Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

Wir danken Naomi Ziv, Sasha Levy und Shuang Li für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls, David Gresham für gemeinsame Ausrüstung und Marissa Knoll für die Hilfe bei der Videoproduktion. Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss der National Institutes of Health R35GM118170 unterstützt.

1. Vorbereitung randomisierter Platten (vor dem Experimenttag)
<ol><li>Planen Sie die Belastungen und Bedingungen, die mit dem Wachstumstest getestet werden sollen. An diesem Punkt, zufällig zuweisen Stämme und Bedingungen zu jedem Brunnen. HINWEIS: Bei der Prüfung der Platteneinrichtung ist es ratsam, mehr als eine Replikation pro Dehnung und Wachstumszustand auf einer einzigen Platte einzuschließen, um gut verwandte Geräusche in Messungen zu berücksichtigen. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion....

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

Das hier beschriebene Protokoll ist ein vielseitiger Test, der es ermöglicht, Zellwachstum und Genexpression gleichzeitig auf der Ebene einzelner Mikrokolonien zu überwachen. Die Kombination dieser beiden Modalitäten ergibt einzigartige biologische Erkenntnisse. Zum Beispiel haben frühere Arbeiten diesen Test verwendet, um eine negative Korrelation zwischen der Expression des TSL1-Gens und der Mikrokolonie-Wachstumsrate in isogenen Wildtypzellen zu zeigen, indem beide gleichzeitig7<su...

Wachstumsphänotypen tragen entscheidend zur Hefefitness bei. Die natürliche Selektion kann effizient zwischen Linien unterscheiden, wobei die Wachstumsraten durch die Umkehrung der effektiven Bevölkerungsgröße abweichen, die 108 Individuen1 überschreiten kann. Darüber hinaus ist die Variabilität der Wachstumsraten bei Individuen innerhalb einer Bevölkerung ein evolutionär relevanter Parameter, da er als Grundlage für Überlebensstrategien wie Wetten hedging2,3,4,5,6dienen kann. Daher sind Assays, die hochgenaue Messungen von Wachstumsphänotypen und deren Verteilungen ermöglichen, für die Untersuchung von Mikroorganismen von entscheidender Bedeutung. Der hier beschriebene Mikrokolonie-Wachstumstest kann individuelle Wachstumsratenmessungen für 105 Mikrokolonien pro Experiment generieren. Dieser Test bietet daher ein leistungsfähiges Protokoll, um Hefe evolutionäre Genetik und Genomik zu studieren. Es eignet sich besonders gut, um zu testen, wie Variabilität innerhalb von Populationen von genetisch identischen Einzelzellen erzeugt, gepflegt wird und zur Eignung der Bevölkerung beiträgt7,8,9,10.
Die hier beschriebene Methode (Abbildung 1) verwendet periodisch erfasste Hellfeldbilder von Zellen mit geringer Vergrößerung, die in flüssigen Medien auf einer 96- oder 384-Well-Glasbodenplatte wachsen, um das Wachstum in Mikrokolonien zu verfolgen. Die Zellen haften an dem Lektin Concanavalin A, das den Boden der Mikroskopplatte überzieht, und bilden zweidimensionale Kolonien. Da die Mikrokolonien in einer Monoschicht wachsen, ist das Mikrokoloniegebiet stark mit der Zellnummer7korreliert. Daher können genaue Schätzungen der Wachstumsrate und Verzögerungszeit von Mikrokolonien mit einer benutzerdefinierten Bildanalysesoftware generiert werden, die die Änderungsrate der Fläche jeder Mikrokolonie nachverfolgt. Darüber hinaus kann der Versuchsaufbau die Häufigkeiten und sogar die subzellulären Lokalisationen fluoreszierend markierter Proteine überwachen, die in diesen Mikrokolonien exprimiert werden. Die nachgeschaltete Verarbeitung von Daten aus diesem Mikrokolonie-Wachstumstest kann durch benutzerdefinierte Analyse oder durch vorhandene Bildanalysesoftware erreicht werden, wie z. B. Processing Images Easily (PIE)11, ein Algorithmus für robuste Kolonieflächenerkennung und Wachstumsanalyse mit hohem Durchsatz aus Hellfeldbildern mit geringer Vergrößerung, die über GitHub12verfügbar sind.
Da wachstumsfördernde Schätzungen, die aus dem Mikrokolonie-Wachstumstest abgeleitet werden, aus einer großen Anzahl von Einzelkolonienmessungen generiert werden, sind sie extrem genau, mit Standardfehlern, die um mehrere Größenordnungen kleiner sind als die Schätzungen selbst für ein angemessen großes Experiment. Daher ist die Kraft des Assays, Wachstumsratenunterschiede zwischen verschiedenen Genotypen, Behandlungen oder Umgebungsbedingungen zu erkennen, hoch. Das Multiwell-Plattenformat ermöglicht den Vergleich zahlreicher unterschiedlicher Umgebungs- und Genotypkombinationen in einem einzigen Experiment. Wenn Stämme konstitutiv unterschiedliche fluoreszierende Marker exprimieren, können sie in der gleichen Bohrung gemischt und durch nachfolgende Bildanalyse unterschieden werden, was die Leistung weiter erhöhen könnte, indem sie eine gut-durch-gut-datennormalisierung ermöglichen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> Abbildung 1:Schematische Darstellung des Protokolls. Dieses Protokoll folgt zwei Hauptschritten, die die Vorbereitung der Versuchsplatte und die Vorbereitung der Zellen auf das Bild sind. Die Randomisierung der Platten und das Wachstum der Zellen sollten vor und vor dem Experimenttag durchgeführt werden. Das wiederholte Mischen von Zellen bei jedem Schritt während der Verdünnung ist in den Schritten bis zur Beschichtung zwingend erforderlich, und daher wird die Vorbereitung der Versuchsplatte zuerst empfohlen, so dass sie sofort nach Abschluss der Zellverdünnung zur Beschichtung bereit ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

Präzise Messungen der Heterogenität zwischen und innerhalb der Dehnung in mikrobiellen Wachstumsraten sind entscheidend für das Verständnis genetischer und ökologischer Inputs in Stresstoleranz, Pathogenität und anderen Schlüsselkomponenten der Fitness. Dieses Manuskript beschreibt einen mikroskopischen Assay, der pro Experiment etwa 105 Saccharomyces cerevisiae mikrocolonies nachverfolgt. Nach der automatisierten Zeitraffer-Bildgebung von Hefe, die in einer Multiwell-Platte immobilisiert ist, lassen sich die Wachstumsraten von Mikrokolonien mit einer benutzerdefinierten Bildanalysesoftware einfach analysieren. Für jede Mikrokolonie können auch die Expression und Lokalisation fluoreszierender Proteine und das Überleben akuter Belastungen überwacht werden. Dieser Test ermöglicht eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Wachstumsraten der Stämme sowie eine umfassende Messung der Heterogenität in Wachstum, Genexpression und Stresstoleranz innerhalb klonaler Populationen.

Die Neuheit dieses Protokolls ist, dass die Wachstumsrate für einzelne Zellen innerhalb einer Population berechnet werden kann, indem ihr Wachstum in Mikrokolonien durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt wird (Abbildung 2A). Da Mikrokolonien aufgrund des Vorhandenseins von Concanavalin A viele Stunden planarer wachsen, können ihre Gebiete während des gesamten Experiments verfolgt werden, und eine lineare Anpassung an die Veränderung des natürlichen Protokolls des Gebiets im Laufe der Zeit ...

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High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Unser Protokoll für hohen Durchsatz, Hefezellen ermöglicht die Verfolgung von Wachstum und Genexpression für Tausende von Mikrokolonien gleichzeitig. Der Unterschied zwischen stämmen, zwischen Umgebungen und sogar zwischen genetisch identischen Zellen, die in einer gemeinsamen Umgebung angebaut werden, kann quantifiziert werden. Das Protokoll liefert genaue Schätzungen der durchschnittlichen Wachstumsrate und der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität von Genexpressionsreportern.Da so viele einzelne Mikrokolonien untersucht werden, werden zudem genaue Schätzungen der gesamten Verteilung enkundigen Wachstums- und Expressionswerte ermittelt. Dieses Protokoll folgt zwei Hauptschritten, der Vorbereitung der Versuchsplatte und der Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung. Die Zellen müssen unmittelbar nach Verdünnung und Mischen plattiert werden.Daher empfehlen wir Ihnen, zuerst Ihre Experimentelle Platte einzurichten. Sie werden die wiederholte Vermischung von Zellen während dieses Protokolls bemerken, was in den Schritten bis zur Beschichtung extrem wichtig ist. Am Tag des Experiments müssen alle Medien und andere Lösungen, die für den Test verwendet werden, mit einem Zwei-Mikron-Filter gefiltert werden, auch wenn sie bereits steril sind, um Kristalle zu entfernen, die in Mikroskopbildern erscheinen können.Dazu gehören experimentelle Medien und die Concanavalin-A-Lösung. Als nächstes bereiten Sie die Mikroskopplatte vor. Um die Glasoberfläche der Brunnen frei von Schmutz und Kratzern zu halten, halten Sie immer eine Fussel und statische freie Wisch unter der Platte.Verwenden Sie sterile Technik auf einer sterilisierten Bank. Filtern Sie 25 Milliliter 1X Concanavalin Eine Lösung und Pipette 200 Mikroliter in jeden Brunnen der Mikroskopplatte. Wir empfehlen, die Pipette zu stabilisieren, um die richtige Höhe zu gewährleisten.Zentrifugieren Sie die Mikroskopplatte mit einem Fussel und statischem frei wischen darunter für zwei Minuten bei 411 mal G, um Luftblasen zu entfernen, die verhindern könnten, dass Concanavalin A den Boden der Brunnen gleichmäßig beschichtet. Lassen Sie die Platte mit der Concanavalin A Lösung für ein bis zwei Stunden ruhen. Seien Sie in Ihren Experimenten konsistent.Nach der Inkubation Concanavalin A die Concanavalin A von der 96-Wellplatte entweder mit einer Saugvorrichtung oder durch gewaltsames Abwerfen der Lösung aus der Platte, wie hier gezeigt, löschen. Einige Tröpfchen bleiben erhalten. Als nächstes waschen Sie die Brunnen, indem Sie 400 Mikroliter steriles Wasser zu jedem Brunnen hinzufügen.Fügen Sie das Wasser sofort nach dem Entfernen der Concanavalin A Lösung hinzu. Lassen Sie die Platte nicht trocken sitzen. Es ist wichtig, den beschichteten Boden der Platte nicht mit den Pipettenspitzen zu berühren, um Concanavalin A nicht von der Glasoberfläche der Brunnen zu verdrängen oder zu entfernen.Entfernen Sie das Wasser auf die gleiche Weise wie die Concanavalin A-Lösung und fügen Sie sofort 185 Mikroliter experimentelle Medien in Ihre Mikroskopplatte ein. Lassen Sie die Platte nicht trocken sitzen. Die Platte ist nun bereit für die Zugabe von 50 Mikroliter verdünnter Zellen.Holen Sie sich Ihre vorgewachsene randomisierte 96-Well-Platte. Ihre experimentelle Frage bestimmt, ob die Zellen gesättigt sind oder sich in der Protokollphase befinden und wie viele randomisierte Replikationen im Test verwendet werden sollen. Zentrifugieren Sie Ihre Platte für zwei Minuten bei 411 mal G, um die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination beim Entfernen der Folienabdeckung zu minimieren.Achten Sie darauf, Nie Ihre Platte zu kippen, wenn Sie es handhaben. Wenn Hefe und Medien mit der Folie, die die Platte bedeckt, in Berührung kommen, kann es zu Verunreinigungen über Brunnen kommen. Bereiten Sie zuerst die Platten vor, in die Sie Ihre seriellen Verdünnungen führen.Fügen Sie 90 Mikroliter experimentellemedien zu jeder Ihrer Verdünnungsplatten hinzu. Als nächstes bereiten Sie Ihre Zellen vor. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Folie von Ihrer 96-Well-Platte entfernen, um zu verhindern, dass Tröpfchen von einem Brunnen in einen anderen gelangen.Die Hefe wird aufgrund der Zentrifugation an der Unterseite der Platte konzentriert. Um sicherzustellen, dass Zellen während der Verdünnung gut gemischt werden, fügen Sie immer ein kleines Volumen von Zellen zu einem größeren Medienvolumen hinzu. Fügen Sie dann eine weitere große Menge an Medien in die Mischung ein.Achten Sie darauf, Pipette kräftig bei jedem Schritt mischen. In diesem Video führten wir Verdünnungen für Hefezellen bei Sättigung und synthetischen Komplettmedien durch, die wir 10.000-fach verdünnen werden, um eine Endkonzentration von etwa 4.000 Zellen pro Brunnen in der Mikroskopplatte zu erreichen. Um die Zellen wieder aufzuhängen, pipette nach oben und unten kräftig und bewegen Sie die Pipettenspitze um den Brunnen in einer kreisförmigen Bewegung.Nach dem Mischen sollte es keine Spuren von besiedelter Hefe in einem gut verbleiben, wie hier in gut A1 gesehen. Alle anderen hier gezeigten Brunnen wurden nicht zum Vergleich wieder ausgesetzt. Zählen Sie die Zellen in Ihrer vorgewachsenen Platte, zum Beispiel, mit dem Hämozytometer, und kombinieren Sie mit jedem anderen Stamm, den Sie zu gleichen Anteilen zum gleichen Brunnen hinzufügen. Hier mischen wir die Zellen aus unserer vorgewachsenen Platte mit einem fluoreszierenden Referenzstamm im Verhältnis eins zu eins.Sobald Ihre Zellkonzentrationen standardisiert sind, fügen Sie der ersten seriellen Verdünnungsplatte zehn Mikroliter Zellen hinzu. Dann fügen Sie 100 Mikroliter Medien zu einem Endvolumen von 200 Mikrolitern hinzu. Durch die Zugabe von Zellen und Medien mischen sich Pipette kräftig und bewegen die Pipettenspitze in einer kreisförmigen Bewegung um die Brunnen.Von diesem Punkt an, bis die Zellen der Mikroskopplatte hinzugefügt werden, gehen Sie schnell durch das Protokoll. Als nächstes fügen Sie zehn Mikroliter Hefe von der ersten seriellen Verdünnungsplatte in die zweite serielle Verdünnungsplatte ein. Dann fügen Sie 100 Mikroliter experimentelle Medien hinzu.Gut mischen. Wenn Ihre Hefe keine Tendenz zum Flocken hat, dann sind sie bereit, direkt nach diesem Schritt der Mikroskopplatte hinzugefügt zu werden. Fahren Sie sofort mit der Beschichtung fort.Wenn jedoch die Hefestämme, die Sie verwenden, eine moderate Neigung zum Flocken haben, ist der folgende optionale Beschallungsschritt notwendig. Beim Beschallen mischen die erste Pipette die Hefelösung noch einmal vor der Beschallung. Legen Sie die verdünnte Hefe auf den Beschallungsgerät und tauchen Sie die 96-Well-Pins in die Lösung jedes Brunnens, berühren Sie aber nicht den Boden des Brunnens.Stellen Sie das Beschallungsprogramm ein, das stark genug ist, um flockige Hefezellen zu zerlegen, aber keine Zellen abtötet oder erhöhte Stressreaktionen verursacht. Einige Tests sind möglicherweise erforderlich, um das beste Beschallungsprogramm für ein bestimmtes Experiment zu identifizieren. Sobald das Programm abgeschlossen ist, entfernen Sie die Zellen und fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.15 Mikroliter Hefe aus der zweiten seriellen Verdünnungsplatte in die Mikroskopplatte geben. Pipette nach oben und unten zu mischen, aber tun Sie dies sorgfältig, um zu vermeiden, stören die Concanavalin A an der Unterseite der Brunnen der Platte befestigt. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter experimentellemedien zu einem Endvolumen von 400 Mikrolitern auf die Mikroskopplatte.Pipette gemischt vorsichtig. Bedecken Sie die Platte mit einer atmungsaktiven Membran. Stellen Sie sicher, dass die Kanten der Platte gut versiegelt sind.Zentrifugieren Sie die Mikroskopplatte mit einer Fussel und statischem Freigewebe darunter für zwei Minuten bei 411 mal G, damit die Hefezellen an der Unterseite der Platte an dem Concanavalin A befestigt werden können. Die Platte ist nun bereit, abgebildet zu werden. Wischen Sie am Mikroskop die Ober- und Unterseite der Platte mit einer Fussel und einem statischen freien Abwischen ab und blasen Sie Druckluft auf den Boden der Platte, um Schmutz zu entfernen.Legen Sie die Platte auf das Mikroskop. Stellen Sie sicher, dass sich der A1-Brunnen in der oberen linken Ecke befindet und dass das Mikroskop auf die richtige Temperatur für das Zellwachstum erhitzt wird. Achten Sie auch darauf, dass die Platte sauber in das Mikroskop gesteckt ist und dass der Boden der Platte flach ist.Wenn die Platte eine Kunststoffabdeckung hat, entfernen Sie diese, bevor Sie mit der Mikroskopie beginnen. Dies wird wichtig sein, um gute Bilder für die nachgelagerte Analyse zu erfassen. Wir laden eine automatisch generierte Datei mit den X- und Y-Koordinaten und den Brennpositionen, um die gesamte Mikroskopplatte abzubilden.Wenn Sie eine vorgenerierte Datei verwenden, überprüfen Sie einige Positionen in der Mikroskopplatte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in der richtigen Brennebene befinden. Es ist hilfreich, dass sich die Brennebene leicht über den Zellen befindet, so dass sie von einem dunklen Rand umgeben sind und heller als der Hintergrund sind. Legen Sie die Anzahl der Zeitpunkte und den Zeitpunktabstand fest, den Sie für das Experiment verwenden möchten.Wenn Sie sowohl Wachstumsraten- als auch Fluoreszenzintensitätsdaten erfassen, richten Sie auch ein Fluoreszenz-Bildgebungsprogramm ein. Passen Sie die Helligkeit in jedem zu bebildernden Kanal so an, dass keine Position auf der Mikroskopplatte überbelichtet ist. Testen Sie die Belichtung, die Sie verwenden werden, wenn Sie sich nicht im Live-Modus befinden.Bei fluoreszierenden Bildern sollte die Fluoreszenz mit bloßem Auge sichtbar sein. Ansonsten empfehlen wir jedoch, niedrige Belichtungswerte festzulegen. Entsprechend verteilte Kolonien, die von einzelnen Zellen gesät werden, wachsen in einer Monoschicht entlang der Oberfläche der Platte.Dadurch kann eine automatisierte Bildanalyse verwendet werden, um die Wachstumsrate vieler einzelner Mikrokolonien genau zu berechnen. Fluoreszierende Marker können verwendet werden, um mehrere Stämme zu unterscheiden, die im gleichen Brunnen wachsen. Dadurch können ganze Verteilungen der Wachstumsraten für einzelne Mikrokolonien berechnet werden, die in einer gemeinsamen Umgebung wachsen.Die großen Stichprobengrößen, die mit diesem Experiment erreichbar sind, ermöglichen auch eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Unterschiede zwischen verschiedenen Stämmen oder Wachstumsbedingungen. Hier werden Wachstumsraten für gepaarte Gruppen von Kolonien angezeigt, die in einzelnen Brunnen aus einer Reihe von Mutationsakkumulationslinien und den in-well GFP-Referenzkontrollkolonien angebaut werden. Wenn Zellen auf der Mikroskopplatte verklumpend beobachtet werden, müssen die Klumpen vor der Beschichtung durch Beschallung aufgebrochen werden.Zellen in Klumpen, die nicht aufgebrochen werden, wachsen nicht in einer planaren Mikrokolonie entlang der Plattenoberfläche, was eine korrekte Berechnung der Wachstumsrate unmöglich macht. Nicht alle Medien sind mit dem Mikrokolonie-Wachstumsratentest kompatibel. Einige Medien, einschließlich Medien, die Hefeextrakt enthalten oder einen niedrigen pH-Wert haben, verhindern die Bindung von Zellen an Concanavalin A. Dies führt dazu, dass Zellen im Laufe des Experiments von wachsenden Mikrokolonien wegschwimmen und eine fehlerhafte Wachstumsrate messen.Es ist wichtig, zellenzu vermeiden, zu dicht zu beschichten. Wenn Zellen zu eng plattiert werden, verschmelzen schneller wachsende Mikrokolonien zu früheren Zeitpunkten, die hier als Verlust der Farbverfolgung dargestellt werden. Dieser Effekt kann Schätzungen der Wachstumsrate verzerrt, da langsam wachsende Kolonien weniger wahrscheinlich mit ihren Nachbarn fusionieren, bevor Daten aus ausreichenden Zeitpunkten gesammelt werden.Je nach Wachstumsbedingungen kann eine Teilmenge der Zellen eine Verzögerungsphase durchlaufen, bevor sie zu wachsen beginnt. Es ist wichtig, dies bei der Verwendung von Koloniegebieten zur Berechnung der Wachstumsrate zu berücksichtigen, anstatt eine Wachstumskurve an alle verfügbaren Zeitpunkte anzugleichen. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine Breite von Fragen im Zusammenhang mit Hefewachstum und -entwicklung zu untersuchen.Sein flexibles Mikroplattenformat bedeutet, dass es an andere Hefearten, verschiedene Wachstumsbedingungen, andere Mikroben und potenziell andere Zellen in der Kultur angepasst werden kann.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Forschung

Biologie

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Mit dem Gene Pulser MXcell Elektroporation System zur Primary Cells mit hohem Wirkungsgrad zu transfizieren

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genomweiten Gen-Deletionen in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Von High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse der globalen RNA-Synthese auf der Einzelzellebene folgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hochdurchsatz-Screening Quantitative Expression und Aufreinigung rekombinanter zu Disulfid-reichen Proteine ​​Venom Produziert in Applied<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...