Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

Vi tackar Naomi Ziv, Sasha Levy och Shuang Li för deras bidrag till att utveckla detta protokoll, David Gresham för delad utrustning och Marissa Knoll för hjälp med videoproduktion. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grant R35GM118170.

1. Förberedelse av randomiserade plattor (före experimentdagen)
<ol><li>Planera de stammar och förhållanden som ska testas med tillväxtanalysen. Vid denna tidpunkt, slumpmässigt tilldela stammar och villkor till någon brunn. OBS: När du överväger plåtinställning är det lämpligt att inkludera mer än en replikat per stam och tillväxttillstånd på en enda platta för att ta hänsyn till väl relaterat brus i mätningar. Se Diskussion för mer information.</li>
	<li>Randomisera beräkningsmässigt plats...

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

Protokollet som beskrivs här är en mångsidig analys som gör det möjligt att övervaka celltillväxt och genuttryck samtidigt på nivån för enskilda mikrokolonier. Att kombinera dessa två metoder ger unika biologiska insikter. Till exempel har tidigare arbete använt denna analys för att visa en negativ korrelation mellan uttryck av TSL1-genen och mikrokolonitillväxthastighet i isogena vilda typceller genom att mätabåda samtidigt 7,10. Det är...

Tillväxt fenotyper bidrar kritiskt till jäst fitness. Naturligt urval kan effektivt skilja mellan härstamningar med tillväxthastigheter som skiljer sig åt genom inversen av den effektiva befolkningsstorleken, som kan överstiga 108 individer1. Dessutom är variabilitet av tillväxttakten bland individer inom en population en evolutionärt relevant parameter, eftersom den kan tjäna som grund för överlevnadsstrategier som betsäkring2,3,4,5,6. Därför är analyser som möjliggör mycket exakta mätningar av tillväxt fenotyper och deras fördelningar avgörande för studier av mikroorganismer. Den mikrokoloniska tillväxtanalysen som beskrivs här kan generera individuella tillväxthastighetsmätningar för ~10 5 mikrokolonier per experiment. Denna analys ger därför ett kraftfullt protokoll för att studera jäst evolutionär genetik och genomik. Det lämpar sig särskilt bra för att testa hur variationer inom populationer av genetiskt identiska enstaka celler genereras, underhålls och bidrar till befolkningens kondition7,8,9,10.
Metoden som beskrivs här (Figur 1) använder periodiskt fångade, lågförstoring brightfield bilder av celler som växer i flytande media på en 96- eller 384-brunn glasbottenplatta för att spåra tillväxt till mikrokolonier. Cellerna klibbar sig vid inktinkonanavalin A, som täcker botten av mikroskopplattan och bildar tvådimensionella kolonier. Eftersom mikrokolonerna växer i ett monoskikt är mikrokoloniområdet mycket korrelerat med cellnummer7. Därför kan exakta uppskattningar av mikrokolonisk tillväxthastighet och fördröjningstid genereras med anpassad bildanalysprogramvara som spårar förändringshastigheten för området för varje mikrokoloni. Dessutom kan den experimentella inställningen övervaka överflöd och till och med subcellulära lokaliseringar av fluorescerande märkta proteiner uttryckta i dessa mikrokolonier. Nedströms bearbetning av data från denna mikrofärgade tillväxtanalys kan uppnås genom anpassad analys eller genom befintlig bildanalysprogramvara, till exempel Processing Images Easily (PIE)11, en algoritm för robust igenkänning av koloniområdet och tillväxtanalys med hög genomströmning från lågförstoring, brightfield-bilder, som är tillgänglig via GitHub12.
Eftersom tillväxthastighetsuppskattningar som härrör från mikrokolonitillväxtanalysen genereras från ett stort antal enkolonimätningar är de extremt exakta, med standardfel som är flera storleksordningar mindre än själva uppskattningarna för ett experiment av rimlig storlek. Därför är kraften i analysen för att upptäcka tillväxthastighetsskillnader mellan olika genotyper, behandlingar eller miljöförhållanden hög. Multiwell-plate-formatet gör att många olika miljö- och genotypkombinationer kan jämföras i ett enda experiment. Om stammar utgör olika fluorescerande markörer kan de blandas i samma brunn och särskiljas genom efterföljande bildanalys, vilket kan öka kraften ytterligare genom att tillåta väl-för-brunn-datanormalisering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av protokollet. Detta protokoll följer två huvudsteg, som är förberedelsen av den experimentella plattan och beredningen av cellerna till bild. Randomisering av plattor och tillväxt av celler bör utföras före och fram till experimentdagen. Upprepad blandning av celler i varje steg under utspädning är absolut nödvändigt i stegen fram till plätering, och därför rekommenderas förberedelse av experimentplattan först så att den är klar för plätering omedelbart efter avslutad cellutspädning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

Exakta mätningar av mellan- och inomstams heterogenitet i mikrobiell tillväxthastighet är avgörande för att förstå genetiska och miljömässiga indata i stresstolerans, patogenicitet och andra viktiga komponenter i fitness. Detta manuskript beskriver en mikroskopbaserad analys som spårar cirka 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonier per experiment. Efter automatiserad timelapse-avbildning av jäst immobiliserad i en multiwellplatta analyseras mikrokolonis tillväxthastigheter enkelt med anpassad bildanalysprogramvara. För varje mikrokoloni kan uttryck och lokalisering av fluorescerande proteiner och överlevnad av akut stress också övervakas. Denna analys möjliggör exakt uppskattning av stammars genomsnittliga tillväxttakt, liksom omfattande mätning av heterogenitet i tillväxt, genuttryck och stresstolerans inom klonurpopulationer.

Nyheten med detta protokoll är att tillväxttakten kan beräknas för enskilda celler inom en population genom att spåra deras tillväxt till mikrokolonier genom timelapse imaging (Figur 2A). Eftersom mikrokolonier växer i många timmar på ett planartat sätt på grund av närvaron av concanavalin A, kan deras områden spåras under hela experimentet, och en linjär passform till förändringen i områdets naturliga logg över tiden kan användas för att beräkna tillväxttakten för va...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Jäst tillväxt fenotyper mäts exakt genom mycket parallell tidsfördröjning imaging av immobiliserade celler växer till mikrokolon. Samtidigt kan stresstolerans, proteinuttryck och proteinlokalisering övervakas, vilket genererar integrerade datamängder för att studera hur miljömässiga och genetiska skillnader, liksom genuttrycks heterogenitet bland isogena celler, modulerar tillväxt.

Live imaging av mikrokolonier med hög genomströmning för att mäta heterogenitet i tillväxt och genuttryck

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Vårt protokoll för hög genomströmning, jästceller möjliggör spårning av tillväxt och genuttryck för tusentals mikrokolonier samtidigt. Skillnaden mellan stammar, mellan miljöer och även mellan genetiskt identiska celler som odlas i en gemensam miljö kan kvantifieras. Protokollet ger exakta uppskattningar av den genomsnittliga tillväxttakten och den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos genuttrycksreportrar.Dessutom, eftersom så många enskilda mikrokolonier analyseras, erhålls exakta uppskattningar av hela fördelningar av tillväxt- och uttrycksvärden. Detta protokoll följer två huvudsteg, beredningen av den experimentella plattan och beredningen av cellerna för avbildning. Cellerna måste pläteras omedelbart efter utspädning och blandning.Så vi rekommenderar att du ställer in din experimentella tallrik först. Du kommer att märka den upprepade blandningen av celler i hela det här protokollet, vilket är extremt viktigt i stegen fram till plätering. På experimentdagen måste alla medier och andra lösningar som används för analysen filtreras med ett tvåmikroskopfilter, även om de redan är sterila, för att ta bort kristaller som kan förekomma i mikroskopbilder.Detta inkluderar experimentella medier och Concanavalin A-lösningen. Förbered sedan mikroskopplattan. För att hålla brunnens glasyta fri från skräp och repor, håll alltid ett ludd och statiskt fritt torka under plattan.Använd steril teknik på en steriliserad bänk. Filtrera 25 milliliter 1X Concanavalin En lösning och pipett 200-mikroliter i varje brunn på mikroskopplattan. Vi rekommenderar att du stabiliserar pipetten för att säkerställa rätt höjd.Centrifugera mikroskopplattan med en ludd och statisk fritork under den i två minuter vid 411 gånger G för att avlägsna eventuella luftbubblor som kan förhindra att Concanavalin A jämnt täcker brunnens botten. Låt plattan som innehåller Concanavalin En lösning vila i en till två timmar. Var konsekvent i alla experiment.Efter Concanavalin A inkubation, rensa Concanavalin A från 96 brunn plattan antingen med en suganordning eller genom att kraftfullt dumpa lösningen ur plattan som visas här. Några droppar kommer att finnas kvar. Tvätta sedan brunnarna genom att tillsätta 400 mikroliter sterilt vatten till varje brunn.Tillsätt vattnet omedelbart efter att du har tagit bort Concanavalin A-lösningen. Låt inte plattan sitta torr. Det är viktigt att undvika att vidröra plattans belagda botten med pipettspetsarna för att inte förskjuta eller ta bort Concanavalin A från brunnens glasyta.Ta bort vattnet på samma sätt som Concanavalin A-lösningen och tillsätt omedelbart 185 mikroliter experimentella medier till din mikroskopplatta. Låt inte plattan sitta torr. Plattan är nu klar för tillsats av 50 mikroliter utspädda celler.Hämta din förvuxna randomiserade 96-brunnsplatta. Din experimentella fråga avgör om cellerna är mättade eller i loggfas och antalet randomiserade replikat som ska användas i analysen. Centrifugera din tallrik i två minuter vid 411 gånger G för att minimera risken för korskontaminering när du tar bort foliebeläggningen.Var noga med att aldrig luta din tallrik när du hanterar den. Om jäst och media kommer i kontakt med folien som täcker plattan kan det finnas förorening över brunnar. Förbered först plattorna du kommer att leda dina seriella utspädningar i.Tillsätt 90 mikroliter experimentella medier till var och en av dina utspädningsplattor. Förbered sedan dina celler. Var mycket försiktig när du tar bort folien från din 96-brunnsplatta för att förhindra att droppar från en brunn kommer in i en annan.Jästen kommer att koncentreras i botten av plattan på grund av centrifugation. Om du vill vara säker på att cellerna blandas väl under utspädningen lägger du alltid till en liten volym celler i en större medievolym. Tillsätt sedan en annan stor medievolym till blandningen.Var noga med att pipettblandningen blandas kraftigt i varje steg. I den här videon utförde vi utspädningar för jästceller vid mättnad och syntetiska kompletta medier, som vi kommer att späda ut 10 000 gånger för att uppnå en slutlig koncentration på ca 4 000 celler per brunn i mikroskopplattan. För att åter suspendera cellerna, pipetten upp och ner kraftigt och flytta pipettspetsen runt brunnen i en cirkulär rörelse.Efter blandning bör det inte finnas några spår av sedimenterande jäst kvar i någon brunn som ses här i brunn A1. Alla andra brunnar som visas här har inte återinställts för jämförelse. Räkna cellerna i din förodlade platta, till exempel med hemocytometern, och kombinera med alla andra stammar som du kommer att lägga till samma brunn i lika stora proportioner. Här blandar vi cellerna från vår förodlade platta med en fluorescerande referensstam med ett förhållande på ett till ett.När dina cellkoncentrationer har standardiserats, tillsätt tio mikroliter celler till den första seriell utspädningsplattan. Lägg sedan till 100 mikroliter media till en slutlig volym på 200 mikroliter. Med tillsats av både celler och media blandas pipetten kraftigt och flyttar pipettspetsen runt brunnarna i en cirkulär rörelse.Från och med nu, tills cellerna läggs till i mikroskopplattan, fortsätt snabbt genom protokollet. Tillsätt sedan tio mikroliter jäst från den första seriell utspädningsplattan i den andra seriell utspädningsplattan. Lägg sedan till 100 mikroliter experimentella medier till det.Blanda väl. Om din jäst inte har en tendens att flucculate, är de redo att läggas till mikroskopplattan direkt efter detta steg. Fortsätt omedelbart till plätering.Men om jäststammarna du använder har en måttlig tendens att flockulera, kommer följande valfria ultraljudsbehandlingssteg att vara nödvändigt. Om ultraljudsbehandling, blanda först pipett jästlösningen igen, före ultraljudsbehandlingen. Placera den utspädda jästen på ljuddatorn och sänk ner 96-brunnsstiften i lösningen av varje brunn, men rör inte brunnens botten.Ställ in ultraljudsbehandlingsprogrammet, som är tillräckligt starkt för att bryta isär flocculated jästceller, men dödar inte celler eller orsakar förhöjda stressresponser. Vissa tester kan krävas för att identifiera det bästa ultraljudsbehandling programmet för ett visst experiment. När programmet är klart tar du bort cellerna och går omedelbart vidare till nästa steg.Tillsätt 15 mikroliter jäst från den andra seriell utspädningsplattan i mikroskopplattan. Pipett upp och ner för att blanda, men gör det noggrant för att undvika att störa Concanavalin A fäst på botten av plattans brunnar. Lägg sedan till 200 mikroliter experimentella medier till en slutlig volym på 400 mikroliter, till mikroskopplattan.Pipettblandning försiktigt. Täck plattan med ett membran som andas. Se till att kanterna på plattan är väl förseglade.Centrifugera mikroskopplattan med en ludd och statisk fri vävnad under den i två minuter vid 411 gånger G för att jästcellerna ska fästa på Concanavalin A längst ner på plattan. Plattan är nu klar att avbildas. Torka av toppen och botten av plattan i mikroskopet med en ludd och statisk friservett och blås tryckluft på botten av plattan för att avlägsna skräp.Placera plattan på mikroskopet. Se till att A1-brunnen är i det övre vänstra hörnet och att mikroskopet värms upp till rätt temperatur för celltillväxt. Se också till att plattan är snyggt instoppad i mikroskopet och att botten av plattan är platt.Om plattan har ett plastskydd, ta bort detta innan du börjar mikroskopi. Detta kommer att vara viktigt för att fånga bra bilder för nedströmsanalys. Vi laddar en automatiskt genererad fil med X- och Y-koordinaterna och brännlägena för att avbilda hela mikroskopplattan.Om du använder en förgenererad fil kontrollerar de några positioner i mikroskopplattan för att säkerställa att cellerna är i rätt fokalplan. Det är användbart för fokalplanet att vara något ovanför cellerna så att de är omgivna av en mörk kant och de är ljusare än bakgrunden. Ange antalet tidpunkter och tidspunktsavståndet som du ska använda för experimentet.Om du samlar in både tillväxthastighet och fluorescensintensitetsdata, ställ också in ett fluorescensavbildningsprogram. Justera ljusstyrkan i varje kanal som ska avbildas så att ingen position på mikroskopplattan överexponeras. Testa den exponering du kommer att använda när du inte är i live-läge.För fluorescerande bilder bör fluorescens vara synlig för blotta ögat. Men annars rekommenderar vi att du ställer in låga exponeringsvärden. Lämpligt förrymda kolonier som sås av enskilda celler växer i ett monoskikt längs plattans yta.Som ett resultat kan automatiserad bildanalys användas för att exakt beräkna tillväxttakten för många enskilda mikrokolonier. Fluorescerande markörer kan användas för att differentiera flera stammar som växer i samma brunn. Som ett resultat kan hela fördelningar av tillväxttakt för enskilda mikrokolonier som växer i en delad miljö beräknas.De stora urvalsstorlekar som kan uppnås med detta experiment möjliggör också en exakt uppskattning av genomsnittliga skillnader mellan olika stammar eller tillväxtförhållanden. Här visas tillväxthastigheter för parade uppsättningar kolonier som odlas i enstaka brunnar från en uppsättning mutationsackumuleringslinjer och GFP-referenskontrollkolonierna. Om celler observeras klumpar på mikroskopplattan måste klumpar brytas upp genom ultraljudsbehandling före plätering.Celler i klumpar som inte bryts upp kommer inte att växa i en planär mikrokoloni längs plåtytan, vilket gör korrekt beräkning av tillväxthastighet omöjlig. Inte alla medier är kompatibla med mikrokolonitillväxten. Vissa former av media, inklusive media som innehåller jästextrakt eller har ett lågt pH, förhindrar bindning av celler till Concanavalin A.Detta resulterar i celler som flyter bort från växande mikrokolonier under experimentet och en felaktig tillväxthastighetsmätningar.Det är viktigt att undvika att plätera celler för tätt. När celler pläterats för nära smälter snabbare växande mikrokolonier samman vid tidigare tidpunkter, vilket här visas som en förlust av färgspårning. Denna effekt kan snedvrida tillväxthastighetsuppskattningar eftersom långsamt växande kolonier är mindre benägna att slå samman med sina grannar innan data från tillräckliga tidpunkter samlas in.Beroende på tillväxtförhållanden kan en delmängd av cellerna genomgå en fördröjningsfas innan den börjar växa. Det är viktigt att ta hänsyn till detta när du använder koloniområden för att beräkna tillväxttakten i stället för att anpassa en tillväxtkurva till alla tillgängliga tidpunkter. Det beskrivna protokollet kan användas för att undersöka ett brett spektrum av frågor relaterade till jästtillväxt och evolution.Dess flexibla mikroplåtformat innebär att det kan anpassas till andra jästarter, olika tillväxtförhållanden, andra mikrober och potentiellt andra celler i kulturen.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Hög genomströmning Kvantitativ Expression Screening och rening Tillämpat på rekombinant Disulfide rika Venom proteiner som produceras i<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hög kapacitet bildanalys av tumör spheroids: Ett användarvänligt program för att mäta storleken på sfäroider automatiskt och korrekt

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...