Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
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나오미 지브, 사샤 레비, 슈앙 리(Shuang Li)가 이 프로토콜 개발에 기여한 것에 대해 감사를 표하고, 데이비드 그레샴(David Gresham)은 공유 장비를 제공했으며, 마리사 크놀이 비디오 제작에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R35GM118170의 국가 학회에 의해 지원되었다.

1. 무작위 판 준비 (실험일 이전)
<ol><li>성장 분석으로 테스트할 균주와 조건을 계획합니다. 이 시점에서, 임의로 어떤 우물에 균주와 조건을 할당합니다. 참고: 플레이트 설정을 고려할 때, 측정에서 잘 관련된 소음을 설명하기 위해 단일 플레이트에 변형 및 성장 조건당 둘 이상의 복제본을 포함하는 것이 좋습니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.</li>
	<li>다른 날에 실행되는 플레이트 복...

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

여기서 설명된 프로토콜은 세포 성장 및 유전자 발현이 개별 마이크로콜로니의 수준에서 동시에 모니터링될 수 있도록 하는 다목적 분석이다. 이 두 가지 양식이 결합하면 고유한 생물학적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 이전 연구는 이 분석을 사용하여 TSL1 유전자의 발현과 동종 야생형 세포에서 마이크로콜로니 성장률 사이의 부정적인 상관관계를 동시에7,...

성장 표현형은 효모 피트니스에 매우 기여합니다. 자연 선택은 108명을 초과할 수 있는 유효 인구 규모의 역에 따라 성장률이 다른 혈통을 효율적으로 구별할 수있다. 더욱이, 인구 내개인의 성장률의 변동성은 2,3,4,5,6과같은 생존 전략의 기초역할을 할 수 있기 때문에 진화적으로 관련된 매개 변수이다. 따라서, 성장 표현형및 그 분포의 고도로 정확한 측정을 허용하는 아스약은 미생물의 연구에 중추적인 이다. 여기에 설명된 미세 식민지 성장 분석은 실험 당 ~105 마이크로 콜로니에 대한 개별 성장 속도 측정을 생성 할 수 있습니다. 이 분석법은 따라서 효모 진화 유전학 및 유전체학을 연구하기 위하여 강력한 프로토콜을 제공합니다. 그것은 유전적으로 동일한 단일 세포의 인구 내의 가변성이 생성되고, 유지되고, 인구 적합성7,8,9,10에기여하는 방법을 테스트하는 데 특히 잘 빌려준다.
여기서 설명된 방법은(도 1)을주기적으로 캡처한, 96-384웰 유리 바닥 플레이트에서 액체 미디어에서 성장하는 세포의 저배율 밝은 필드 이미지를 사용하여 마이크로콜로니로의 성장을 추적한다. 세포는 현미경 판의 바닥을 코팅하고 2 차원 식민지를 형성하는 렉틴 concanavalin A를 부착합니다. 마이크로콜로니가 단층에서 자라기 때문에 마이크로콜로니 영역은 세포 번호7과매우 상관관계가 있다. 따라서, 마이크로콜로니 의 성장 속도와 지연 시간의 정확한 추정은 각 마이크로 콜로니의 영역의 변화의 속도를 추적하는 사용자 정의 이미지 분석 소프트웨어로 생성 될 수있다. 더욱이, 실험용 설정은 이러한 마이크로콜로니에서 발현된 형광 표지 단백질의 풍부하고 세포전 소세포 국소화를 모니터링할 수 있다. 이러한 마이크로콜로니 성장 분석에서 데이터의 다운스트림 처리는 맞춤 분석 또는 기존 이미지 분석 소프트웨어(예: 쉽게(PIE)11,GitHub12를통해 사용할 수 있는 저배율, 브라이트필드 이미지로부터의 견고한 콜로니 영역 인식 및 고처리량 성장 분석을 위한 알고리즘으로 달성될 수 있다.
마이크로콜로니-성장 분석에서 파생된 성장률 추정치는 많은 수의 단일 콜로니 측정에서 생성되기 때문에, 표준 오류로 합리적으로 크기의 실험을 위한 추정치 자체보다 몇 배 더 작은 크기로 매우 정확합니다. 따라서 상이한 유전자형, 치료 또는 환경 조건 간의 성장률 차이를 검출하는 분석의 힘이 높다. 멀티웰 플레이트 포맷은 단일 실험에서 수많은 다른 환경과 유전자형 조합을 비교할 수 있게 해줍니다. 균주가 다른 형광 마커를 구성적으로 표현하는 경우, 동일한 우물로 혼합되고 후속 이미지 분석에 의해 구별될 수 있으며, 이는 잘 함으로써 잘 데이터 정규화를 허용함으로써 전력을 더욱 증가시킬 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 회로도 표현. 이 프로토콜은 실험 판의 준비및 화상에 세포의 준비인 두 가지 주요 단계를 따릅니다. 플레이트의 무작위화와 세포의 성장은 실험의 날까지 전에 실시되어야한다. 희석 하는 동안 각 단계에서 세포의 반복 혼합 도금 까지 단계에서 필수적 이다, 따라서 먼저 실험 판을 준비 하는 것이 좋습니다 세포 희석의 완료 시 즉시 도금에 대 한 준비가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

미생물 성장 속도에서 스트레인 내이질성의 정확한 측정은 유전적 및 환경 입력을 스트레스 내성, 병원성 및 기타 피트니스 구성 요소로 이해하는 데 필수적입니다. 이 원고는 실험 당 약 105 Saccharomyces cerevisiae 미세 식민지를 추적하는 현미경 기반 분석서를 설명합니다. 멀티웰 플레이트에 고정된 효모의 자동 타임랩스 이미징 후 맞춤형 이미지 분석 소프트웨어로 미세 콜로니 성장률을 쉽게 분석할 수 있습니다. 각 미세 식민지에 대 한, 발현 및 형광 단백질의 국소화 및 급성 스트레스의 생존또한 모니터링 될 수 있습니다. 이 분석법은 균주의 평균 성장률의 정확한 추정뿐만 아니라 클로나 집단 내에서 성장, 유전자 발현 및 스트레스 내성의 이질성의 포괄적 인 측정을 허용합니다.

이 프로토콜의 참신은 시간 경과 이미징(그림 2A)을통해 마이크로 콜로니로의 성장을 추적하여 인구 내의 개별 세포에 대해 성장 속도를 계산할 수 있다는 것입니다. 마이크로콜로니가 파랑자 방식으로 수시간 동안 자라기 때문에, 그 영역은 실험 전반에 걸쳐 추적될 수 있으며, 시간이 지남에 따라 지역의 자연 로그의 변화에 선형적 맞춤을 관찰한 각 개별 식민지에 대한 성...

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High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

높은 처리량, 효모 세포에 대한 우리의 프로토콜은 동시에 수천 개의 미세 식민지에 대한 성장과 유전자 발현을 추적 할 수 있습니다. 균주 사이의 차이, 환경 사이와 공유 환경에서 자란 유전적으로 동일한 세포 사이의 차이를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유전자 발현 기자의 평균 성장률과 평균 형광 강도의 정확한 추정치를 산출합니다.또한, 많은 개별 마이크로콜로니가 분석되기 때문에 성장과 발현 값의 전체 분포에 대한 정확한 추정치가 얻어진다. 이 프로토콜은 두 가지 주요 단계, 실험 판의 준비 및 이미징을 위한 세포의 준비를 따릅니다. 세포는 희석 및 혼합 후 즉시 도금되어야 합니다.그래서 먼저 실험 판을 설정하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜 을 통해 세포의 반복 혼합을 알 수 있습니다., 도금 까지 단계에 매우 중요 한. 실험 당일, 분석에 사용되는 모든 미디어 및 기타 솔루션은 현미경 이미지에 나타날 수 있는 결정을 제거하기 위해 이미 멸균되더라도 두 개의 미크론 필터로 필터링되어야 합니다.여기에는 실험 매체와 콩카바린 A 솔루션이 포함됩니다. 다음으로 현미경 플레이트를 준비합니다. 우물의 유리 표면을 이물질과 긁힘에서 제거하기 위해 항상 보풀과 정적 프리 와이프를 플레이트 아래에 보관하십시오.멸균 된 벤치에 멸균 기술을 사용합니다. 1X Concanavalin A 용액 및 파이펫 200 마이크로리터의 25 밀리리터를 현미경 플레이트의 각 웰에 걸러넣습니다. 적절한 높이를 보장하기 위해 파이펫을 안정시키는 것이 좋습니다.콘카나베일A가 우물 바닥을 고르게 코팅하는 것을 막을 수 있는 기포를 제거하기 위해 411회 G에서 2분 동안 보풀과 정적 프리 와이프가 있는 현미경 플레이트를 원심분리합니다. Concanavalin A 용액이 들어있는 플레이트가 1 ~ 2 시간 동안 쉬게하십시오. 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하십시오.Concanavalin A 인큐베이션 후, 흡입 장치또는 여기에 표시된 대로 판에서 용액을 강제로 덤프하여 96 웰 플레이트에서 Concanavalin A를 치웁울 수 있습니다. 일부 물방울은 유지됩니다. 다음으로, 각 우물에 멸균 수의 400 마이크로 리터를 추가하여 우물을 씻어.Concanavalin A 용액을 제거한 직후물을 추가합니다. 접시가 건조하게 앉지 마십시오. 우물의 유리 표면에서 Concanavalin A를 대체하거나 제거하지 않으려면 파이펫 팁으로 플레이트의 코팅 된 바닥을 만지지 않는 것이 중요합니다.Concanavalin A 용액과 동일한 방식으로 물을 제거하고 즉시 현미경 플레이트에 실험 용 매체 185 마이크로 리터를 추가하십시오. 접시가 건조하게 앉는 것을 허용하지 마십시오. 플레이트는 이제 희석 된 세포의 50 마이크로 리터를 추가 할 준비가되어 있습니다.미리 재배된 무작위 96웰 플레이트를 검색합니다. 실험 질문은 셀이 포화 상태인지 로그 단계에서 인지, 분석에서 사용해야 하는 무작위 복제 수가 있는지 를 결정합니다. 411회 G에서 2분간 플레이트원심분리하여 호일 덮개를 제거할 때 교차 오염 가능성을 최소화합니다.당신이 그것을 처리 할 때 접시를 기울이지 않도록하십시오. 효모와 미디어가 접시를 덮는 호일과 접촉하면 우물 전체에 오염이 있을 수 있습니다. 먼저 시리얼 희석을 수행 합니다 접시를 준비 합니다.각 희석 플레이트에 90 마이크로리터의 실험 용 미디어를 추가합니다. 다음으로 세포를 준비합니다. 96웰 플레이트에서 호일을 제거하여 한 우물의 물방울이 다른 접시에 들어가지 않도록 매우 주의하십시오.효모는 원심분리로 인해 플레이트 바닥에 집중될 것이다. 희석 중에 세포가 잘 혼합되도록 하려면 항상 더 큰 양의 미디어에 소량의 세포를 추가합니다. 그런 다음 혼합물에 또 다른 대량의 미디어를 추가합니다.모든 단계에서 적극적으로 파이펫 혼합해야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 포화 및 합성 완전 매체에서 효모 세포에 대한 희석제를 수행, 우리는 현미경 플레이트에서 잘 당 약 4, 000 세포의 최종 농도를 달성하기 위해 10, 000 배를 희석할 것이다. 세포를 다시 일시 중단하려면 파이펫을 위아래로 힘차게 내리고 파이펫 끝을 원형 운동으로 우물 주위로 이동합니다.혼합 후, 잘 A1에서 여기에서 볼뿐만 아니라 어떤에 남아있는 정착 효모의 흔적이 없어야한다. 여기에 표시된 다른 모든 우물은 비교를 위해 다시 중단되지 않았습니다. 예를 들어, 전작된 플레이트의 세포를 혈전계와 함께 계산하고 동일한 비율로 동일한 우물에 추가할 다른 균주와 결합합니다. 여기서, 우리는 1 대 1 비율로 형광 기준 변형과 우리의 미리 성장한 접시에서 세포를 혼합합니다.세포 농도가 표준화되면 10 마이크로리터의 셀을 첫 번째 시리얼 희석 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 미디어를 200 마이크로리터의 최종 볼륨에 추가합니다. 세포와 미디어를 모두 추가하면 파이펫이 격렬하게 섞여 파이프 끝을 우물 주위로 원형 모션으로 이동시합니다.이 시점부터 세포가 현미경 플레이트에 추가될 때까지 프로토콜을 통해 신속하게 진행됩니다. 다음으로, 제1 직렬 희석 플레이트에서 효모 10마이크로리터를 제2 직렬 희석 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 실험 매체의 마이크로리터 100을 추가합니다.잘 섞으세요. 효모가 flocculate하는 경향이없는 경우, 그들은바로이 단계 후 현미경 플레이트에 추가 할 준비가되어 있습니다. 도금으로 즉시 진행하십시오.그러나, 사용하는 효모 균주가 적당한 경향을 갖는 경우, 다음과 같은 선택적 초음파 처리 단계가 필요합니다. 초음파 처리하면 첫 번째 파이펫이 초음파 처리 전에 효모 용액을 다시 한 번 혼합합니다. 희석 된 효모를 초음파 처리기에 놓고 96 웰 핀을 각 우물의 용액에 담그지만 우물바닥을 만지지 않습니다.소닉 프로그램을 설정, 이는 충분히 강한 떨어져 flocculated 효모 세포를 분해하지만, 세포를 죽이거나 높은 스트레스 반응을 일으키지 않습니다. 일부 테스트는 주어진 실험에 가장 적합한 초음파 처리 프로그램을 식별하기 위해 필요할 수 있습니다. 프로그램이 완료되면 셀을 제거하고 즉시 다음 단계로 진행합니다.두 번째 시리얼 희석 플레이트에서 효모 15 마이크로리터를 현미경 플레이트에 넣습니다. 파이펫은 위아래로 섞어 주지만, 플레이트 의 우물 바닥에 부착 된 Concanavalin A를 방해하지 않도록 주의 깊게하십시오. 다음으로, 현미경 플레이트에 400 마이크로리터의 최종 부피에 200 마이크로리터의 실험 매체를 추가합니다.파이펫은 조심스럽게 섞입니다. 통기성 멤브레인으로 접시를 덮습니다. 플레이트의 가장자리가 잘 밀봉되어 있는지 확인합니다.효모 세포가 플레이트 의 하단에 있는 Concanavalin A에 부착하기 위하여 411 시간 G에서 2 분 동안 보풀 및 정전기 자유로운 조직으로 현미경 플레이트를 원심분리합니다. 이제 플레이트를 이미지화할 준비가 되었습니다. 현미경에서 보풀과 정적 프리 와이프로 플레이트의 상단과 바닥을 닦고 압축 공기를 플레이트 바닥에 날려 이물질을 제거합니다.접시를 현미경에 놓습니다. A1이 왼쪽 상단 모서리에 있고 현미경이 세포 성장을 위한 올바른 온도로 가열되어 있는지 확인하십시오. 또한 플레이트가 현미경으로 깔끔하게 고정되어 있고 플레이트의 바닥이 평평하다는 것을 확인하십시오.접시에 플라스틱 덮개가 있는 경우 현미경 검사를 시작하기 전에 이를 제거하십시오. 다운스트림 분석을 위해 좋은 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. X 및 Y 좌표와 초점 위치로 자동으로 생성된 파일을 로드하여 전체 현미경 플레이트를 이미지화합니다.미리 생성된 파일을 사용하는 경우, 스팟은 현미경 플레이트의 몇 가지 위치를 확인하여 세포가 올바른 초점 평면에 있는지 확인합니다. 초점이 있는 평면이 세포 위에 약간 상주하여 어두운 테두리로 둘러싸여 배경보다 밝습니다. 실험에 사용할 시간점 수와 시간 포인트 간격을 설정합니다.성장률과 형광 강도 데이터를 모두 수집하는 경우 형광 이미징 프로그램도 설정합니다. 현미경 플레이트의 위치가 과다 노출되지 않도록 모든 채널의 밝기를 이미지화합니다. 라이브 모드에 없을 때 사용할 노출을 테스트합니다.형광 이미지의 경우 형광이 육안으로 볼 수 있어야합니다. 그러나 그렇지 않으면 낮은 노출 값을 설정하는 것이 좋습니다. 개별 세포에 의해 시드된 적절히 간격이 있는 식민지는 플레이트 표면을 따라 단층에서 자랍니다.그 결과, 자동화된 이미지 분석을 사용하여 많은 개별 마이크로콜로니의 성장률을 정확하게 계산할 수 있습니다. 형광 마커는 동일한 우물에서 성장하는 여러 균주를 분화하는 데 사용할 수 있습니다. 그 결과 공유 환경에서 성장하는 개별 마이크로콜로니에 대한 성장률의 전체 분포를 계산할 수 있습니다.이 실험으로 달성 가능한 큰 샘플 크기는 또한 다른 긴장 또는 성장 조건 사이의 평균 차이의 정확한 추정을 허용합니다. 여기서, 돌연변이 축적 선 및 잘 GFP 기준 대조군 콜로니세트에서 단일 우물에서 자란 식민지의 쌍 집합에 대한 성장속도가 표시됩니다. 세포가 현미경 판에 응집하는 것을 관찰하는 경우에, 덩어리는 도금하기 전에 초음파 처리에 의해 분해되어야 합니다.분해되지 않은 덩어리의 세포는 플레이트 표면을 따라 평면 마이크로 콜로니에서 자라지 않아 성장률을 올바르게 계산할 수 없습니다. 모든 미디어가 미세 식민지 성장 속도 분석과 호환되는 것은 아닙니다. 효모 추출물을 포함하거나 pH가 낮은 매체를 포함한 일부 형태의 매체는 Concanavalin A.이 실험 및 잘못된 성장 속도 측정을 통해 성장하는 마이크로 콜로니에서 멀리 떠있는 세포의 결과, Concanavalin A.이 세포의 결합을 방지합니다.너무 조밀하게 세포를 도금하지 않는 것이 중요합니다. 세포가 너무 밀접하게 도금되면, 빠르게 성장하는 마이크로 콜로니는 색상 추적의 손실로 여기에 표시된 이전 시점에서 병합됩니다. 이 효과는 느린 성장 식민지가 충분한 시간 지점에서 데이터를 수집하기 전에 이웃과 병합 할 가능성이 적기 때문에 성장 속도 예측을 편향 시킬 수 있습니다.성장 조건에 따라, 세포의 하위 집합 성장 하기 시작 하기 전에 지연 단계를 겪을 수 있습니다. 콜로니 지역을 사용하여 성장 곡선을 사용 가능한 모든 시간 점에 맞추기보다는 성장률을 계산할 때 이를 설명하는 것이 중요합니다. 설명된 프로토콜은 효모 성장 및 진화와 관련된 광범위한 질문을 조사하는 데 사용될 수 있다.그것의 유연한 마이크로 플레이트 형식은 다른 효모 종, 다른 성장 조건, 그밖 세균 및 배양에 있는 잠재적으로 그밖 세포에 적응될 수 있다는 것을 의미합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

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Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

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