Name: assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה במימון הקרן הלאומית למדע (#1827521, #1827521, #1450370) ומכוני הבריאות הלאומיים (U01HL127518). שירותי פוטוליתוגרפיה ניתנו על ידי המרכז הטכנולוגי מיקרו / ננו של אוניברסיטת לואיוויל.

תרומות דם שלמות נאספו מתורמים בריאים בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית באוניברסיטת לואיוויל.
1. ייצור של מכשיר אצוטופלואידי
<ol><li>להשיג מסכת פוטו עם עיצוב ספירלה קונצנטרי המכיל ערוצים עם קוטר של 500 מיקרומטר. קובץ CAD מסופק בקבצים המשלימים כדוגמה. נ?...

<ol>
	<li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy.">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li><li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells.">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li><li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery.">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li><li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+and+experimental+demonstration+of+the+electric+field+assisted+electroporation+microchip+for+in+vitro+gene+delivery+enhancement.">Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement.</a> Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).</li><li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.">Stochastic model for electric field-induced membrane pores.</a> Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues.">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li><li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR/Cas9-based+genome+editing.">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315 (2015).</li><li>Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+contrast+agents:+targeted+ultrasound+imaging+and+ultrasound-assisted+drug-delivery+applications.">Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.</a> Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).</li><li>Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-triggered+release+of+materials+entrapped+in+microbubble-liposome+constructs:+a+tool+for+targeted+drug+delivery.">Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).</li><li>Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+microbubble-facilitated+sonoporation+for+drug+and+gene+delivery.">Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery.</a> Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).</li><li>Secomski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultrasound+experiments:+Standing+wave+and+multiple+reflections+influence+on+the+outcome.">In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome.</a> Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).</li><li>Gedge, M., Hill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+17:+theory+and+applications+of+surface+acoustic+wave+devices+for+particle+manipulation.">Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+tweezers:+patterning+cells+and+microparticles+using+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).</li><li>Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li><li>Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles.">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).</li><li>Belling, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+sonoporation+for+gene+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).</li><li>Centner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+molecular+delivery+to+erythrocytes+using+a+microfluidic+system.">Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).</li><li>Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+developing+CAR+T-cell+therapy+for+HIV+cure.">Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure.</a> Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).</li><li>Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+future+of+CAR+T+cells+for+B-Cell+Acute+lymphoblastic+leukemia.">The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).</li><li>Hand, S. C., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+for+improving+desiccation+tolerance:+insights+from+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana.">Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Planta. 242 (2), 379-388 (2015).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+mammalian+cells+using+trehalose:+preservation+of+DNA+integrity.">Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).</li><li>Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+Cell+recovery+and+viability,+population+composition,+and+cell+functionality.">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation.">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li><li>Kopechek, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth.">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li><li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells.">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li><li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells.">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system.">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מערכת אצוטופלוידית בעלות נמוכה אשר משפרת את המסירה התאית של biomolecules עבור יישומי מחקר. ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הרכבה והפעלה של מערכת זו. המכשיר acoustofluidic הוא מפוברק PDMS, שהוא חומר תואם ביולוגית שניתן לעצב בקלות עם מידות ערוץעק?...

פלטפורמות ויראליות ולא ויראליות נוצלו כדי לשפר את המסירה המולקולרית לתאים. משלוח ויראלי (transduction) היא טכניקה נפוצה המשמשת 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 מגבלות עם משלוח ויראלי כוללות mutagenesis החדרה פוטנציאלית, יכולת מהונדסת מוגבלת, ריבוי לא רצוי של זיהום1,2. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי לא ויראליות נמצאות בפיתוח עבור מגוון רחב של יישומי ביו-רפואה ומחקר. טכניקות נפוצות כוללות מכני, חשמלי, הידרודינמי, או שימוש באנרגיה מבוססת לייזר כדי לשפר את ספיגת הביומולקולים לתאים 3. Electroporation היא פלטפורמת משלוח מולקולרית לא ויראלית נפוצה אשר יש את היכולת לגרום ניקוב חולף בקרום הפלזמה עבור משלוח תאי שלתרכובות מולקולריות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, ניקוב חולף של קרום הפלזמה הוא תהליך סטוכסטי וספיגה מולקולרית באמצעות אלקטרופורציה תלויה בדרך כלל דיפוזיה פסיבית על פני נקבוביות הממברנה החולפת4,7,8.
שיטה חלופית היא ניצול של אולטרסאונד עבור משלוח מולקולרי תאי משופר באמצעות cavitation של סוכני ניגוד אולטרסאונד (כלומר, microbubbles מלא גז). cavitation microbubble גורם אפקטים microstreaming במדיה שמסביב אשר יכול לגרום ניקוב חולף של ממברנות פלזמה סמוכות ("sonoporation") המאפשר ספיגה תאית מהירה של biomolecules באמצעות מנגנוני תחבורה פסיביים או פעילים10,11,12. Sonoporation היא טכניקה יעילה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים, אבל גישה זו דורשת לעתים קרובות ציוד יקר ושיטות טיפול בתפזורת אשר מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר בתנאיחשיפה אולטרסאונד 13. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, התקנים acoustofluidic, המאפשרים sonoporation עקבי של תאים בהשעיה, נמצאים כעת בפיתוח.
Acoustofluidics הוא תחום מתרחב המשלב אולטרסאונד וטכנולוגיות microfluidic עבור מגוון רחב של יישומים. גישה זו שימשה בעבר להפרדת חלקיקים על ידי החלת אנרגיית אולטרסאונד רציפה כדי לגרום לגלים אקוסטיים עומדים בתוך הערוצים הנוזליים14,15,16,17. חלקיקים ממוינים לחלקים שונים של המכשיר בהתבסס על מגוון מאפיינים כגון גודל החלקיקים, צפיפות ודחיסה ביחס למדיום16. טכנולוגיות Acoustofluidic נמצאים גם בפיתוח כדי לאפשר אספקה מולקולרית מהירה למגוון סוגי תאים עבור יישומי מחקר וייצור של שירותי תאים18. לאחרונה, הדגמנו משלוח מולקולרי משופר לאריתרוציטים באמצעות מכשיר אצוטופלואידי מבוסס PDMS19. בפלטפורמה האקוסטופולידית, ניתן לתמרן את הדינמיקה של התא והמיקרו-יבלים כדי לגרום לאינטראקציות פיזיות המאפשרות אספקה משופרת של ביומולקולים. היעילות והעקביות של אספקה מולקולרית תאית יכולות להיות מוגברות על ידי אופטימיזציה של המרחק בין תאים ומיקרו-יבלים.
יישום חשוב אחד עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך הובלה של biomolecules לתוך תאי T אנושיים ראשוניים. אימונותרפיות המבוססות על העברת תאי T מאמצת, כגון טיפול בתא T קולטן אנטיגן כימרי (CAR T), מתעוררות במהירות לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ווירוסים כגון HIV20. טיפול CAR T היה יעיל במיוחד בחולי לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים (ALL), עם שיעורי הפוגה מלאה של 70-90%21. עם זאת, ייצור תאי T לטיפולים אלה תלוי בדרך כלל בהתמרות ויראלית המוגבלת על ידי מוטגנזה פוטנציאלית, זמני עיבוד ארוכים ואתגרים של אספקת ביומולקולות לא גנטיות כגון חלבונים או מולקולות קטנות1. שיטות אספקה מולקולריות בתיווך אצטופולי יכול להתגבר על מגבלות אלה ולשפר את הייצור של טיפולים בתאי T.
יישום חשוב נוסף עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך משלוח תאי של תרכובות משמרות, כגון trehalose, אשר להגן על תאים במהלך הקפאה וייבוש. Trehalose מיוצר על ידי כמה אורגניזמים בטבע ומסייע להם לסבול הקפאה וייבוש על ידי הגנה על הממברנות התאיות שלהם22,23. עם זאת, trehalose אינו מיוצר על ידי תאים יונקים והוא אטום קרום התא יונקים. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי יעיל, כגון sonoporation, נחוצים על מנת להשיג רמות טרהלוז תאיות מספיק הנדרש כדי להגן על ממברנות תאיות פנימיות. גישה זו נמצאת כעת בפיתוח לשימור יבש של סוגי תאים שונים.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של ההרכבה וההפעלה של מערכת אקוסטופלואידית בעלות נמוכה יחסית המונעת על ידי מיקרו-בקר. סוכני ניגודיות אולטראסאונד מנוצלים כדי לגרום sonoporation בתוך הערוצים הנוזליים ולאפשר משלוח מולקולרי מהיר לסוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאים סרטניים. מערכת אצוטופלוידית זו יכולה לשמש עבור מגוון יישומי מחקר, עשוי גם להיות שימושי כמערכת אב טיפוס להערכת שיטות sonoporation עבור תהליכי ייצור טיפול בתאים משופרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fabrication of Acoustofluidic Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862 (SKU)</td>
			<td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69039-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td>
			<td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-430</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>105732-02-3 (Cas. No.)</td>
			<td>Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon PVC soft plastic tubing (1/16&#34; ID, 1/8&#34; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K51 (Part #)</td>
			<td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly of Acoustofluidic System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Uno</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>7630049200050 (Barcode)</td>
			<td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Ultrasound Contrast Agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890703P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/890703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850365P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/850365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840465P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/840465</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APF-140HP (decafluorobutate gas)</td>
			<td>FlouroMed</td>
			<td>355-25-9 (Cas No.)</td>
			<td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-338 Amalgamators&#160;</td>
			<td>COXO</td>
			<td></td>
			<td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylene 40 stearate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3440-250G (SKU)</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&#38;region=US&#38;gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110 (Ref.)</td>
			<td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&#38;_sid=406df3776&#38;_ss=r</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Primarty T Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACs running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail &#38; Pan T-Cell MicroBead Cocktail)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-535 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of A549 Lung Cancer Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose Assay Kit&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-TREH (Cat. No.)</td>
			<td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702 (Cat. No.)</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells

אספקה תאית יעילה של ביומולקולים נדרשת למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי ויישומים טיפוליים מבוססי תאים. sonoporation בתיווך אולטראסאונד היא טכניקה מתפתחת עבור משלוח תאי מהיר של biomolecules. Sonoporation מתרחשת כאשר cavitation של microbubbles מלא גז יוצר נקבוביות חולפות בקרומי התא הסמוכים, המאפשר ספיגה מהירה של biomolecules מהנוזל שמסביב. הטכניקות הנוכחיות עבור in vitro sonoporation של תאים בהשעיה מוגבלים על ידי תפוקה איטית, שונות בתנאי החשיפה אולטרסאונד עבור כל תא, ועלות גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מכשיר acoustofluidic בעלות נמוכה פותח אשר משלב מתמר אולטרסאונד במכשיר נוזלים מבוסס PDMS כדי לגרום sonoporation עקבי של תאים כפי שהם זורמים דרך הערוצים בשילוב עם סוכני ניגוד אולטרסאונד. המכשיר מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר את השבב הנוזלי מבוסס PDMS. מתמר דיסק פיזו אולטרסאונד מחובר למכשיר ומונע על ידי מיקרו-בקר. ניתן לשלב את ההרכבה בתוך מארז מודפס בתלת-ממד להגנה נוספת. תאים ומיקרו-חלוקים נדחפים דרך המכשיר באמצעות משאבת מזרק או משאבה פרייסטלטית המחוברת לצינורות PVC. משלוח משופר של biomolecules לתאי T אנושיים ותאי סרטן ריאות הוא הודגם עם מערכת אצוטופלואידית זו. בהשוואה לגישות טיפול בתפזורת, מערכת אצוטופלוידית זו מגדילה את התפוקה ומפחיתה את השונות, אשר יכול לשפר את שיטות עיבוד התא עבור יישומי מחקר ביו-רפואי וייצור של טיפולים מבוססי תאים.

תמונה של המערכת האקוסטופולידית המורכבת בתוך מארז מודפס בתלת-ממד מוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מייצר מערכת acoustofluidic שניתן להשתמש בה כדי לשפר את המסירה המולקולרית התאית בקווי תאים מרובים באמצעות סוכני ניגודיות אולטרסאונד.
איור 2   מדגים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.

הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה וההפעלה של מערכת אצוטופלוידית שיכולה לספק ביעילות ביומולקולים למגוון יישומים טיפוליים מבוססי תאים ומחקר. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שהיא מאפשרת אספקה מהירה של ביומולקולים לתאים תוך שמירה על הכדאיות שלהם. זוהי טכנולוגיית פלטפורמה המאפשרת לתאים להשתנות עבור מגוון יישומים טיפוליים תאיים, כגון טיפול בסרטן.התחל על ידי שילוב של 54 גרם של בסיס PDMS ושישה גרם של חומר ריפוי בכוס. מערבבים במרץ וביסודיות עם מרית במשך דקה אחת לפחות, ולאחר מכן מניחים את הכוס עם פתרון PDMS לתוך ייבשן במשך כ 30 דקות או עד בועות אוויר שריד מוסרים. מניחים רקיק מצופה פוטורסיסט עם התבניות הפונות כלפי מעלה בצלחת פטרי 150 מ"מ, ולאחר מכן יוצקים את תמיסת PDMS על התבנית.במידת הצורך, מניחים את צלחת הפטרי בתוך חיטוי ומחילים ואקום עד שבועות האוויר השרידיות נעלמות. מעבירים את צלחת הפטרי לתנור מעבדה ואופים במשך שעתיים ב-60 מעלות צלזיוס כדי לרפא את ה-PDMS. לאחר הריפוי, יש להסיר בזהירות את ה-PDMS מצלחת הפטרי על ידי חיתוך בשולי הוופל עם סכין גילוח.חותכים כל מכשיר בודד באמצעות סכין או סכין גילוח, ולאחר מכן ניקוב חורים דרך יציאות המפרצון והשקע באמצעות אגרוף ביופסיה 2.5 מ"מ. לאחר טיפול בהתקן PDMS עם פלזמת חמצן, יש להניח מיד כל מכשיר על שקופית מיקרוסקופ זכוכית סודה ליים נקייה עם ערוצים הפונים למשטח הזכוכית. אפשר למכשירים להתחבר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.יש למרוח בעדינות סיליקון על פני השטח של מתמר פיזו בקוטר סנטימטר אחד בעובי של מילימטר אחד עד שני מילימטרים, ואז מיושר בזהירות את המתמר עם ספירלה קונצנטרית ולחץ אותו בעדינות על החלק התחתון של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית. חבר מיקרו-בקר למחשב באמצעות כבל USB A עד B. מחווני LED בעוצמה ירוקה אמורים להאיר.השתמש בתוכנה המשויכת במחשב כדי להעלות תוכנית שמייצרת אות שמונה מגה-הרץ. הלחמה חוט 22 מד אינץ 'עד סוף כל חוט על מתמר PZT. לאחר מכן השתמש בו כדי לחבר את חוט המסוף השלילי של מתמר PZT לפין GND.חבר את חוט המסוף החיובי של מתמר PZT לפין היציאה באמצעות החוט המולחם. חותכים שלושה עד שישה אינץ ' קטעים של צינורות פלסטיק רך Tygon PVC ולדחוף את הצינורות לתוך הכניסה ויציאות שקע. ייתכן שיהיה צורך לסובב את הצינורות תוך הפעלת לחץ עד שהוא מתאים לפתיחה.לחלופין, ניתן להחיל דבק בצומת כדי לחבר את ה- PDMS והצינורות יחד. לחלופין, התקן את ההתקן האצוטופלואידי ואת המיקרו-בקר במארז מודפס בתלת-ממד. להרכיב את המאגר microfluidic על פי הוראות היצרן.חותכים קטע של 3 עד 6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג טייגון PVC בקוטר פנימי בקוטר 1/16 אינץ' ודוחפים אותו מעל הצינורות בקוטר הפנימי של 1/32 אינץ' מתפוקת המאגר המיקרופלואידי. לחלופין, לעטוף את הצומת עם סרט פרפין כדי למנוע דליפה. מלא מזרק 60 מיליליטר עם אוויר הסביבה בצד של המאגר microfluidic.הגדר את משאבת המזרק לקצב של 200 מיליליטר לשעה כדי לדחוף את פתרונות סוכן הניגוד דרך המכשיר acoustofluidic בקצב זרימה נפחית של 50 מיליליטר לשעה ולאסוף את הדגימות מן הפלט של המכשיר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. הכן פתרון phopholipid ב 20 מיליליטר נוצץ במין על ידי הוספת 25 מיליגרם של DSPC, 11.6 מיליגרם של DSEPC, 0.26 מיליגרם של DSPG, ו 0.88 מיליגרם של פוליאוקסיאתילן40 סטארט. מוסיפים כלורופורם עד שכל הפוספוליפידים מתמוססים.לאדות כלורופורם בייבוש במשך 48 שעות כדי ליצור סרט שומנים יבש. Rehydrate הקצף עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי, ולאחר מכן sonicate פתרון השומנים במשך שלוש דקות ב 40%משרעת כדי ליצור פתרון מיסלרי קטי. לאחר sonication, הפתרון phopholipid ניתן לאחסן בשתיים עד שש מעלות צלזיוס עד חודש אחד.כדי להכין סוכני ניגודיות אולטרסאונד, להוסיף 200 microliters של פתרון מיסלר קטי ב 600 microliters של PBS סטרילי ל בקבוקון מחיצה זכוכית שני מיליליטר. אוטמים את הקרבון על ידי קיצור הכובע. השתמש במחט 1.5 אינץ '20 מד כדי למלא את שטח ראש הוויאלי עם גז decafluorobutane במשך 30 שניות.Amalgamate את הנקניקיון כדי ליצור סוכני ניגודיות אולטרסאונד מלא גז perfluorobutane. הוסף 25 microliters של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד לכל מיליליטר אחד של פתרון התא. לאחר מכן מיד לשאוב את סוכן הניגוד המשולב תערובת התא דרך המכשיר acoustofluidic.פרוטוקול זה מייצר מערכת אצוטופלוידית שניתן להשתמש בה כדי לשפר את המסירה המולקולרית התארית בקווי תאים מרובים. משלוח תאי של תרכובת פלואורסצנטית, פלואורסצ'ין, לתאי T אנושיים ראשוניים שופרה עם טיפול אצוטופלואידי בהשוואה לקבוצת ביקורת לא מטופלת. עוצמת הפלואורסצנטיות של תאי T גדלה פי חמישה לאחר הטיפול, מה שמצביע על משלוח משופר של פלואורסצין.הכדאיות התאית ירדה מעט לאחר טיפול אצוטופלואידי, אך נשארה מעל 80%טיפול Acoustofluidic משופרת משלוח תאי של טרהלוז תרכובת משמרת לתאי קרצינומה ריאות A549 אנושיים בהשוואה לזרימה לבד ולתאים בקבוצת הביקורת הלא מטופלת. הוספת המיקרו-יבלים הקטיוניים לפתרון התא היא קריטית. אספקה תאית של ביומולקולים תוגבל ללא מיקרו-יבלות קטיקטיות בתמיסה.פלטפורמה זו מאפשרת אספקה תאית של ביומולקולים שונים, אשר יכול לשנות את התפקוד התאי למטרות מחקר או טיפוליות. לאחר השלמת הליך זה, ניתן לבצע אפיון תאי נוסף כדי להעריך את ההשפעה של אספקת biomolecules שונים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

מבצע של Bioreactor Benchtop

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Electroporator למשלוח סדרתית מולקולרי בסיוע וורטקס microscale

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

הזמנת תאים בודדים עוברים יחיד מאסר 3D: התקן חדש עבור הקרנת תוכן גבוהה

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

סינתזה של Cationized Magnetoferritin עבור המגנטיזציה אולטרה-מהירה של תאים

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...