Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
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ナオミ・ジヴ、サーシャ・レヴィ、双李は、このプロトコルの開発に貢献してくれたことに感謝し、共有機器のデビッド・グレシャム、ビデオ制作に協力してくれたマリッサ・ノールに感謝します。この研究は、国立衛生研究所の助成金R35GM118170によってサポートされました。

1. ランダムプレートの作成(実験日前)
<ol><li>成長アッセイで試験される株および条件を計画する。この時点で、任意のウェルにひずみと条件をランダムに割り当てます。 注:プレートの設定を検討する場合、測定で適切に関連するノイズを考慮するために、1つのプレートに1つの歪みと成長条件ごとに複数の反復を含めるのが賢明です。詳細については、「ディスカッション」を参照して?...

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、細胞増殖と遺伝子発現を個々のマイクロコロニーのレベルで同時に監視することを可能にする汎用性の高いアッセイです。これら2つのモダリティを組み合わせることで、ユニークな生物学的洞察が得られます。例えば、以前の研究では、このアッセイを用いて、同時に7,10の両方を測定することにより、アイソジェニ...

成長フェノタイプは酵母のフィットネスに重要に貢献します。自然選択は、有効人口規模の逆数によって異なる成長率を有する系統間を効率的に区別することができ、これは1個1の1を超える可能性がある。さらに、人口内の個体間の成長率の変動は、ベットヘッジ2、3、4、5、6などの生存戦略の基礎となる可能性があるため、進化的に関連するパラメータである。したがって、増殖表現型とその分布を極めて正確に測定できるアッセイは、微生物の研究にとって極めて重要です。ここで述べたマイクロコロニー成長アッセイは、実験ごとに〜105マイクロコロニーの個々の増殖速度測定を生成することができる。したがって、このアッセイは、酵母進化遺伝学とゲノミクスを研究するための強力なプロトコルを提供します。遺伝的に同一の単一細胞の集団内の変動が生成され、維持され、集団適合性7、8、9、10にどのように寄与するかをテストするのに特に適しています。
ここで説明する方法(図1)は、96または384ウェルガラス底板上の液体媒体に成長する細胞の周期的に捕捉された低倍率の明視野画像を使用して、マイクロコロニーへの成長を追跡する。細胞は、顕微鏡板の底部を覆うレクチン・コンカナジンAに付着し、二次元コロニーを形成する。マイクロコロニーは単層で成長するため、マイクロコロニー領域は細胞番号7と高い相関性を持つ。したがって、マイクロコロニーの成長率とラグタイムの正確な推定値は、各マイクロコロニーの面積の変化率を追跡するカスタム画像解析ソフトウェアで生成することができます。さらに、実験のセットアップは、これらのマイクロコロニーで発現する蛍光標識タンパク質の存在量および細胞内局在化を監視することができる。このマイクロコロニー成長アッセイからのデータのダウンストリーム処理は、カスタム分析または既存の画像解析ソフトウェア(画像処理容易(PIE)11)、低倍率、明視野画像からの堅牢なコロニー領域認識およびハイスループット成長解析のためのアルゴリズムによって達成され得る。
マイクロコロニー成長アッセイから得られた増殖率推定値は、多数の単一コロニー測定から生成されるため、非常に正確であり、合理的な規模の実験では、推定値自体よりも数桁小さい標準誤差が存在します。したがって、異なる遺伝子型、治療、または環境条件間の成長速度差を検出するアッセイのパワーは高い。マルチウェルプレート形式により、多くの異なる環境と遺伝子型の組み合わせを1回の実験で比較できます。株が構成的に異なる蛍光マーカーを発現する場合、それらは同じウェルで混合され、その後の画像分析によって区別され、ウェルバイウェルのデータの正規化を可能にすることによってさらに電力を増加させる可能性があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> 図1: プロトコルの概略図 このプロトコルは、実験プレートの調製と画像への細胞の調製である2つの主要なステップに従います。プレートのランダム化と細胞の増殖は、実験日の前に、そして実験日に至るまで行われるべきである。希釈時の各工程での細胞の繰り返し混合は、めっきまでの工程において必須であり、したがって、細胞希釈が完了した直後にめっきできるように、実験プレートを最初に準備することが推奨される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

微生物の成長速度における菌株間および内の不均一性の正確な測定は、ストレス耐性、病原性、およびフィットネスの他の重要な構成要素への遺伝的および環境的な入力を理解するために不可欠です。この原稿は、実験ごとに約105 サッカロミセスセレビシエ の微小コロニーを追跡する顕微鏡ベースのアッセイを記述しています。マルチウェルプレートに固定化された酵母の自動タイムラプスイメージング後、マイクロコロニーの成長率はカスタム画像解析ソフトウェアで容易に解析できます。各マイクロコロニーについて、蛍光タンパク質の発現と局在化、急性ストレスの生存もモニタリングできます。このアッセイにより、株の平均成長率を正確に推定できるほか、クローン集団内の増殖、遺伝子発現、ストレス耐性の不均一性を総合的に測定できます。

このプロトコルの新しい点は、タイムラプスイメージングを通じてマイクロコロニーへの成長を追跡することによって、集団内の個々の細胞の成長率を計算できることである(図2A)。コンカナリアニンAの存在により、マイクロコロニーは平面的に何時間も成長するため、その領域は実験全体を通して追跡することができ、時間の経過とともに領域の自然対数の変化に直?...

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High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

酵母増殖型は、マイクロコロニーに成長する固定化細胞の高度に平行なタイムラプスイメージングを通じて正確に測定される。同時に、ストレス耐性、タンパク質発現、タンパク質の局在化を監視し、統合データセットを生成して、環境と遺伝的の違い、およびイソジェニック細胞間の遺伝子発現不均一性を研究し、成長を調節することができます。

成長と遺伝子発現の不均一性を測定するマイクロコロニーのハイスループットライブイメージング

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

高スループットのプロトコルである酵母細胞は、何千ものマイクロコロニーの成長と遺伝子発現を同時に追跡することができます。株間、環境間、さらには共有環境で増殖した遺伝的に同一の細胞間の差を定量化することができる。このプロトコルは、遺伝子発現レポーターの平均成長率と平均蛍光強度の正確な推定値を生み出します。また、多くの個体のマイクロコロニーがアッセイされるため、成長と発現値の分布全体の正確な推定値が得られます。このプロトコルは、実験プレートの調製とイメージング用の細胞の調製の2つの主要なステップに従います。細胞は希釈および混合の直後にめっきされなければならない。そのため、最初に実験プレートを設定することをお勧めします。このプロトコル全体で細胞が繰り返し混合されていることに気づくでしょう。実験当日、顕微鏡画像に現れる可能性のある結晶を除去するために、アッセイに使用されるすべての培地および他の溶液は、すでに無菌であっても2ミクロンのフィルターで濾過する必要があります。これには、実験メディアとコンカナバリンA溶液が含まれます。次に、顕微鏡板を準備します。井戸のガラス表面を破片や傷から取り除くために、常にプレートの下に糸くずと静的なフリーワイプを保管してください。滅菌ベンチで滅菌技術を使用してください。顕微鏡プレートの各ウェルに1XコンカナリンA溶液とピペット200マイクロリットルの25ミリリットルをフィルター。ピペットを安定させ、適切な高さを確保することをお勧めします。コンカナリンAがウェルの底を均等にコーティングするのを防ぐことができる気泡を除去するために、411倍Gで2分間、糸くずと静的なフリーワイプを備えた顕微鏡プレートを遠心分離する。コンカナジンA溶液を含むプレートを1〜2時間休ませます。実験全体で一貫性を保つ。コンカナバリンAインキュベーションの後、ここで示すように、吸引装置で、または強制的にプレートから溶液を投棄することによって、96ウェルプレートからコンカナバリンAをクリアします。いくつかの液滴が残ります。次に、各ウェルに400マイクロリットルの無菌水を加えて井戸を洗います。コンカナリンA溶液を取り除いた直後に水を追加します。プレートを乾燥させないでください。ウェルのガラス表面からコンカナリンAを置き換えたり除去したりしないように、ピペットチップでプレートのコーティングされた底部に触れないようにすることが重要です。コンカナリンA溶液と同じ方法で水を取り除き、すぐに顕微鏡プレートに185マイクロリットルの実験媒体を加えます。プレートを乾燥させておかないでください。プレートは、希釈された細胞の50マイクロリットルの追加の準備が整いました。あなたの事前に成長したランダム化された96ウェルプレートを取り出します。実験の質問は、細胞が飽和しているか、対数相で、アッセイで使用されるべきランダム化された複製の数を決定します。ホイルカバーを取り外すときにクロスコンタミネーションの可能性を最小限に抑えるために、411倍Gで2分間プレートを遠心します。あなたがそれを扱っているときにあなたの皿を傾けないようにしてください。酵母やメディアがプレートを覆うホイルに接触すると、井戸全体に汚染が発生する可能性があります。まず、あなたの連続希釈を行うプレートを準備します。各希釈プレートに90マイクロリットルの実験用メディアを加えます。次に、セルを準備します。96ウェルプレートからホイルを取り外すときは、1つの井戸からの液滴が別の井戸に入るのを防ぐために非常に注意してください。酵母は遠心分離のためにプレートの底部に濃縮されます。希釈中に細胞が十分に混合されるように、常に少量の細胞を大量のメディアに追加してください。次に、混合物に別の大量のメディアを追加します。すべてのステップでピペットミックスを必ず激しく混ぜます。このビデオでは、飽和状態で酵母細胞の希釈を行い、合成完全な培地を10,000倍に希釈して、顕微鏡プレートのウェルあたり約4,000個の細胞の最終濃度を達成します。細胞を再中断するには、ピペットを激しく上下に動かし、ピペットチップを円運動でウェルの周りに動かします。混合後、よくA1でここで見られるだけでなく、任意の井戸に残っている落ち着いた酵母の痕跡があってはならない。ここに示されている他のすべての井戸は、比較のために再中断されていません。例えば、前に成長したプレートの細胞を血球計で数え、同じウェルに同じ比率で追加する他の株と組み合わせます。ここでは、前に成長したプレートの細胞を蛍光基準株と1対1の比率で混合します。細胞濃度が標準化されたら、10マイクロリットルの細胞を最初のシリアル希釈プレートに加えます。その後、200マイクロリットルの最終体積に100マイクロリットルの培地を加えます。細胞と培地を加えて、ピペットは激しく混ざり合い、ピペット先端を円運動でウェルの周りに移動させます。この時点から、細胞が顕微鏡板に添加されるまで、プロトコルを迅速に進める。次に、第1のシリアル希釈板から2番目のシリアル希釈板に10マイクロリットルの酵母を加えます。その後、それに実験メディアの100マイクロリットルを追加します。よく混ぜます。あなたの酵母が凝集する傾向がない場合、彼らはこのステップの直後に顕微鏡プレートに追加する準備ができています。すぐにめっきに進みます。しかし、使用している酵母株が凝集する中程度の傾向を有する場合は、以下の任意超音波処理ステップが必要になります。超音波処理する場合は、最初のピペットは、超音波処理の前に、もう一度酵母溶液を混合します。希釈した酵母を超音波処理器に置き、96ウェルピンを各ウェルの溶液に沈めますが、井戸の底には触れないでください。凝集酵母細胞を分解するのに十分強い超音波処理プログラムを設定しますが、細胞を殺したり、ストレス応答の上昇を引き起こしません。特定の実験に最適な超音波処理プログラムを特定するために、いくつかのテストが必要な場合があります。プログラムが完了したら、セルを削除し、すぐに次の手順に進みます。2番目のシリアル希釈板から15マイクロリットルの酵母を顕微鏡プレートに加えます。ピペットはミックスするために上下に、しかしプレートの井戸の底に取り付けられたコンカナバリンAを邪魔しないように慎重に行います。次に、実験用培地200マイクロリットルを最終体積400マイクロリットルに加え、顕微鏡プレートに加えます。ピペットは慎重に混ぜます。通気性のある膜でプレートを覆います。プレートのエッジが密閉されていることを確認します。酵母細胞がプレートの底部のコンカナリンAに付着するために、その下に糸くずと静的自由な組織を持つ顕微鏡板を411倍Gで2分間遠心分離する。これで、プレートをイメージ化する準備ができました。顕微鏡では、プレートの上部と下部を糸くずと静的なフリーワイプで拭き取り、圧縮空気をプレートの底に吹き飛ばして破片を取り除きます。プレートを顕微鏡の上に置きます。A1ウェルが左上隅にあり、顕微鏡が細胞成長のために正しい温度に加熱されていることを確認してください。また、プレートが顕微鏡にきちんと押し込まれ、プレートの底が平らであることを確認してください。プレートにプラスチック製のカバーがある場合は、顕微鏡を開始する前にこれを取り外します。これは、ダウンストリーム解析に適した画像をキャプチャするために重要です。自動的に生成されたファイルをX座標とY座標と焦点位置にロードし、顕微鏡プレート全体を画像化します。事前に生成されたファイルを使用する場合は、顕微鏡プレートのいくつかの位置をスポットチェックして、細胞が正しい焦点面にあることを確認します。焦点面が細胞の上にわずかに当てはまり、暗いリムに囲まれ、背景よりも明るくなるので便利です。実験に使用する時間ポイント数と時間間隔を設定します。成長率と蛍光強度の両方のデータを収集する場合は、同様に蛍光イメージングプログラムを設定します。顕微鏡プレート上の位置が露出し過ぎないように、画像化するすべてのチャンネルの明るさを調整します。ライブ モードでないときに使用する露出をテストします。蛍光画像の場合、蛍光は肉眼で見える必要があります。ただし、それ以外の場合は、低露出値を設定することをお勧めします。個々の細胞によって播種された適切に間隔を定めたコロニーは、プレートの表面に沿って単層に成長する。その結果、自動画像解析を使用して、多くの個々のマイクロコロニーの成長率を正確に計算できます。蛍光マーカーは同じ井戸で成長する複数の株を区別するために使用することができる。その結果、共有環境で成長する個々のマイクロコロニーの成長率全体の分布を計算することができます。この実験で達成可能な大きなサンプルサイズはまた異なった株または成長条件間の平均の相違の精密な推定を可能にする。ここで、一組の変異蓄積ラインとインウェルGFP基準対照コロニーから単一のウェルで成長したコロニーのペアセットの増殖率が示されている。細胞が顕微鏡板に凝集して観察される場合、凝集はめっき前に超音波処理によって分割されなければならない。分割されていない塊の細胞は、プレート表面に沿って平面マイクロコロニーで成長せず、成長速度の正しい計算は不可能になります。すべての媒体がマイクロコロニー成長速度アッセイと互換性があるわけではありません。酵母エキスを含むメディアやpHが低いメディアを含む一部の形態のメディアは、細胞のコンカラナバリンAへの結合を防ぎます。めっき細胞をあまりに密に避けることは重要です。細胞があまりにも密接にメッキされると、より速く成長するマイクロコロニーは、以前の時点でマージされ、ここでは色のトラッキングの損失として示されます。この効果は、成長の遅いコロニーが十分な時点からのデータが収集される前に隣人と合併する可能性が低いため、成長率の推定値をバイアスすることができます。増殖条件に応じて、細胞のサブセットは成長を開始する前にラグフェーズを受ける可能性があります。すべての使用可能なタイム ポイントに成長曲線を適合させるのではなく、コロニー領域を使用して成長率を計算する場合は、この点を考慮することが重要です。記載されたプロトコルは、酵母の成長と進化に関連する幅広い質問を調査するために使用することができます。その柔軟なマイクロプレート形式は、それが他の酵母種、異なる成長条件、他の微生物、および潜在的に培養中の他の細胞に適応することができることを意味します。

Research

JoVE Journal

Biology

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のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

腫瘍球の高スループット画像解析：自動的かつ正確にスフェロイドのサイズを測定するための使いやすいソフトウェアアプリケーション

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...