Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

نشكر نعومي زيف وساشا ليفي وشوانغ لي على مساهماتهم في تطوير هذا البروتوكول، وديفيد غريشام على المعدات المشتركة، وماريسا نول للمساعدة في إنتاج الفيديو. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM118170.

1. إعداد لوحات معشاة (قبل يوم التجربة)
<ol><li>تخطيط السلالات والظروف التي سيتم اختبارها مع فحص النمو. عند هذه النقطة، تعيين عشوائيا سلالات وشروط إلى أي بئر. ملاحظة: عند النظر في إعداد لوحة، فمن المستحسن أن تشمل أكثر من تكرار واحد لكل سلالة وحالة النمو على لوحة واحدة لحساب الضوضاء ذات الصلة ج?...

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

البروتوكول الموصوف هنا هو اختبار متعدد الاستخدامات يسمح بمراقبة نمو الخلايا والتعبير الجيني في وقت واحد على مستوى الألوان الدقيقة الفردية. والجمع بين هذين الشكلين يسفر عن رؤى بيولوجية فريدة من نوعها. على سبيل المثال، استخدم العمل السابق هذا المقايسة لإظهار ارتباط سلبي بين التعبير عن جين...

الأنماط الظاهرية للنمو تسهم بشكل حاسم في اللياقة البدنية الخميرة. الانتقاء الطبيعي يمكن أن يميز بكفاءة بين الأنساب مع معدلات النمو تختلف عن طريق عكس حجم السكان الفعال، والتي يمكن أن تتجاوز 108 أفراد1. وعلاوة على ذلك، فإن تقلب معدلات النمو بين الأفراد داخل السكان هو المعلمة ذات الصلة تطوريا، لأنها يمكن أن تكون بمثابة الأساس لاستراتيجيات البقاء على قيد الحياة مثل التحوط الرهان2،3،4،5،6. ولذلك، فإن المقايسات التي تسمح بإجراء قياسات دقيقة للغاية للأنماط الظاهرية للنمو وتوزيعاتها هي محورية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يولد اختبار نمو الألوان الدقيقة الموصوف هنا قياسات معدل النمو الفردي ل ~105 ميكروكولونات لكل تجربة. ولذلك يوفر هذا المقايسة بروتوكولا قويا لدراسة علم الوراثة التطورية الخميرة وعلم الجينوم. فإنه يفسح المجال بشكل جيد بشكل خاص لاختبار كيف يتم إنشاء التباين داخل السكان من الخلايا المفردة متطابقة وراثيا، والحفاظ عليها، ويساهم في اللياقة البدنية للسكان7،8،9،10.
تستخدم الطريقة الموضحة هنا(الشكل 1)صورا ذات حقول ساطعة يتم التقاطها بشكل دوري ومنخفضة التكبير للخلايا التي تنمو في الوسائط السائلة على لوحة زجاجية قاعية من 96 أو 384 بئرا لتتبع النمو في المستعمرات الدقيقة. تلتزم الخلايا بالكونسانفالين الليكتين A ، الذي يغطي الجزء السفلي من لوحة المجهر ، وتشكل مستعمرات ثنائية الأبعاد. لأن المستعمرات الدقيقة تنمو في طبقة واحدة، ترتبط منطقة الكولون الدقيق ارتباطا وثيقا مع الخلية رقم7. لذلك، يمكن إنشاء تقديرات دقيقة لمعدل نمو الألوان الدقيقة ووقت التأخر مع برنامج مخصص لتحليل الصور يتتبع معدل التغيير في منطقة كل مجموعة صغيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن للإعداد التجريبي رصد وفرة وحتى توطين دون الخلوية من البروتينات المسمى fluorescently أعرب في هذه المستعمرات الدقيقة. يمكن تحقيق معالجة المصب للبيانات من هذا المقايسة نمو الألوان الدقيقة عن طريق التحليل المخصص أو عن طريق برامج تحليل الصور الحالية ، مثل معالجة الصور بسهولة (PIE)11، خوارزمية للتعرف على منطقة المستعمرة القوية وتحليل النمو عالي الإنتاجية من التكبير المنخفض ، صور brightfield ، والتي تتوفر عبر GitHub12.
ولأن تقديرات معدل النمو المستمدة من مقايسة نمو المستعمرات الدقيقة يتم توليدها من عدد كبير من قياسات المستعمرة الواحدة، فإنها دقيقة للغاية، مع أخطاء قياسية أصغر بعدة أوامر من الحجم من التقديرات نفسها لتجربة معقولة الحجم. ولذلك، فإن قدرة المقايسة على اكتشاف الاختلافات في معدل النمو بين الأنماط الجينية المختلفة أو العلاجات أو الظروف البيئية عالية. يسمح تنسيق لوحة multiwell العديد من تركيبات البيئة والنمط الجيني المختلفة أن تقارن في تجربة واحدة. إذا كانت السلالات تعبر بشكل أساسي عن علامات فلورية مختلفة ، فقد تكون مختلطة في نفس البئر وتتميز بتحليل الصورة اللاحق ، مما قد يزيد من القوة من خلال السماح بتطبيع البيانات بشكل جيد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. يتبع هذا البروتوكول خطوتين رئيسيتين ، وهما إعداد اللوحة التجريبية وإعداد الخلايا للصورة. وينبغي إجراء العشوائية لوحات ونمو الخلايا قبل وحتى يوم التجربة. الخلط المتكرر للخلايا في كل خطوة أثناء التخفيف أمر حتمي في الخطوات حتى الطلاء ، وبالتالي ينصح بإعداد اللوحة التجريبية أولا بحيث تكون جاهزة للطلاء فور الانتهاء من تمييع الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

القياسات الدقيقة للتباين بين وداخل سلالة في معدلات النمو الميكروبية ضرورية لفهم المدخلات الوراثية والبيئية في تحمل الإجهاد، والإمراض، وغيرها من المكونات الرئيسية للياقة البدنية. تصف هذه المخطوطة المقايسة المستندة إلى المجهر التي تتعقب ما يقرب من 105 ساككروميس سيريفيسيا الألوان الدقيقة لكل تجربة. بعد التصوير الآلي الفاصل الزمني للخميرة معطلة في لوحة متعددة بويل ، يتم تحليل معدلات نمو الألوان الدقيقة بسهولة مع برامج تحليل الصور المخصصة. لكل ميكروكولون، والتعبير وتوطين البروتينات الفلورية والبقاء على قيد الحياة من الإجهاد الحاد يمكن أيضا رصدها. ويسمح هذا المقايسة بتقدير دقيق لمتوسط معدلات نمو السلالات، فضلا عن القياس الشامل لعدم التجانس في النمو، والتعبير الجيني، وتحمل الإجهاد داخل المجموعات السكانية اللاستنساخية.

إن حداثة هذا البروتوكول هي أنه يمكن حساب معدل النمو للخلايا الفردية داخل السكان من خلال تتبع نموها إلى المستعمرات الدقيقة من خلال التصوير الفاصل الزمني(الشكل 2A). لأن المستعمرات الدقيقة تنمو لعدة ساعات بطريقة مستو بسبب وجود concanavalin A ، يمكن تتبع مناطقها طوال التجربة ، ويمكن ?...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

يتم قياس الأنماط الظاهرية لنمو الخميرة بدقة من خلال التصوير المتوازي للغاية للفاصل الزمني للخلايا المشلولين التي تنمو إلى مستعمرات صغيرة. وفي الوقت نفسه، يمكن رصد تحمل الإجهاد، والتعبير عن البروتين، وتوطين البروتين، وتوليد مجموعات بيانات متكاملة لدراسة كيفية تعديل النمو بين الاختلافات البيئية والجينية، فضلا عن عدم التجانس بين الخلايا متساوية المنشأ.

تصوير حي عالي الإنتاجية للمستعمرات الدقيقة لقياس التغايرية في النمو والتعبير الجيني

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

بروتوكولنا لسرعة الإنتاجية العالية، خلايا الخميرة تمكن تتبع النمو والتعبير الجيني لآلاف المستعمرات الدقيقة في وقت واحد. ويمكن قياس الفرق بين السلالات، وبين البيئات وحتى بين الخلايا المتطابقة وراثيا التي تزرع في بيئة مشتركة كميا. يقدم البروتوكول تقديرات دقيقة لمتوسط معدل النمو ومتوسط كثافة الفلورسينس لمراسلي التعبير الجيني.وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لأن العديد من المستعمرات الصغيرة الفردية يتم تقييمها، يتم الحصول على تقديرات دقيقة لتوزيعات كاملة من قيم النمو والتعبير. يتبع هذا البروتوكول خطوتين رئيسيتين ، إعداد اللوحة التجريبية وإعداد الخلايا للتصوير. يجب أن تكون الخلايا مطلية مباشرة بعد التخفيف والاختلاط.لذلك نوصي بإعداد طبقك التجريبي أولا. ستلاحظ الاختلاط المتكرر للخلايا في جميع أنحاء هذا البروتوكول ، وهو أمر مهم للغاية في الخطوات حتى الطلاء. في يوم التجربة ، يجب تصفية جميع الوسائط والحلول الأخرى المستخدمة في الفحص باستخدام فلتر ميكرونين ، حتى لو كانت معقمة بالفعل ، من أجل إزالة أي بلورات قد تظهر في صور المجهر.وهذا يشمل وسائل الإعلام التجريبية والحل Concanavalin A. بعد ذلك، قم بإعداد لوحة المجهر. من أجل الحفاظ على السطح الزجاجي للآبار واضحة من الحطام والخدوش، والحفاظ دائما على الوبر ومسح حر ثابت تحت لوحة.استخدام تقنية معقمة على مقاعد البدلاء المعقمة. تصفية 25 ملليلتر من محلول 1X Concanavalin A وماصة 200 ميكرولتر في كل بئر من لوحة المجهر. نوصي بتثبيت ماصة لضمان الارتفاع السليم.الطرد المركزي لوحة المجهر مع الوبر ومسحة حرة ثابتة تحته لمدة دقيقتين في 411 مرات G من أجل إزالة أي فقاعات الهواء التي يمكن أن تمنع Concanavalin A من طلاء بالتساوي الجزء السفلي من الآبار. دع اللوحة التي تحتوي على الكونكانافالين A الحل بقية لمدة ساعة إلى ساعتين. كن متسقا عبر تجاربك.بعد حضانة Concanavalin A، مسح Concanavalin A من لوحة البئر 96 إما مع جهاز شفط أو عن طريق إلقاء بقوة الحل من لوحة كما هو مبين هنا. ستبقى بعض القطرات. بعد ذلك، اغسل الآبار بإضافة 400 ميكرولتر من المياه العقيمة إلى كل بئر.إضافة الماء مباشرة بعد إزالة محلول Concanavalin A. لا تدع لوحة الجلوس الجافة. من المهم تجنب لمس الجزء السفلي المغلفة من لوحة مع نصائح ماصة من أجل عدم إزاحة أو إزالة Concanavalin A من السطح الزجاجي للأبار.إزالة المياه بنفس الطريقة التي حل Concanavalin A وإضافة فورا 185 ميكرولتر من وسائل الإعلام التجريبية إلى لوحة المجهر الخاص بك. لا تسمح للطبق بالجلوس جافا. اللوحة جاهزة الآن لإضافة 50 ميكرولتر من الخلايا المخففة.استرجع طبقك المعشاة التي تم زراعتها مسبقا من 96 بئرا. سيحدد سؤالك التجريبي ما إذا كانت الخلايا مشبعة أو في مرحلة السجل وعدد النسخ المتماثلة العشوائية التي يجب استخدامها في الفحص. طرد مركزي لوحة لمدة دقيقتين في 411 مرات G لتقليل فرصة التلوث المتبادل عند إزالة غطاء احباط.تأكد من عدم إمالة لوحة الخاص بك عندما كنت التعامل معها. إذا الخميرة ووسائل الإعلام تأتي في اتصال مع احباط تغطي لوحة، يمكن أن يكون هناك تلوث عبر الآبار. أولا إعداد لوحات سوف تجري المخففات التسلسلية الخاصة بك في.أضف 90 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى كل لوحة من لوحات التخفيف الخاصة بك. المقبل إعداد الخلايا الخاصة بك. كن حذرا للغاية عند إزالة احباط من لوحة 96 جيدا لمنع قطرات من بئر واحد من دخول آخر.وسوف تتركز الخميرة في الجزء السفلي من لوحة بسبب الطرد المركزي. للتأكد من أن الخلايا مختلطة جيدا أثناء التخفيف، قم دائما بإضافة حجم صغير من الخلايا إلى حجم أكبر من الوسائط. ثم إضافة حجم كبير آخر من وسائل الإعلام إلى الخليط.مما لا شك فيه أن مزيج ماصة بقوة في كل خطوة. في هذا الفيديو، قمنا بإضعاف خلايا الخميرة عند التشبع والوسائط الكاملة الاصطناعية، والتي سنقوم بتخفيفها 10000 مرة لتحقيق تركيز نهائي من حوالي 4000 خلية لكل بئر في لوحة المجهر. لإعادة تعليق الخلايا، ماصة صعودا وهبوطا بقوة وتحريك طرف ماصة حول البئر في حركة دائرية.بعد خلط، ينبغي أن يكون هناك أي آثار الخميرة استقر المتبقية في أي بئر كما رأينا هنا في A1 جيدا. جميع الآبار الأخرى المعروضة هنا لم يتم إعادة تعليقها للمقارنة. عد الخلايا في لوحة ما قبل نمت، على سبيل المثال، مع مقياس الدم، والجمع مع أي سلالة أخرى التي سوف تضيف إلى نفس البئر بنسب متساوية. هنا، نخلط الخلايا من صحننا المزروع مسبقا مع سلالة مرجعية فلورية بنسبة واحد إلى واحد.بمجرد توحيد تركيزات الخلايا، أضف عشرة ميكرولترات من الخلايا إلى لوحة التخفيف التسلسلية الأولى. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط إلى مجلد نهائي من 200 ميكرولتر. مع إضافة الخلايا ووسائل الإعلام على حد سواء، ماصة مزيج بقوة، وتحريك طرف ماصة حول الآبار في حركة دائرية.من هذه النقطة فصاعدا، حتى يتم إضافة الخلايا إلى لوحة المجهر، والمضي قدما بسرعة من خلال البروتوكول. بعد ذلك ، أضف عشرة ميكرولترات من الخميرة من لوحة التخفيف التسلسلية الأولى إلى لوحة التخفيف التسلسلية الثانية. ثم أضف 100 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى ذلك.تخلط جيدا. إذا الخميرة الخاصة بك لم يكن لديك ميل إلى flocculate، ثم أنها على استعداد لإضافتها إلى لوحة المجهر مباشرة بعد هذه الخطوة. المضي قدما على الفور إلى الطلاء.ومع ذلك ، إذا كانت سلالات الخميرة التي تستخدمها لديها ميل معتدل إلى التخبط ، فإن خطوة سونيكيشن الاختيارية التالية ستكون ضرورية. إذا sonicating، أول ماصة خلط حل الخميرة مرة أخرى، قبل sonication. وضع الخميرة المخففة على sonicator وغمر دبابيس 96 جيدا في حل كل بئر، ولكن لا تلمس الجزء السفلي من البئر.تعيين برنامج سونيكيشن، الذي هو قوي بما فيه الكفاية لكسر خلايا الخميرة flocculated، ولكن لا يقتل الخلايا أو يسبب استجابات الإجهاد مرتفعة. قد تكون هناك حاجة إلى بعض الاختبارات لتحديد أفضل برنامج سونيكيشن لتجربة معينة. بمجرد اكتمال البرنامج، قم بإزالة الخلايا ثم انتقل فورا إلى الخطوة التالية.إضافة 15 ميكرولتر من الخميرة من لوحة تخفيف المسلسل الثاني في لوحة المجهر. ماصة صعودا وهبوطا لخلط، ولكن القيام بذلك بعناية لتجنب إزعاج Concanavalin A تعلق على الجزء السفلي من آبار لوحة. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الوسائط التجريبية إلى حجم نهائي من 400 ميكرولتر ، إلى لوحة المجهر.ماصة مزيج بحذر. قم بتغطية اللوحة بغشاء قابل للتنفس. تأكد من أن حواف اللوحة مغلقة جيدا.الطرد المركزي لوحة المجهر مع الوبر والأنسجة الحرة ثابتة تحته لمدة دقيقتين في 411 مرات G من أجل خلايا الخميرة لإرفاق Concanavalin A في الجزء السفلي من لوحة. اللوحة جاهزة الآن ليتم تصويرها. في المجهر، امسح الجزء العلوي والسفلي من اللوحة بمسحة حرة من الوبر والساكنة وانفخ الهواء المضغوط على الجزء السفلي من اللوحة لإزالة الحطام.ضع اللوحة على المجهر. تأكد من أن بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا وأن يتم تسخين المجهر إلى درجة الحرارة الصحيحة لنمو الخلية. تأكد أيضا من أن اللوحة مدسوسة بدقة في المجهر وأن الجزء السفلي من اللوحة مسطح.إذا كانت اللوحة تحتوي على غطاء بلاستيكي، قم بإزالة هذا قبل بدء الفحص المجهري. وسيكون من المهم التقاط صور جيدة لتحليل المصب. نقوم بتحميل ملف تم إنشاؤه تلقائيا مع إحداثيات X و Y والمواقف البؤرية لتصوير لوحة المجهر بأكملها.إذا كنت تستخدم ملفا تم إنشاؤه مسبقا، فتحقق من بعض المواضع في لوحة المجهر لضمان وجود الخلايا في المستوى البؤري الصحيح. من المفيد أن تكون الطائرة المحورية أعلى قليلا من الخلايا بحيث تكون محاطة بحافة داكنة وتكون أكثر إشراقا من الخلفية. تعيين عدد النقاط الزمنية وتباعد النقاط الزمنية التي ستستخدمها للتجربة.إذا كنت تقوم بجمع كل من معدل النمو وبيانات كثافة الفلورسينس ، فقيم برنامجا للتصوير الفلوري أيضا. ضبط السطوع في كل قناة ليتم تصويرها بحيث لا يتعرض أي موضع على لوحة المجهر. اختبار التعرض سوف تستخدم عندما كنت لا في وضع العيش.بالنسبة للصور الفلورية ، يجب أن تكون الفلورسينس مرئية للعين المجردة. ولكن بخلاف ذلك نوصي بتعيين قيم التعرض المنخفض. تنمو المستعمرات المتباعدة بشكل مناسب التي تزرعها الخلايا الفردية في طبقة أحادية على طول سطح اللوحة.ونتيجة لذلك، يمكن استخدام تحليل الصور الآلي لحساب معدل النمو بدقة للعديد من الألوان الدقيقة الفردية. يمكن استخدام علامات الفلورسنت للتمييز بين سلالات متعددة تنمو في نفس البئر. ونتيجة لذلك، يمكن حساب التوزيعات الكاملة لمعدلات النمو لفرادى المستعمرات الدقيقة التي تنمو في بيئة مشتركة.كما تسمح أحجام العينات الكبيرة التي يمكن تحقيقها مع هذه التجربة بتقدير دقيق لمتوسط الاختلافات بين السلالات المختلفة أو ظروف النمو. هنا ، تظهر معدلات نمو مجموعات المستعمرات المقترنة التي تزرع في آبار واحدة من مجموعة من خطوط تراكم الطفرات ومستعمرات التحكم المرجعية في GFP بشكل جيد. إذا لوحظ تكتل الخلايا على لوحة المجهر ، يجب تقسيم الكتل عن طريق سونيكيشن قبل الطلاء.الخلايا في الكتل التي لم يتم تقسيمها لن تنمو في الكولونية الدقيقة على طول سطح اللوحة ، مما يجعل الحساب الصحيح لمعدل النمو مستحيلا. ليس كل وسائل الإعلام متوافقة مع معدل نمو الألوان الدقيقة المقايسة. بعض أشكال وسائل الإعلام، بما في ذلك وسائل الإعلام التي تحتوي على استخراج الخميرة أو لديه انخفاض الحموضة، ومنع ربط الخلايا إلى Concanavalin A.This يؤدي إلى الخلايا العائمة بعيدا عن المستعمرات الدقيقة المتنامية على مدار التجربة وقياسات معدل النمو خاطئة.من المهم تجنب طلاء الخلايا بكثافة كبيرة جدا. عندما تكون الخلايا مطلية عن كثب ، تندمج الألوان الدقيقة الأسرع نموا في نقاط زمنية سابقة ، كما هو موضح هنا على أنها فقدان لتتبع الألوان. ويمكن لهذا التأثير أن يتحيز لتقديرات معدل النمو لأن المستعمرات البطيئة النمو أقل احتمالا للاندماج مع جيرانها قبل جمع البيانات من النقاط الزمنية الكافية.اعتمادا على ظروف النمو، قد تخضع مجموعة فرعية من الخلايا لمرحلة تأخر قبل البدء في النمو. من المهم حساب ذلك عند استخدام مناطق المستعمرة لحساب معدل النمو بدلا من تركيب منحنى النمو لجميع النقاط الزمنية المتاحة. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف للتحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة المتعلقة بنمو الخميرة وتطورها.شكله microplate مرنة يعني أنه يمكن تكييفها لأنواع الخميرة الأخرى، وظروف النمو المختلفة، والميكروبات الأخرى، وربما غيرها من الخلايا في الثقافة.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em&gt; E. القولونية</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

عالية الإنتاجية تحليل صورة الأجسام الشبه الكروية ورم: A برمجيات صديقة للمستخدم التطبيق لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا وبدقة

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...