrasound+experiments:+Standing+wave+and+multiple+reflections+influence+on+the+outcome.">In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome.</a> Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).</li><li>Gedge, M., Hill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+17:+theory+and+applications+of+surface+acoustic+wave+devices+for+particle+manipulation.">Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+tweezers:+patterning+cells+and+microparticles+using+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).</li><li>Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li><li>Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles.">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).</li><li>Belling, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+sonoporation+for+gene+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).</li><li>Centner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+molecular+delivery+to+erythrocytes+using+a+microfluidic+system.">Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).</li><li>Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+developing+CAR+T-cell+therapy+for+HIV+cure.">Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure.</a> Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).</li><li>Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+future+of+CAR+T+cells+for+B-Cell+Acute+lymphoblastic+leukemia.">The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).</li><li>Hand, S. C., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+for+improving+desiccation+tolerance:+insights+from+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana.">Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Planta. 242 (2), 379-388 (2015).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+mammalian+cells+using+trehalose:+preservation+of+DNA+integrity.">Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).</li><li>Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+Cell+recovery+and+viability,+population+composition,+and+cell+functionality.">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation.">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li><li>Kopechek, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth.">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li><li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells.">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li><li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells.">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system.">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يعزز التسليم داخل الخلايا للجزيئات الحيوية لتطبيقات البحث. هناك العديد من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها عند تجميع وتشغيل هذا النظام. الجهاز acoustofluidic هو ملفقة في PDMS، وهو مادة متوافقة بيولوجيا التي يمكن بسهولة مصبوب مع أبعا...

وقد استخدمت منصات الفيروسية وغير الفيروسية لتعزيز التسليم الجزيئي للخلايا. التسليم الفيروسي (النقل) هو تقنية شائعة تستخدم في العلاجات القائمة على الخلايا التي تتطلب التعديل الجينومي. وتشمل القيود مع التسليم الفيروسية تولد الغرز المحتملة، والقدرة المعدلة وراثيا محدودة، وتعدد غير مرغوب فيه من العدوى1،2. لذلك ، يتم تطوير تقنيات التسليم الجزيئي غير الفيروسية لمجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية والبحثية. وتشمل التقنيات الشائعة الميكانيكية والكهربائية والديناميكية المائية، أو استخدام الطاقة القائمة على الليزر لتعزيز امتصاص الجزيئات الحيوية في الخلايا 3. Electroporation هو منصة توصيل جزيئية غير فيروسية شائعة الاستخدام لديها القدرة على إحداث ثقب عابر في غشاء البلازما للتسليم داخل الخلايا للمركبات الجزيئية4و5و6و7و8و9. ومع ذلك ، فإن ثقب عابر لغشاء البلازما هو عملية عشوائية ويعتمد الامتصاص الجزيئي عبر الكهربوئس بشكل عام على الانتشار السلبي عبر مسام الغشاء العابر4و7و8.
وهناك طريقة بديلة هي استخدام الموجات فوق الصوتية لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا عن طريق التجويف من وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية (أي الفقاعات الصغيرة المليئة بالغاز). التجويف Microbubble يحفز آثار microstreaming في وسائل الإعلام المحيطة بها والتي يمكن أن تسبب ثقب عابرة من أغشية البلازما القريبة ("سونوبوبينيشن") السماح امتصاص سريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية عن طريق آليات النقل السلبي أو النشط10،11،12. Sonoporation هو تقنية فعالة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا ، ولكن هذا النهج غالبا ما يتطلب معدات باهظة الثمن وطرق العلاج السائبة التي تحد منها انخفاض الإنتاجية وارتفاع التباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية13. لمعالجة هذه القيود، يجري حاليا تطوير أجهزة acoustofluidic، التي تمكن من وجود سونوبوينيشن متسق للخلايا المعلقة.
Acoustofluidics هو مجال آخذ في التوسع يدمج تقنيات الموجات فوق الصوتية والموجات الدقيقة لمجموعة واسعة من التطبيقات. وقد سبق استخدام هذا النهج لفصل الجسيمات عن طريق تطبيق الطاقة المستمرة بالموجات فوق الصوتية للحث على الموجات الصوتية الدائمة داخل القنوات السائلة14،15،16،17. يتم فرز الجسيمات نحو أجزاء مختلفة من الجهاز استنادا إلى مجموعة متنوعة من الخصائص مثل حجم الجسيمات والكثافة والضغوط بالنسبة إلى المتوسط16. كما أن تقنيات Acoustofluidic قيد التطوير لتمكين التسليم الجزيئي السريع لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا لتطبيقات البحث وتصنيع علاجات الخلايا18. في الآونة الأخيرة، أظهرنا تعزيز التسليم الجزيئي لكريات الدم الحمراء باستخدام جهاز acoustofluidic المستندة إلى PDMS19. في منصة acoustofluidic ، يمكن التلاعب ديناميات الخلية والفقاعات الدقيقة للحث على التفاعلات المادية التي تمكن من تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية. يمكن زيادة كفاءة واتساق التسليم الجزيئي داخل الخلايا من خلال تحسين المسافة بين الخلايا والفقاعات الدقيقة.
أحد التطبيقات الهامة ل aoustofluidic بوساطة سونوبوديشن ينطوي على نقل الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية الأولية. العلاجات المناعية على أساس نقل الخلايا التائية بالتبني، مثل العلاج مستقبلات مستضد Chimeric T الخلية (CAR T)، تظهر بسرعة لعلاج مختلف الأمراض، بما في ذلك السرطان والفيروسات مثل فيروس نقص المناعة البشرية20. كان العلاج CAR T فعالا بشكل خاص في مرضى سرطان الدم الليمفاوي الحاد للأطفال (ALL) ، مع معدلات مغفرة كاملة من 70-90٪21. ومع ذلك، يعتمد تصنيع الخلايا التائية لهذه العلاجات بشكل عام على النقل الفيروسي الذي يحد منه تكوين الغرز المحتمل، وأوقات المعالجة الطويلة، والتحديات المتمثلة في تقديم الجزيئات الحيوية غير الوراثية مثل البروتينات أو الجزيئات الصغيرة1. يمكن لطرق التوصيل الجزيئي بوساطة Acoustofluidic التغلب على هذه القيود وتحسين تصنيع علاجات الخلايا التائية.
وثمة تطبيق هام آخر لمسألة السونوبونيد بوساطة ألوستوفلويديك ينطوي على تسليم المركبات الحافظة داخل الخلايا، مثل التريهالوز، التي تحمي الخلايا أثناء التجميد وإزالة الكبريت. يتم إنتاج تريهالوز من قبل بعض الكائنات الحية في الطبيعة ويساعدهم على تحمل التجميد و المجفف عن طريق حماية أغشيتهم الخلوية22،23. ومع ذلك ، لا تنتج التريهالوز من قبل خلايا الثدييات وغير منفذة لأغشية خلايا الثدييات. لذلك ، فإن تقنيات التسليم الجزيئي الفعالة ، مثل السونوبوديشن ، ضرورية من أجل تحقيق مستويات تريهالوز كافية داخل الخلايا المطلوبة لحماية الأغشية الخلوية الداخلية. ويجري حاليا تطوير هذا النهج من أجل الحفاظ الجاف على أنواع مختلفة من الخلايا.
يوفر هذا البروتوكول وصفا مفصلا لتجميع وتشغيل نظام acoustofluidic منخفض التكلفة نسبيا مدفوعا بتحكم دقيق. وتستخدم عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية للحث على ال سونوبوليشن داخل القنوات السائلة وتمكين التسليم الجزيئي السريع لأنواع مختلفة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية والخلايا السرطانية. يمكن استخدام هذا النظام acoustofluidic لمجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية، ويمكن أيضا أن تكون مفيدة كنظام نموذجي لتقييم أساليب سونوبوينج لتحسين عمليات تصنيع العلاج بالخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fabrication of Acoustofluidic Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862 (SKU)</td>
			<td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69039-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td>
			<td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-430</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>105732-02-3 (Cas. No.)</td>
			<td>Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon PVC soft plastic tubing (1/16&#34; ID, 1/8&#34; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K51 (Part #)</td>
			<td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly of Acoustofluidic System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Uno</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>7630049200050 (Barcode)</td>
			<td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Ultrasound Contrast Agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890703P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/890703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850365P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/850365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840465P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/840465</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APF-140HP (decafluorobutate gas)</td>
			<td>FlouroMed</td>
			<td>355-25-9 (Cas No.)</td>
			<td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-338 Amalgamators&#160;</td>
			<td>COXO</td>
			<td></td>
			<td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylene 40 stearate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3440-250G (SKU)</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&#38;region=US&#38;gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110 (Ref.)</td>
			<td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&#38;_sid=406df3776&#38;_ss=r</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Primarty T Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACs running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail &#38; Pan T-Cell MicroBead Cocktail)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-535 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of A549 Lung Cancer Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose Assay Kit&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-TREH (Cat. No.)</td>
			<td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702 (Cat. No.)</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells

مطلوب تسليم فعال داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية لمجموعة واسعة من البحوث الطبية الحيوية والتطبيقات العلاجية القائمة على الخلايا. الموجات فوق الصوتية بوساطة سونوبوينج هو تقنية ناشئة للتسليم السريع داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية. يحدث التجويف عندما يشكل تجويف الفقاعات الدقيقة المملوءة بالغاز مساما عابرة في أغشية الخلايا القريبة ، مما يتيح امتصاصا سريعا للجزيئات الحيوية من السائل المحيط. التقنيات الحالية ل سونوبوبينيشن في المختبر من الخلايا في تعليق محدودة من قبل الإنتاجية البطيئة، والتباين في ظروف التعرض بالموجات فوق الصوتية لكل خلية، وارتفاع التكلفة. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة الذي يدمج محول الموجات فوق الصوتية في جهاز السائل القائم على PDMS للحث على سونوبوديشن متسقة من الخلايا لأنها تتدفق من خلال القنوات بالاشتراك مع وكلاء التباين بالموجات فوق الصوتية. يتم تصنيع الجهاز باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية لإنتاج رقاقة السائل المستندة إلى PDMS. يتم إرفاق محول قرص بيزو بالموجات فوق الصوتية بالجهاز ويقوده متحكم دقيق. يمكن دمج التجميع داخل علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد لمزيد من الحماية. يتم دفع الخلايا والفقاعات الدقيقة من خلال الجهاز باستخدام مضخة حقنة أو مضخة معجبة متصلة بأنابيب PVC. ويتجلى تعزيز تسليم الجزيئات الحيوية إلى الخلايا التائية البشرية وخلايا سرطان الرئة مع هذا النظام acoustofluidic. بالمقارنة مع نهج العلاج السائبة ، يزيد هذا النظام acoustofluidic الإنتاجية ويقلل من التباين ، مما يمكن أن يحسن طرق معالجة الخلايا لتطبيقات البحوث الطبية الحيوية وتصنيع العلاجات القائمة على الخلايا.

تظهر صورة للنظام acoustofluidic المجمعة داخل حالة مطبوعة ثلاثية الأبعاد في الشكل 1. ينتج هذا البروتوكول نظام acoustofluidic التي يمكن استخدامها لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا في خطوط الخلايا المتعددة باستخدام عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.
الشكل 2</...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل جهاز acoustofluidic منخفض التكلفة للتسليم الجزيئي السريع للخلايا عن طريق سونوبوبينيد الناجم عن عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية.

تجميع وتشغيل جهاز Acoustofluidic لتعزيز تسليم المركبات الجزيئية إلى الخلايا

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

يصف هذا البروتوكول تجميع وتشغيل نظام acoustofluidic الذي يمكنه تقديم الجزيئات الحيوية بكفاءة لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية القائمة على الأبحاث والخلايا. الميزة الرئيسية لهذا النظام هو أنه يسمح التسليم السريع للجزيئات الحيوية إلى الخلايا مع الحفاظ على قدرتها على البقاء. وهي تقنية منصة تسمح بتحويل الخلايا لمجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية الخلوية، مثل علاج السرطان.تبدأ من خلال الجمع بين 54 غراما من قاعدة PDMS وستة غرامات من عامل علاج في كوب. تخلط بقوة ودقة مع ملعقة لمدة دقيقة واحدة على الأقل، ثم وضع الكأس مع حل PDMS في مجفف لمدة 30 دقيقة تقريبا أو حتى تتم إزالة بقايا فقاعات الهواء. ضع رقاقة مغلفة بمرسى ضوئي مع الأنماط التي تواجه التصاعدي في طبق بيتري 150 ملليمتر ، ثم صب محلول PDMS على القالب.إذا لزم الأمر، ضع طبق بيتري داخل مجفف وتطبيق فراغ حتى تختفي فقاعات الهواء المتبقية. نقل طبق بيتري إلى فرن المختبر وخبز لمدة ساعتين في 60 درجة مئوية لعلاج PDMS. بعد المعالجة، قم بإزالة PDMS بعناية من طبق بيتري عن طريق القطع حول حواف الرقاقة بشفرة حلاقة.قطع كل جهاز على حدة باستخدام سكين أو شفرة حلاقة، ثم ثقب ثقوب من خلال مدخل ومنافذ باستخدام لكمة خزعة 2.5 ملليمتر. بعد علاج جهاز PDMS ببلازما الأكسجين ، ضع كل جهاز على الفور على شريحة مجهر زجاجي نظيف من الجير الصودا مع قنوات تواجه السطح الزجاجي. السماح للأجهزة السندات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.ضعي السيليكون برفق على سطح محول بيزو قطره سنتيمتر واحد بسماكة من 1 إلى 2 ملليمتر، ثم قم بمحاذاة المحول بعناية مع دوامة متحدة المركز واضغط عليه برفق على الجزء السفلي من شريحة المجهر الزجاجي. قم بتوصيل وحدة تحكم دقيقة بجهاز كمبيوتر باستخدام كبل USB A إلى B. وينبغي أن تضيء مؤشرات LED الطاقة الخضراء.استخدم البرنامج المقترن على الكمبيوتر لتحميل برنامج يقوم بإنشاء إشارة ثمانية ميغاهيرتز. لحام واحد بوصة 22 قياس الأسلاك إلى نهاية كل سلك على محول PZT. ثم استخدامه لتوصيل السلك الطرفي السلبي من محول PZT إلى دبوس GND.قم بتوصيل سلك المحطة الطرفية الإيجابي لمحول PZT إلى دبوس الإخراج عبر السلك اللحام. قطع ثلاثة إلى ستة أقسام بوصة من أنابيب البلاستيك الناعمة التيجون PVC ودفع الأنابيب في مدخل ومنافذ. قد يكون من الضروري تدوير الأنابيب مع ممارسة الضغط حتى تناسبها في الفتحة.اختياريا، يمكن تطبيق الغراء عند تقاطع السندات PDMS والأنابيب معا. اختياريا، قم بتركيب الجهاز المتناوب والمتحكم الدقيق في علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد. تجميع خزان microfluidic وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قطع مقطع من ثلاثة إلى ستة بوصة من 1/16 بوصة القطر الداخلي تايغون PVC أنابيب بلاستيكية لينة ودفعه على أنابيب قطرها الداخلي 1/32 بوصة من إخراج خزان microfluidic. اختياريا، التفاف تقاطع مع فيلم البارافين لمنع التسرب. املأ حقنة 60 ملليلتر بالهواء المحيط على جانب الخزان الدقيق.تعيين مضخة حقنة بمعدل 200 ملليلتر في الساعة لدفع حلول عامل التباين من خلال الجهاز acoustofluidic بمعدل تدفق الحجمي من 50 ملليلتر في الساعة وجمع العينات من إخراج الجهاز في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. إعداد محلول phopholipid في قارورة التلألؤ 20 ملليلتر بإضافة 25 ملليغرام من DSPC، 11.6 ملليغرام من DSEPC، 0.26 ملليغرام من DSPG، و 0.88 ملليغرام من البوليوكسي إيثيلين 40 stearate. إضافة الكلوروفورم حتى يتم حل جميع فوسفوليبيدات.تبخر الكلوروفورم في مجفف لمدة 48 ساعة لتشكيل فيلم الدهون الجافة. إعادة ترطيب الرغوة مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقم، ثم سونيكاتي محلول الدهون لمدة ثلاث دقائق في 40٪ السعة لتشكيل محلول micellar cationic. بعد سونيكيشن، يمكن تخزين محلول phopholipid في درجتين إلى ست درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.لإعداد عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية، إضافة 200 ميكرولتر من محلول micellar cationic في 600 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني معقم إلى قارورة حاجز زجاجي ملليلتر اثنين. ختم القارورة عن طريق تجعيد الغطاء. استخدام إبرة قياس 1.5 بوصة 20 لملء الفضاء رأس قارورة مع غاز ديكافلوروبوتان لمدة 30 ثانية.دمج القارورة لتشكيل عوامل التباين الموجات فوق الصوتية المليئة بالغاز perfluorobutane. إضافة 25 ميكرولتر من الموجات فوق الصوتية حل عامل التباين لكل ملليلتر واحد من محلول الخلية. ثم ضخ فورا عامل التباين المشترك وخليط الخلية من خلال الجهاز acoustofluidic.ينتج هذا البروتوكول نظاما acoustofluidic التي يمكن استخدامها لتعزيز التسليم الجزيئي داخل الخلايا في خطوط الخلايا المتعددة. تم تحسين التسليم داخل الخلايا لمركب فلوري ، الفلورسين ، إلى الخلايا التائية البشرية الأولية مع العلاج acoustofluidic مقارنة بمجموعة مراقبة غير معالجة. زادت كثافة الفلورية للخلايا التائية بمقدار خمسة أضعاف بعد العلاج ، مما يشير إلى تعزيز تسليم الفلورسين.انخفضت صلاحية الخلية قليلا بعد علاج acoustofluidic ، ولكنها ظلت أعلى من 80٪ العلاج Acoustofluidic تعزيز التسليم داخل الخلايا من تريهالوز مركب حافظة لخلايا سرطان الرئة A549 الإنسان مقارنة بالتدفق وحده والخلايا في مجموعة التحكم غير المعالجة. إضافة الفقاعات الدقيقة cationic إلى حل الخلية أمر بالغ الأهمية. وسوف يكون التسليم داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية محدودة دون الفقاعات الدقيقة cationic في الحل.هذه المنصة تمكن التسليم داخل الخلايا من الجزيئات الحيوية المختلفة، والتي يمكن أن تغير وظيفة الخلوية لأغراض البحث أو العلاجية. بعد الانتهاء من هذا الإجراء، يمكن إجراء توصيف خلوي إضافي لتقييم تأثير تسليم الجزيئات الحيوية المختلفة.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

الميكروسكيل Electroporator لتوصيل متسلسل الجزيئية بمساعدة دوامة

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

توليف Cationized Magnetoferritin للمغنطة فائقة السرعة من الخلايا

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

تطوير Biosensor الكهروكيميائية الحمض النووي للكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

تجميع نماذج محاكاة الخلايا المدعومة والموقوفة ثنائية الطبقات لدراسة التفاعلات الجزيئية

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

الخلايا الليفية المشتقة من النسيج الضام البشري المهندسة لتطبيقات الفحص

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...