Name: assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado, em parte, por meio de financiamento da Fundação Nacional de Ciência (#1827521, #1827521, #1450370) e dos Institutos Nacionais de Saúde (U01HL127518). Os serviços de fotolitografia foram prestados pelo Centro de Tecnologia Micro/Nano da Universidade de Louisville.

Doações de sangue foram coletadas de doadores saudáveis seguindo protocolos aprovados pelo conselho de revisão institucional da Universidade de Louisville.
1. Fabricação de dispositivo acoustofluido
<ol><li>Obtenha uma fotomasmamama com um design espiral concêntrico contendo canais com um diâmetro de 500 μm. Um arquivo CAD é fornecido nos arquivos suplementares como exemplo. Uma máscara personalizada pode ser encomendada de um fornecedor comercial ou padronizada u...

<ol>
	<li>Gardlik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+and+delivery+systems+in+gene+therapy.">Vectors and delivery systems in gene therapy.</a> Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).</li><li>Wahlers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+multiplicity+of+infection+and+protein+stability+on+retroviral+vector-mediated+gene+expression+in+hematopoietic+cells.">Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells.</a> Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).</li><li>Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+delivery+systems+for+gene+delivery.">Viral and nonviral delivery systems for gene delivery.</a> Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).</li><li>Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electroporation+theories:+a+review.">Membrane electroporation theories: a review.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).</li><li>Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+a+general+phenomenon+for+manipulating+cells+and+tissues.">Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).</li><li>Hashimoto, M., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+enables+the+efficient+mRNA+delivery+into+the+mouse+zygotes+and+facilitates+CRISPR/Cas9-based+genome+editing.">Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing.</a> Scientific Reports. 5, 11315 (2015).</li><li>Klibanov, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+particle+separation+in+a+microfluidic+channel+via+standing+surface+acoustic+waves+(SSAW).">Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW).</a> Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).</li><li>Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+operation+of+acoustofluidic+devices+supporting+bulk+acoustic+standing+waves+for+sheathless+focusing+of+particles.">Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).</li><li>Belling, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+isolation+techniques+for+human+peripheral+blood+mononuclear+cells:+Cell+recovery+and+viability,+population+composition,+and+cell+functionality.">Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality.</a> Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).</li><li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient.">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).</li><li>Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+(PBMC)+by+density+gradient+centrifugation+on+Percoll.">Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll.</a> Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+targeted+microbubble+destruction-mediated+delivery+of+a+transcription+factor+decoy+inhibits+STAT3+signaling+and+tumor+growth.">Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth.</a> Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).</li><li>Bhutto, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+molecular+weight+on+sonoporation-mediated+uptake+in+human+cells.">Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells.</a> Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).</li><li>Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-dependent+evaluation+of+the+role+of+definity+in+producing+sonoporation+of+Chinese+hamster+ovary+cells.">Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).</li><li>Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+insight+into+mechanisms+of+sonoporation.">Biophysical insight into mechanisms of sonoporation.</a> Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).</li><li>Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonoporation+of+cultured+cells+in+the+rotating+tube+exposure+system.">Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system.</a> Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).</li></ol>

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido de baixo custo que melhora a entrega intracelular de biomoléculas para aplicações de pesquisa. Existem vários fatores importantes a serem considerados na montagem e operação deste sistema. O dispositivo acoustofluido é fabricado em PDMS, que é um material biocompatível que pode ser facilmente moldado com dimensões de canal consistentes27. Os canais do dispositivo podem ser enxaguados com 15 mL de solução d...

Plataformas virais e não virais têm sido utilizadas para melhorar a entrega molecular às células. A entrega viral (transdução) é uma técnica comum utilizada em terapias baseadas em células que requerem modificação genômica. As limitações com a entrega viral incluem mutagênese insercional potencial, capacidade transgênica limitada e multiplicidade indesejada de infecção1,2. Portanto, técnicas de entrega molecular não viral estão em desenvolvimento para uma ampla gama de aplicações biomédicas e de pesquisa. Técnicas comuns incluem mecânica, elétrica, hidrodinâmica ou o uso de energia baseada a laser para melhorar a absorção de biomoléculas nas células 3. A eletroporação é uma plataforma de entrega molecular não viral comumente utilizada que tem a capacidade de induzir perfuração transitória na membrana plasmática para a entrega intracelular dos compostos moleculares4,5,6,7,8,9. No entanto, a perfuração transitória da membrana plasmática é um processo estocástico e a absorção molecular via eletroporação é geralmente dependente da difusão passiva através dos poros da membrana transitória4,7,8.
Um método alternativo é a utilização de ultrassom para melhor entrega molecular intracelular através da cavitação de agentes de contraste de ultrassom (ou seja, microbolhas cheias de gás). A cavitação de microbolhas induz efeitos de microstreaming na mídia circundante que podem causar perfuração transitória de membranas plasmáticas próximas ("sonoporação") permitindo a rápida absorção intracelular de biomoléculas através de mecanismos de transporte passivos ou ativos10,11,12. A sonoporação é uma técnica eficaz para a rápida entrega molecular às células, mas essa abordagem muitas vezes requer equipamentos caros e métodos de tratamento em massa que são limitados por menor rendimento e maior variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom13. Para lidar com essas limitações, os dispositivos aoustofluidos, que permitem a sonoporação consistente das células em suspensão, estão atualmente em desenvolvimento.
Acoustofluidics é um campo em expansão que integra tecnologias de ultrassom e microfluidic para uma ampla variedade de aplicações. Esta abordagem tem sido usada anteriormente para a separação de partículas, aplicando energia contínua de ultrassom para induzir ondas acústicas permanentes dentro dos canais fluidos14,15,16,17. As partículas são classificadas em diferentes partes do dispositivo com base em uma variedade de propriedades, como tamanho de partícula, densidade e compressão em relação ao médio16. Tecnologias acoustofluídicas também estão em desenvolvimento para permitir a entrega molecular rápida a uma variedade de tipos de células para aplicações de pesquisa e fabricação de terapias celulares18. Recentemente, demonstramos uma entrega molecular aprimorada para eritrócitos usando um dispositivo acoustofluido baseado em PDMS19. Na plataforma acoustofluidic, a dinâmica celular e microbolhas pode ser manipulada para induzir interações físicas que permitem uma entrega aprimorada de biomoléculas. A eficiência e consistência da entrega molecular intracelular pode potencialmente ser aumentada otimizando a distância entre células e microbolhas.
Uma aplicação importante para a sonoporação mediada por aoustofluidic envolve o transporte de biomoléculas para células T humanas primárias. Imunoterápicos baseados na transferência de células T adotivas, como a terapia de células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR T), estão surgindo rapidamente para o tratamento de várias doenças, incluindo câncer e vírus como o HIV20. A terapia CAR T tem sido particularmente eficaz em pacientes com leucemia linfoblástica aguda pediátrica (LLA), com taxas de remissão completas de 70-90%21. No entanto, a fabricação de células T para essas terapias geralmente depende da transdução viral, que é limitada por mutagênese insercional potencial, longos tempos de processamento e desafios de fornecer biomoléculas não genéticas, como proteínas ou pequenas moléculas1. Métodos de entrega molecular mediados por acoustofluidic podem potencialmente superar essas limitações e melhorar a fabricação de terapias celulares T.
Outra aplicação importante para a sonoporação mediada por austofluidic envolve a entrega intracelular de compostos conservantes, como o trehalose, que protegem as células durante o congelamento e a dessecação. O trehalose é produzido por alguns organismos na natureza e os ajuda a tolerar congelamento e dessacação protegendo suas membranas celulares22,23. No entanto, o trehalose não é produzido por células mamíferas e é impermeável às membranas celulares de mamíferos. Portanto, técnicas eficazes de entrega molecular, como a sonoporação, são necessárias para alcançar níveis suficientes de trehalose intracelular necessários para proteger membranas celulares internas. Esta abordagem está atualmente em desenvolvimento para preservação seca de vários tipos de células.
Este protocolo fornece uma descrição detalhada da montagem e operação de um sistema aoustofluido relativamente de baixo custo conduzido por um microcontrolador. Os agentes de contraste do ultrassom são utilizados para induzir a sonoporação dentro dos canais fluidos e permitir a entrega molecular rápida para vários tipos de células, incluindo células T e células cancerosas. Este sistema acoustofluidic pode ser usado para uma variedade de aplicações de pesquisa e também pode ser útil como um sistema protótipo para avaliar métodos de sonoporação para melhores processos de fabricação de terapia celular.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Fabrication of Acoustofluidic Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT</td>
			<td>Ellsworth Adhesives</td>
			<td>4019862 (SKU)</td>
			<td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69039-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)</td>
			<td>Darwin Microfluidics</td>
			<td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td>
			<td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-430</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trichlorosilane</td>
			<td>Gelest</td>
			<td>105732-02-3 (Cas. No.)</td>
			<td>Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon PVC soft plastic tubing (1/16&#34; ID, 1/8&#34; OD)</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5233K51 (Part #)</td>
			<td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assembly of Acoustofluidic System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Uno</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>7630049200050 (Barcode)</td>
			<td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Ultrasound Contrast Agents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>890703P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/890703</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>850365P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/850365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG)</td>
			<td>Avanti Lipids</td>
			<td>840465P-25mg (SKU)</td>
			<td>https://avantilipids.com/product/840465</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APF-140HP (decafluorobutate gas)</td>
			<td>FlouroMed</td>
			<td>355-25-9 (Cas No.)</td>
			<td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB-338 Amalgamators&#160;</td>
			<td>COXO</td>
			<td></td>
			<td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyoxyethylene 40 stearate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3440-250G (SKU)</td>
			<td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&#38;region=US&#38;gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110 (Ref.)</td>
			<td>https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&#38;_sid=406df3776&#38;_ss=r</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of Primarty T Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACs running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail &#38; Pan T-Cell MicroBead Cocktail)&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-535 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545 (Order No.)</td>
			<td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of A549 Lung Cancer Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trehalose Assay Kit&#160;</td>
			<td>Megazyme</td>
			<td>K-TREH (Cat. No.)</td>
			<td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-702 (Cat. No.)</td>
			<td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembly and operation of an acoustofluidic device for enhanced delivery of molecular compounds to cells

A entrega intracelular eficiente de biomoléculas é necessária para uma ampla gama de pesquisas biomédicas e aplicações terapêuticas baseadas em células. Sonoporação mediada por ultrassom é uma técnica emergente para rápida entrega intracelular de biomoléculas. A sonoporação ocorre quando a cavitação de microbolhas cheias de gás forma poros transitórios em membranas celulares próximas, o que permite a absorção rápida de biomoléculas do fluido circundante. As técnicas atuais de sonoporção in vitro de células em suspensão são limitadas pelo rendimento lento, variabilidade nas condições de exposição ao ultrassom para cada célula e alto custo. Para lidar com essas limitações, foi desenvolvido um dispositivo acoustofluido de baixo custo que integra um transdutor de ultrassom em um dispositivo fluido baseado em PDMS para induzir a sonoporação consistente das células à medida que elas fluem pelos canais em combinação com agentes de contraste de ultrassom. O dispositivo é fabricado usando técnicas de fotolitografia padrão para produzir o chip fluido baseado em PDMS. Um transdutor de disco de ultrassom piezo é anexado ao dispositivo e conduzido por um microcontrolador. O conjunto pode ser integrado dentro de uma caixa impressa em 3D para proteção adicional. As células e microbolhas são empurradas através do dispositivo usando uma bomba de seringa ou uma bomba peristáltica conectada à tubulação de PVC. A entrega aprimorada de biomoléculas para células T humanas e células cancerígenas de pulmão é demonstrada com este sistema acoustofluido. Em comparação com as abordagens de tratamento em massa, este sistema acoustofluidic aumenta o rendimento e reduz a variabilidade, o que pode melhorar os métodos de processamento celular para aplicações de pesquisa biomédica e fabricação de terapêuticas baseadas em células.

Uma imagem do sistema acoustofluido montado dentro de uma caixa impressa em 3D é mostrada na Figura 1. Este protocolo produz um sistema acoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares usando agentes de contraste de ultrassom.
Figura 2   demonstra maior entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias com...

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Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um dispositivo acoustofluido de baixo custo para rápida entrega molecular às células através de sonoporação induzida por agentes de contraste de ultrassom.

Montagem e Operação de um Dispositivo Acoustofluidic para entrega aprimorada de compostos moleculares às células

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

Este protocolo descreve a montagem e o funcionamento de um sistema acoustofluido que pode fornecer biomoléculas eficientemente para uma variedade de pesquisas e aplicações terapêuticas baseadas em células. A principal vantagem deste sistema é que ele permite a entrega rápida de biomoléculas às células, mantendo sua viabilidade. É uma tecnologia de plataforma que permite que as células sejam transformadas para uma variedade de aplicações terapêuticas celulares, como o tratamento do câncer.Comece combinando 54 gramas de base PDMS e seis gramas de agente de cura em um copo. Misture vigorosamente e completamente com uma espátula por pelo menos um minuto, em seguida, colocou o copo com a solução PDMS em um desiccador por aproximadamente 30 minutos ou até que as bolhas de ar remanescentes sejam removidas. Coloque um wafer revestido fotoresistista com os padrões voltados para cima em uma placa de Petri de 150 milímetros, em seguida, despeje a solução PDMS sobre o molde.Se necessário, coloque a placa de Petri dentro de um desiccador e aplique vácuo até que as bolhas de ar remanescentes desapareçam. Transfira a placa de Petri para um forno de laboratório e asse por duas horas a 60 graus Celsius para curar o PDMS. Após a cura, remova cuidadosamente o PDMS da placa de Petri, cortando as bordas do wafer com uma lâmina de barbear.Corte cada dispositivo individual usando uma faca ou lâmina de barbear, em seguida, faça furos através das portas de entrada e saída usando um soco de biópsia de 2,5 milímetros. Depois de tratar o dispositivo PDMS com plasma de oxigênio, coloque imediatamente cada dispositivo em um slide de microscópio de vidro de limão de soda limpo com canais voltados para a superfície do vidro. Permita que os dispositivos se unam durante a noite à temperatura ambiente.Aplique suavemente silicone na superfície do transdutor piezo de um centímetro de diâmetro com uma espessura de um a dois milímetros, em seguida, cuidadosamente alinhado o transdutor com uma espiral concêntrica e pressione-o suavemente na parte inferior do slide do microscópio de vidro. Conecte um microcontrolador a um computador usando um cabo USB A a B. Um led de energia verde deve acender.Use o software associado no computador para carregar um programa que gera um sinal de oito mega-hertz. Soldar um fio de calibre de 22 polegadas até a extremidade de cada fio no transdutor PZT. Em seguida, use-o para conectar o fio terminal negativo do transdutor PZT a um pino GND.Conecte o fio terminal positivo do transdutor PZT ao pino de saída através do fio soldado. Corte seções de três a seis polegadas de tubos de plástico macio tygon PVC e empurre a tubulação para dentro das portas de entrada e saída. Pode ser necessário girar a tubulação enquanto aplica pressão até que se encaixe na abertura.Opcionalmente, a cola pode ser aplicada na junção para unir o PDMS e a tubulação. Opcionalmente, monte o dispositivo acoustofluidic e o microcontrolador em uma caixa impressa 3D. Monte o reservatório microfluido de acordo com as instruções do fabricante.Corte uma seção de três a seis polegadas de tubos de plástico de plástico macio tygon PVC de 1/16 polegadas de diâmetro interno e empurre-o sobre a tubulação de diâmetro interno de 1/32 polegadas da saída do reservatório microfluido. Opcionalmente, enrole a junção com filme de parafina para evitar vazamentos. Encha uma seringa de 60 mililitros com ar ambiente na lateral do reservatório microfluido.Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de 200 mililitros por hora para empurrar as soluções do agente de contraste através do dispositivo acoustofluido a uma taxa de fluxo volumoso de 50 mililitros por hora e colete as amostras da saída do dispositivo em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Prepare uma solução fofolipílica em um frasco de cintilação de 20 mililitros adicionando 25 miligramas de DSPC, 11,6 miligramas de DSEPC, 0,26 miligramas de DSPG e 0,88 miligramas de estearato de polixietileno40. Adicione clorofórmio até que todos os fosfolipídios sejam dissolvidos.Evaporar clorofórmio em um desiccator por 48 horas para formar uma filme lipídico seco. Reidratar a espuma com 10 mililitros de PBS estéril e, em seguida, sonicar a solução lipídica por três minutos a 40% de amplitude para formar uma solução micelar cônica. Após a sônicação, a solução fofolipídida pode ser armazenada de dois a seis graus Celsius por até um mês.Para preparar agentes de contraste de ultrassom, adicione 200 microliters de solução micelar cônica em 600 microliters de PBS estéril a um frasco de septo de vidro de dois mililitros. Sele o frasco acariciando a tampa. Use uma agulha de calibre 1,5 polegadas de 20 polegadas para encher o espaço da cabeça do frasco com gás decafluorobutano por 30 segundos.Amalgamar o frasco para formar agentes de contraste de ultrassom cheios de gás perfluorobutano. Adicione 25 microliters de solução de agente de contraste de ultrassom por um mililitro de solução celular. Em seguida, bombeie imediatamente o agente de contraste combinado e a mistura celular através do dispositivo acoustofluido.Este protocolo produz um sistema aoustofluido que pode ser usado para melhorar a entrega molecular intracelular em múltiplas linhas celulares. A entrega intracelular de um composto fluorescente, fluoresceína, para células T humanas primárias foi melhorada com tratamento acoustofluido em comparação com um grupo de controle não tratado. A intensidade da fluorescência das células T aumentou cinco vezes após o tratamento, indicando maior entrega de fluoresceína.A viabilidade celular diminuiu ligeiramente após um tratamento acoustofluido, mas permaneceu acima de 80% O tratamento intracelular aumentou a entrega intracelular de um composto conservante trehalose para células de carcinoma pulmonar A549 humanos em comparação com o fluxo sozinho e para as células do grupo controle não tratado. Adicionar os microbolhas cationic à solução celular é fundamental. A entrega intracelular de biomoléculas será limitada sem microbolhas cationic em solução.Esta plataforma permite a entrega intracelular de várias biomoléculas, que podem alterar a função celular para pesquisa ou fins terapêuticos. Após a conclusão desse procedimento, pode ser realizada caracterização celular adicional para avaliar o impacto da entrega de diversas biomoléculas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo

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