Name: assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai finanziamenti della National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) e dei National Institutes of Health (U01HL127518). I servizi di fotolitografia sono stati forniti dall'University of Louisville Micro/Nano Technology Center.

Le donazioni di sangue intero sono state raccolte da donatori sani a seguito di protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Louisville.
1. Fabbricazione di dispositivi anotofluidi
<ol><li>Ottenere una maschera fotografica con un design a spirale concentrico contenente canali con un diametro di 500 μm. Nei file supplementari viene fornito un file CAD come esempio. Una maschera fotografica personalizzata può essere ordinata da un fornitor...

<ol>
	<li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy.">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li><li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells.">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li><li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery.">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li><li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+and+experimental+demonstration+of+the+electric+field+assisted+electroporation+microchip+for+in+vitro+gene+delivery+enhancement.">Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement.</a> Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).</li><li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.">Stochastic model for electric field-induced membrane pores.</a> Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues.">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li><li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR/Cas9-based+genome+editing.">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315 (2015).</li><li>Klibanov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbubble+contrast+agents:+targeted+ultrasound+imaging+and+ultrasound-assisted+drug-delivery+applications.">Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications.</a> Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).</li><li>Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-triggered+release+of+materials+entrapped+in+microbubble-liposome+constructs:+a+tool+for+targeted+drug+delivery.">Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).</li><li>Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+microbubble-facilitated+sonoporation+for+drug+and+gene+delivery.">Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery.</a> Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).</li><li>Secomski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+ultrasound+experiments:+Standing+wave+and+multiple+reflections+influence+on+the+outcome.">In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome.</a> Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).</li><li>Gedge, M., Hill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+17:+theory+and+applications+of+surface+acoustic+wave+devices+for+particle+manipulation.">Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation.</a> Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).</li><li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+tweezers:+patterning+cells+and+microparticles+using+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).</li><li>Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li><li>Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles.">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).</li><li>Belling, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidic+sonoporation+for+gene+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).</li><li>Centner, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-induced+molecular+delivery+to+erythrocytes+using+a+microfluidic+system.">Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).</li><li>Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+developing+CAR+T-cell+therapy+for+HIV+cure.">Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure.</a> Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).</li><li>Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+and+future+of+CAR+T+cells+for+B-Cell+Acute+lymphoblastic+leukemia.">The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).</li><li>Hand, S. C., Menze, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+approaches+for+improving+desiccation+tolerance:+insights+from+the+brine+shrimp+Artemia+franciscana.">Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana.</a> Planta. 242 (2), 379-388 (2015).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-drying+of+mammalian+cells+using+trehalose:+preservation+of+DNA+integrity.">Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).</li><li>Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+Cell+recovery+and+viability,+population+composition,+and+cell+functionality.">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perforation+and+recovery+dynamics+in+microbubble-mediated+sonoporation.">Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).</li><li>Kopechek, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth.">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li><li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells.">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li><li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells.">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system.">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li></ol>

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema acoustofluidico a basso costo che migliora la fornitura intracellulare di biomolecole per applicazioni di ricerca. Ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si assembla e si gestisce questo sistema. Il dispositivo acoustofluidico è fabbricato in PDMS, che è un materiale biocompatibile che può essere facilmente modellato con dimensioni del canale coerenti27. I canali del dispositivo possono essere risciacqu...

Piattaforme virali e non virali sono state utilizzate per migliorare la consegna molecolare alle cellule. La somministrazione virale (trasduzione) è una tecnica comune utilizzata nelle terapie cellulari che richiedono modifiche genomiche. Le limitazioni con la consegna virale includono potenziale mutagenesi inserimento, capacità transgenica limitata e molteplicità indesiderata diinfezione 1,2. Pertanto, le tecniche di somministrazione molecolare non virale sono in fase di sviluppo per un'ampia gamma di applicazioni biomediche e di ricerca. Le tecniche comuni includono l'energia meccanica, elettrica, idrodinamica o l'uso di energia a base laser per migliorare l'assorbimento delle biomolecole nelle celle 3. L'elettroporazione è una piattaforma di somministrazione molecolare non virale comunemente usata che ha la capacità di indurre perforazione transitoria nella membrana plasmatica per la consegna intracellularedi composti molecolari 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la perforazione transitoria della membrana plasmatica è un processo stocastico e l'assorbimento molecolare tramite elettroporazione dipende generalmente dalla diffusione passiva attraverso i pori della membranatransitoria 4,7,8.
Un metodo alternativo è l'utilizzo degli ultrasuoni per una maggiore erogazione molecolare intracellulare attraverso la cavitazione di agenti di contrasto ad ultrasuoni (cioè microbolle riempite di gas). La cavitazione microbolle induce effetti di microstreaming nei mezzi circostanti che possono causare perforazione transitoria delle membrane plasmatiche vicine ("sonoporazione") consentendo un rapido assorbimento intracellulare delle biomolecole attraverso meccanismi ditrasporto passivi o attivi 10,11,12. La sonoporazione è una tecnica efficace per la rapida consegna molecolare alle cellule, ma questo approccio richiede spesso attrezzature costose e metodi di trattamento alla rinfusa che sono limitati da una minore produttività e da una maggiore variabilità nelle condizioni di esposizione agli ultrasuoni13. Per risolvere queste limitazioni, sono attualmente in fase di sviluppo dispositivi aoustofluididi che consentono una sonoporazione coerente delle cellule in sospensione.
Acoustofluidics è un campo in espansione che integra tecnologie ecografiche e microfluidiche per un'ampia varietà di applicazioni. Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per la separazione delle particelle applicando energia ultrasonica continua per indurre onde acustiche stanteall'interno dei canali fluidici 14,15,16,17. Le particelle vengono ordinate verso diverse parti del dispositivo in base a una varietà di proprietà come la dimensione delle particelle, la densità e la comprimibilità rispetto almezzo 16. Sono inoltre in fase di sviluppo tecnologie acoustofluidiche per consentire una rapida consegna molecolare a una varietà di tipi di cellule per applicazioni di ricerca e produzione di terapie cellulari18. Recentemente, abbiamo dimostrato una maggiore consegna molecolare agli erytrociti utilizzando un dispositivo acoustofluidico basato su PDMS19. Nella piattaforma apodtofluidale, la dinamica cellulare e microbolle può essere manipolata per indurre interazioni fisiche che consentono una migliore consegna di biomolecole. L'efficienza e la coerenza dell'erogazione molecolare intracellulare possono potenzialmente essere aumentate ottimizzando la distanza tra cellule e microbolle.
Un'importante applicazione per la sonoporazione mediata dall'acoustofluidico comporta il trasporto di biomolecole nelle cellule T umane primarie. Le immunoterapie basate sul trasferimento adottivo delle cellule T, come la terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR T), stanno rapidamente emergendo per il trattamento di varie malattie, tra cui il cancro e virus come l'HIV20. La terapia CAR T è stata particolarmente efficace nei pazienti pediatrici a leucemia linfoblastica acuta (ALL), con tassi di remissione completi del 70-90%21. Tuttavia, la produzione di cellule T per queste terapie dipende generalmente dalla trasduzione virale che è limitata dalla potenziale mutagenesi inserimento, dai lunghi tempi di lavorazione e dalle sfide di fornire biomolecole non genetiche come proteine o piccole molecole1. I metodi di somministrazione molecolare mediati da acoustofluidi possono potenzialmente superare questi limiti e migliorare la produzione di terapie cellulari T.
Un'altra importante applicazione per la sonoporazione mediata dall'austofluidico prevede la somministrazione intracellulare di composti conservanti, come il trealosio, che proteggono le cellule durante il congelamento e l'essiccazione. Il trealosio è prodotto da alcuni organismi in natura e li aiuta a tollerare il congelamento e l'essiccazione proteggendo le loro membrane cellulari22,23. Tuttavia, la trealosio non è prodotta da cellule di mammiferi ed è impermeabile alle membrane cellulari dei mammiferi. Pertanto, sono necessarie efficaci tecniche di somministrazione molecolare, come la sonoporazione, al fine di ottenere livelli di trealosio intracellulari sufficienti necessari per proteggere le membrane cellulari interne. Questo approccio è attualmente in fase di sviluppo per la conservazione a secco di vari tipi di cellule.
Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dell'assemblaggio e del funzionamento di un sistema acoustofluidico relativamente a basso costo guidato da un microcontrollore. Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni vengono utilizzati per indurre la sonoporazione all'interno dei canali fluidici e consentire una rapida consegna molecolare a vari tipi di cellule, tra cui cellule T e cellule tumorali. Questo sistema acoustofluidica può essere utilizzato per una varietà di applicazioni di ricerca e può anche essere utile come sistema prototipo per valutare i metodi di sonoporazione per migliorare i processi di produzione della terapia cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fabrication of Acoustofluidic Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862 (SKU)</td>
			<td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69039-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td>
			<td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-430</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>105732-02-3 (Cas. No.)</td>
			<td>Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon PVC soft plastic tubing (1/16&#34; ID, 1/8&#34; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K51 (Part #)</td>
			<td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly of Acoustofluidic System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Uno</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>7630049200050 (Barcode)</td>
			<td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Ultrasound Contrast Agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890703P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/890703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850365P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/850365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840465P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/840465</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APF-140HP (decafluorobutate gas)</td>
			<td>FlouroMed</td>
			<td>355-25-9 (Cas No.)</td>
			<td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-338 Amalgamators&#160;</td>
			<td>COXO</td>
			<td></td>
			<td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylene 40 stearate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3440-250G (SKU)</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&#38;region=US&#38;gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110 (Ref.)</td>
			<td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&#38;_sid=406df3776&#38;_ss=r</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Primarty T Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACs running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail &#38; Pan T-Cell MicroBead Cocktail)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-535 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of A549 Lung Cancer Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose Assay Kit&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-TREH (Cat. No.)</td>
			<td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702 (Cat. No.)</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells

Per un'ampia gamma di ricerche biomediche e applicazioni terapeutiche a base cellulare è necessaria un'efficiente fornitura intracellulare di biomolecole. La sonoporazione mediata da ultrasuoni è una tecnica emergente per la rapida consegna intracellulare di biomolecole. La sonoporazione si verifica quando la cavitazione di microbolle riempite di gas forma pori transitori nelle membrane cellulari vicine, il che consente un rapido assorbimento delle biomolecole dal fluido circostante. Le attuali tecniche per la sonoporazione in vitro delle cellule in sospensione sono limitate dalla bassa produttività, dalla variabilità delle condizioni di esposizione agli ultrasuoni per ogni cellula e dall'elevato costo. Per risolvere queste limitazioni, è stato sviluppato un dispositivo acoustofluidico a basso costo che integra un trasduttore ad ultrasuoni in un dispositivo fluido basato su PDMS per indurre una sonoporazione coerente delle cellule mentre scorrono attraverso i canali in combinazione con agenti di contrasto ad ultrasuoni. Il dispositivo è fabbricato utilizzando tecniche di fotolitografia standard per produrre il chip fluido basato su PDMS. Un trasduttore a disco piezografico ad ultrasuoni è collegato al dispositivo e guidato da un microcontrollore. L'assieme può essere integrato all'interno di una custodia stampata in 3D per una maggiore protezione. Cellule e microbolle vengono spinte attraverso il dispositivo utilizzando una pompa per siringa o una pompa peristaltica collegata ai tubi in PVC. Con questo sistema apodtofluidico è dimostrato un migliore recapito di biomolecole alle cellule T umane e alle cellule tumorali polmonari. Rispetto agli approcci di trattamento alla rinfusa, questo sistema acoustofluidico aumenta la produttività e riduce la variabilità, che può migliorare i metodi di lavorazione cellulare per applicazioni di ricerca biomedica e la produzione di terapie a base cellulare.

Un'immagine del sistema acoustofluidico assemblato all'interno di una custodia stampata in 3D è mostrata nella figura 1. Questo protocollo produce un sistema acoustofluidico che può essere utilizzato per migliorare l'erogazione molecolare intracellulare in più linee cellulari utilizzando agenti di contrasto ad ultrasuoni.
Figura 2   dimostra una maggiore somministrazione intracellulare di un composto fluorescente,...

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Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un dispositivo accostofluidico a basso costo per la consegna molecolare rapida alle cellule tramite sonoporazione indotta da agenti di contrasto ad ultrasuoni.

Assemblaggio e funzionamento di un dispositivo acoustofluidico per una maggiore consegna di composti molecolari alle cellule

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema acoustofluidico in grado di fornire in modo efficiente biomolecole per una varietà di ricerche e applicazioni terapeutiche basate su cellule. Il vantaggio principale di questo sistema è che consente la consegna rapida di biomolecole alle cellule mantenendo la loro vitalità. È una tecnologia di piattaforma che consente di trasformare le cellule per una varietà di applicazioni terapeutiche cellulari, come il trattamento del cancro.Inizia combinando 54 grammi di base PDMS e sei grammi di agente polimerizzante in una tazza. Mescolare vigorosamente e accuratamente con una spatola per almeno un minuto, quindi posizionare la tazza con la soluzione PDMS in un essiccatore per circa 30 minuti o fino a quando le bolle d'aria residua non vengono rimosse. Posizionare un wafer rivestito di fotoresist con i motivi rivolti verso l'alto in una piastra di Petri da 150 millimetri, quindi versare la soluzione PDMS sopra lo stampo.Se necessario, posizionare la piastra di Petri all'interno di un essiccatore e applicare il vuoto fino a quando le bolle d'aria residuati scompaiono. Trasferire la piastra di Petri in un forno da laboratorio e cuocere per due ore a 60 gradi Celsius per curare il PDMS. Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cura il PDMS dalla piastra di Petri tagliando intorno ai bordi del wafer con una lama di rasoio.Ritagliare ogni singolo dispositivo utilizzando un coltello o una lama di rasoio, quindi forare i fori attraverso le porte di ingresso e uscita utilizzando un punzone di biopsia da 2,5 millimetri. Dopo aver trattato il dispositivo PDMS con plasma di ossigeno, posizionare immediatamente ogni dispositivo su uno scivolo al microscopio in vetro di calce soda pulita con canali rivolti verso la superficie del vetro. Lasciare che i dispositivi si unistano durante la notte a temperatura ambiente.Applicare delicatamente il silicone sulla superficie del trasduttore piezo di un centimetro di diametro con uno spessore da uno a due millimetri, quindi allineare accuratamente il trasduttore con una spirale concentrica e premerlo delicatamente sul fondo dello scivolo del microscopio di vetro. Collegare un microcontroller a un computer utilizzando un cavo USB da A a B. Dovrebbero illuminarsi gli indicatori LED di alimentazione verde.Utilizzare il software associato sul computer per caricare un programma che genera un segnale da otto megahertz. Saldare un filo calibro 22 da un pollice fino all'estremità di ogni filo sul trasduttore PZT. Quindi usalo per collegare il filo terminale negativo del trasduttore PZT a un pin GND.Collegare il filo terminale positivo del trasduttore PZT al perno di uscita tramite il filo saldato. Tagliare sezioni da tre a sei pollici di tubi in plastica morbida in PVC tygon e spingere i tubi nelle porte di ingresso e uscita. Potrebbe essere necessario ruotare il tubo mentre si applica pressione fino a quando non si adatta all'apertura.Opzionalmente, la colla può essere applicata alla giunzione per legare il PDMS e i tubi insieme. Facoltativamente, montare il dispositivo acoustofluidico e il microcontrollore in una custodia stampata in 3D. Assemblare il serbatoio microfluidico secondo le istruzioni del produttore.Tagliare una sezione da tre a sei pollici di tubi di plastica morbida PVC di diametro interno da 1/16 pollici e spingerla sopra i tubi di diametro interno da 1/32 pollici dall'uscita del serbatoio microfluidico. Facoltativamente, avvolgere la giunzione con pellicola di paraffina per evitare perdite. Riempire una siringa da 60 millilitri con aria ambiente sul lato del serbatoio microfluidico.Impostare la pompa della siringa su una velocità di 200 millilitri all'ora per spingere le soluzioni di agente di contrasto attraverso il dispositivo aoustofluidico a una portata volumetrica di 50 millilitri all'ora e raccogliere i campioni dall'uscita del dispositivo in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Preparare una soluzione fofolipidica in una fiala a scintillazione da 20 millilitri aggiungendo 25 milligrammi di DSPC, 11,6 milligrammi di DSEPC, 0,26 milligrammi di DSPG e 0,88 milligrammi di polietilene40 stearato. Aggiungere cloroformio fino a quando tutti i fosfolipidi non vengono sciolti.Evaporare il cloroformio in un essiccatore per 48 ore per formare un film lipidico secco. Reidratare la schiuma con 10 millilitri di PBS sterile, quindi sonicare la soluzione lipidica per tre minuti al 40% di ampiezza per formare una soluzione micellare cationica. Dopo la sonicazione, la soluzione fofolipidica può essere conservata a due o sei gradi Celsius per un massimo di un mese.Per preparare agenti di contrasto ad ultrasuoni, aggiungere 200 microlitri di soluzione micellare cationica in 600 microlitri di PBS sterile a una fiala di setto di vetro a due millilitri. Sigillare la fiala criticando il cappuccio. Utilizzare un ago calibro 20 da 1,5 pollici per riempire lo spazio della testa del flaconcino con gas decafluorobutano per 30 secondi.Amalgamare il flaconcino per formare agenti di contrasto ad ultrasuoni riempiti di gas perfluorobutano. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di agente di contrasto ad ultrasuoni per un millilitro di soluzione cellulare. Quindi pompare immediatamente l'agente di contrasto combinato e la miscela cellulare attraverso il dispositivo austofluidico.Questo protocollo produce un sistema acoustofluidico che può essere utilizzato per migliorare la consegna molecolare intracellulare in più linee cellulari. La consegna intracellulare di un composto fluorescente, la fluoresceina, alle cellule T umane primarie è stata migliorata con un trattamento acoustofluidico rispetto a un gruppo di controllo non trattato. L'intensità di fluorescenza delle cellule T è aumentata di cinque volte dopo il trattamento, indicando una maggiore erogazione di fluoresceina.La vitalità cellulare è leggermente diminuita dopo un trattamento acoustofluidico, ma è rimasta al di sopra dell'80%Il trattamento acoustofluidico ha migliorato la consegna intracellulare di un composto conservante trealosio alle cellule del carcinoma polmonare A549 umano rispetto al solo flusso e alle cellule del gruppo di controllo non trattato. L'aggiunta delle microbolle cationiche alla soluzione cellulare è fondamentale. La somministrazione intracellulare di biomolecole sarà limitata senza microbolle cationiche in soluzione.Questa piattaforma consente la somministrazione intracellulare di varie biomolecole, che possono alterare la funzione cellulare per scopi di ricerca o terapeutici. Dopo aver completato questa procedura, è possibile eseguire una caratterizzazione cellulare aggiuntiva per valutare l'impatto della fornitura di varie biomolecole.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

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Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

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