Name: high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression
Uploaded: 2021-04-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

Naomi Ziv, Sasha Levy ve Shuang Li'ye bu protokolün geliştirilmesine katkılarından dolayı, David Gresham'a paylaşılan ekipmanlar için ve Marissa Knoll'a video prodüksiyon konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35GM118170 tarafından desteklendi.

1. Randomize Plakaların Hazırlanması (Deney Gününden Önce)
<ol><li>Büyüme testi ile test edilecek suşları ve koşulları planlayın. Bu noktada, herhangi bir kuyuya rastgele suşlar ve koşullar atayın. NOT: Plaka kurulumu göz önüne alındığında, ölçümlerde iyi ilişkili gürültüyü hesaba katmak için tek bir plakada gerinim ve büyüme durumu başına birden fazla çoğaltmanın dahil edilmesi önerilir. Daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın.</li>
	<li>Farklı günlerde çalıştır...

<ol>
	<li>Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+condition-dependent+intracellular+protein+levels+enables+high-precision+fitness+estimates.">Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates.</a> PloS one. 8 (9), 75320 (2013).</li><li>Kussell, E., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+diversity,+population+growth,+and+information+in+fluctuating+environments.">Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments.</a> Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).</li><li>Thattai, M., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+gene+expression+in+fluctuating+environments.">Stochastic gene expression in fluctuating environments.</a> Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).</li><li>King, O. D., Masel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+bet-hedging+adaptations+to+rare+scenarios.">The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios.</a> Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).</li><li>Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+switching+as+a+survival+strategy+in+fluctuating+environments.">Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments.</a> Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).</li><li>Avery, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+cell+individuality+and+the+underlying+sources+of+heterogeneity.">Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity.</a> Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).</li><li>van Dijk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow-growing+cells+within+isogenic+populations+have+increased+RNA+polymerase+error+rates+and+DNA+damage.">Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage.</a> Nature communications. 6, 7972 (2015).</li><li>Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+Complex+Genetic+Basis+of+Phenotypic+Variation+and+Variability+of+Cellular+Growth.">Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth.</a> Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).</li><li>Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+nongenetic+heterogeneity+in+growth+rate+and+stress+tolerance+of+Saccharomyces+cerevisiae+by+cyclic+AMP-regulated+transcription+factors.">Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors.</a> PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).</li><li>Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+colony+recognition+for+high-throughput+growth+analysis+from+suboptimal+low-magnification+brightfield+micrographs.">Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs.</a> bioRxiv. , (2018).</li><li>Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+nongenetic+determinants+of+cell+growth+variation+assessed+by+high-throughput+microscopy.">Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy.</a> Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).</li><li>Hall, D. W., Joseph, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+frequency+of+beneficial+mutations+across+multiple+fitness+components+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).</li><li>Saleemuddin, M., Husain, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concanavalin+A:+a+useful+ligand+for+glycoenzyme+immobilization--a+review.">Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review.</a> Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).</li><li>Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+details+in+the+distributions:+why+and+how+to+study+phenotypic+variability.">The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability.</a> Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).</li><li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data:+a+practical+guide+for+biologists.">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).</li><li>Bolker, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exemplary+and+surrogate+models:+two+modes+of+representation+in+biology.">Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology.</a> Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, hücre büyümesi ve gen ekspresyonunun aynı anda bireysel mikrokolonlar düzeyinde izlenmesini sağlayan çok yönlü bir testtir. Bu iki modaliteyi birleştirmek benzersiz biyolojik içgörüler sağlar. Örneğin, önceki çalışmalar bu tahlili, aynı anda7,10'unher ikisini de ölçerek Izojenik wildtype hücrelerinde TSL1 geninin ekspresyonu ile mikrokolony büyüme hızı arasında negatif bir korelasyon göstermek i?...

Büyüme fenotipleri maya zindeliği için kritik katkıda bulunur. Doğal seleksiyon, 108 kişiyi aşabilen etkili nüfus büyüklüğünün tersi ile farklılık gösteren büyüme oranları ile soyları verimli bir şekilde ayırt edebilir1. Ayrıca, bir popülasyondaki bireyler arasında büyüme oranlarının değişkenliği evrimsel olarak ilgili bir parametredir, çünkü bahis koruma 2 , 3,4,5,6gibi hayatta kalma stratejilerinin temelini oluşturabilir. Bu nedenle, büyüme fenotiplerinin ve dağılımlarının son derece doğru ölçümlerine izin veren tahliller mikroorganizmaların incelenmesi için çok önemlidir. Burada açıklanan mikrokolony büyüme tahlili, deney başına ~105 mikrokolon için bireysel büyüme hızı ölçümleri oluşturabilir. Bu nedenle bu test, maya evrimsel genetiği ve genomikleri incelemek için güçlü bir protokol sağlar. Genetik olarak özdeş tek hücre popülasyonları içindeki değişkenliğin nasıl üretildiğini, sürdürüldüğünü ve popülasyon kondisyonu 7 ,8,9,10'anasıl katkıda bulunduğunu test etmek için özellikle iyi bir şekilde kendini ödünç verir.
Burada açıklanan yöntem (Şekil 1), mikrokolonlara büyümeyi izlemek için 96 veya 384 kuyulu bir cam tabanlı plaka üzerinde sıvı ortamda yetişen hücrelerin periyodik olarak yakalanan, düşük büyütmeli parlak alan görüntülerini kullanır. Hücreler, mikroskop plakasının altını kaplayan ve iki boyutlu koloniler oluşturan A lektin kontanvalinine yapışır. Mikrokolonlar monolayerde büyüdüğünden, mikrokolony alanı7numaralı hücre ile oldukça ilişkilidir. Bu nedenle, her bir mikrokolony alanının değişim hızını izleyen özel görüntü analizi yazılımı ile mikrokolony büyüme hızı ve gecikme süresi hakkında doğru tahminler oluşturulabilir. Ayrıca, deneysel kurulum, bu mikrokolonlarda ifade edilen floresan etiketli proteinlerin bolluklarını ve hatta hücre altı lokalizasyonlarını izleyebilir. Bu mikrokolonyum büyüme testinden elde edilen verilerin aşağı akış işlemesi, özel analiz veya Görüntüleri Kolayca İşleme (PIE)11, sağlam koloni alanı tanıma ve gitHub12aracılığıyla kullanılabilen düşük büyütmeli, parlak alan görüntülerinden yüksek verimli büyüme analizi için bir algoritma gibi mevcut görüntü analizi yazılımı ile elde edilebilir.
Mikrokolony-büyüme testinden elde edilen büyüme hızı tahminleri çok sayıda tek koloni ölçümünden oluşturulduğundan, makul büyüklükte bir deney için tahminlerden birkaç büyüklük sırasıyla standart hatalarla son derece doğrudur. Bu nedenle, tahlillerin farklı genotipler, tedaviler veya çevresel koşullar arasındaki büyüme hızı farklarını tespit etme gücü yüksektir. Multiwell-plate formatı, çok sayıda farklı ortam ve genotip kombinasyonunun tek bir deneyde karşılaştırılmasını sağlar. Suşlar farklı floresan belirteçleri tam olarak ifade ederse, aynı kuyuda karıştırılabilir ve sonraki görüntü analizi ile ayırt edilebilir, bu da iyi veri normalleştirmesine izin vererek gücü daha da artırabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5.jpg"> Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Bu protokol, deneysel plakanın hazırlanması ve hücrelerin görüntüye hazırlanması olan iki ana adımı izler. Plakaların randomizasyonu ve hücrelerin büyümesi deney gününden önce ve bu güne kadar yapılmalıdır. Seyreltme sırasında her adımda hücrelerin tekrar tekrar karıştırılması, kaplamaya kadar olan adımlarda zorunludur ve bu nedenle deneysel plakanın ilk olarak hazırlanması önerilir, böylece hücre seyreltmenin tamamlanmasından hemen sonra kaplamaya hazırdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62038/62038fig1v5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>General Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Bottletop Filter .22 &#181;m PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CLS431154</td>
			<td>used to filter the media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-772-54</td>
			<td>96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Used to filter the Concanavalin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-127</td>
			<td>reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>07-200-684</td>
			<td>96-well plate seal for pre-growth and freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lint and static free Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>199-2020</td>
			<td>0.2 &#956;m pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cell growth prior to freezing down randomized plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe-Easy sealing membrane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z380059-1PAK</td>
			<td>breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are reccomended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>MGB096-1-2-LG-L</td>
			<td>microscope plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>45-C2010-1G</td>
			<td>Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strains Used</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP026.2A-2C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054c&#916;::Scw11P::GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope with automated stage and autofocus system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput live imaging of microcolonies to measure heterogeneity in growth and gene expression

Mikrobiyal büyüme oranlarındaki suş içi heterojenitenin hassas ölçümleri, stres toleransı, patojenite ve zindeliğin diğer temel bileşenlerine genetik ve çevresel girdileri anlamak için gereklidir. Bu makale, deney başına yaklaşık 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonyasını izleyen mikroskop tabanlı bir tahlil tanımlamaktadır. Mayanın çok katlı bir plakada hareketsiz olarak otomatik olarak zaman atlamalı görüntülenmesi sonrasında, mikrokolony büyüme oranları özel görüntü analiz yazılımı ile kolayca analiz edilir. Her mikrokolony için floresan proteinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ve akut stresin sağkalımları da izlenebilir. Bu tahlil, suşların ortalama büyüme oranlarının kesin olarak tahmin edilmesine ve klonal popülasyonlarda büyüme, gen ekspresyasyonu ve stres toleransında heterojenliğin kapsamlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.

Bu protokolün yeniliği, büyüme hızının bir popülasyondaki bireysel hücreler için zaman atlamalı görüntüleme yoluyla mikrokolonlara büyümelerini izleyerek hesaplanabilmesidir (Şekil 2A). Mikro sömürgeler concanavalin A varlığı nedeniyle düzlemsel bir şekilde saatlerce büyüdüğünden, alanları deney boyunca izlenebilir ve zaman içinde alanın doğal günlüğündeki değişime doğrusal bir uyum, 7,9, 10,<sup...

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression at JoVE.com

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Yüksek verim, maya hücreleri için protokolümüz, aynı anda binlerce mikrokolon için büyüme ve gen ekspresyonunun izlenmesini sağlar. Suşlar arasındaki, ortamlar arasındaki ve hatta paylaşılan bir ortamda yetişen genetik olarak özdeş hücreler arasındaki fark ölçülebilir. Protokol, gen ekspresyon muhabirlerinin ortalama büyüme hızı ve ortalama floresan yoğunluğu hakkında kesin tahminler sürmektedir.Ek olarak, birçok bireysel mikrokolonya test edildiği için, büyüme ve ifade değerlerinin tüm dağılımlarının kesin tahminleri elde edilir. Bu protokol, deneysel plakanın hazırlanması ve hücrelerin görüntüleme için hazırlanması olmak üzere iki ana adımı izler. Hücreler seyreltme ve karıştırmadan hemen sonra kaplanmalıdır.Bu yüzden önce deneysel plakanızı kurmanızı öneririz. Bu protokol boyunca hücrelerin tekrar tekrar karıştırılmasını fark edeceksiniz, bu da kaplamaya kadar olan adımlarda son derece önemlidir. Deney günü, test için kullanılan tüm medya ve diğer çözümler, mikroskop görüntülerinde görünebilecek kristalleri çıkarmak için zaten steril olsalar bile iki mikron filtre ile filtrelenmelidir.Buna deneysel medya ve Concanavalin A çözümü dahildir. Ardından, mikroskop plakasını hazırlayın. Kuyuların cam yüzeyini enkaz ve çiziklerden uzak tutmak için, her zaman plakanın altında tiftik ve statik serbest mendil bulundurun.Sterilize edilmiş bir tezgahta steril teknik kullanın. Mikroskop plakasının her kuyusuna 25 mililitre 1X Concanavalin A çözeltisi ve pipet 200 mikrolitre filtreleyin. Uygun yüksekliği sağlamak için pipet stabilize etmenizi öneririz.Concanavalin A'nın kuyuların altını eşit şekilde kaplamasını önleyebilecek hava kabarcıklarını çıkarmak için mikroskop plakasını tiftik ve statik serbest mendille 411 kez G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Concanavalin A çözeltisini içeren plakayı bir ila iki saat dinlendirin. Deneyleriniz boyunca tutarlı olun.Concanavalin A inkübasyonundan sonra, Concanavalin A'yı 96 kuyu plakasından bir emiş cihazıyla veya burada gösterildiği gibi çözeltiyi zorla plakadan atarak temizleyin. Bazı damlacıklar kalacak. Daha sonra, her kuyuya 400 mikrolitre steril su ekleyerek kuyuları yıkayın.Concanavalin A çözeltisini çıkardıktan hemen sonra suyu ekleyin. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin. Concanavalin A'yı kuyuların cam yüzeyinden yerinden çıkarmamak veya çıkarmamak için plakanın kaplanmış tabanına pipet uçlarıyla dokunmaktan kaçınmak önemlidir.Suyu Concanavalin A çözeltisi ile aynı şekilde çıkarın ve mikroskop plakanıza hemen 185 mikrolitre deneysel ortam ekleyin. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin. Plaka artık 50 mikrolitre seyreltilmiş hücrenin eklenmesi için hazırdır.Önceden yetiştirilmiş randomize 96 kuyu plakanızı alın. Deneysel sorunuz, hücrelerin doymuş veya günlük aşamasında olup olmadığını ve testte kullanılması gereken randomize çoğaltmaların sayısını belirleyecektir. Folyo kaplamayı çıkarırken çapraz kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için plakanızı 411 kez G'de iki dakika santrifüjleyin.Plakanızı kullanırken asla eğmediğinizden emin olun. Maya ve ortam plakayı kaplayan folyo ile temas ederse, kuyularda kirlenme olabilir. İlk önce seri seyreltmelerinizi gerçekleştireceğiniz plakaları hazırlayın.Seyreltme plakalarınızın her birine 90 mikrolitre deneysel ortam ekleyin. Sonra hücrelerinizi hazırlayın. Folyoyu 96 kuyu tabağınızdan çıkarırken, bir kuyudan damlacıkların diğerine girmesini önlemek için son derece dikkatli olun.Maya, santrifüjleme nedeniyle plakanın dibinde yoğunlaştırılacaktır. Seyreltme sırasında hücrelerin iyi karıştığından emin olmak için, her zaman daha büyük bir ortam hacmine küçük bir hücre hacmi ekleyin. Daha sonra karışıma başka bir büyük hacimli ortam ekleyin.Pipet karışımını her adımda kuvvetlice karıştırdığından emin olun. Bu videoda, mikroskop plakasında kuyu başına yaklaşık 4.000 hücrenin son konsantrasyonunu elde etmek için 10.000 kat seyrelteceğimiz doygunlukta maya hücreleri ve sentetik komple ortam için seyreltmeler gerçekleştirdik. Hücreleri yeniden askıya almak için pipet yukarı ve aşağı kuvvetli bir şekilde ve pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyunun etrafında hareket ettirin.Karıştırdıktan sonra, burada kuyu A1'de görüldüğü gibi herhangi bir kuyuda yerleşik maya izi kalmamalıdır. Burada gösterilen diğer tüm kuyular karşılaştırma için yeniden askıya alınmamıştır. Önceden yetiştirdiğiniz plakanızdaki hücreleri, örneğin hemositometre ile sayın ve aynı kuyuya eşit oranlarda ekleyeceğiniz diğer suşlarla birleştirin. Burada, önceden yetiştirildiğimiz tabaktan hücreleri bire bir oranda floresan referans suşu ile karıştırıyoruz.Hücre konsantrasyonlarınız standart hale getirildiğinde, ilk seri seyreltme plakasına on mikrolitre hücre ekleyin. Daha sonra 200 mikrolitrelik son hacme 100 mikrolitre ortam ekleyin. Hem hücrelerin hem de medyanın eklenmesiyle pipet kuvvetli bir şekilde karışır ve pipet ucunu dairesel bir hareketle kuyuların etrafında hareket ettirilir.Bu noktadan sonra, hücreler mikroskop plakasına eklenene kadar, protokol boyunca hızlı bir şekilde ilerleyin. Daha sonra, ilk seri seyreltme plakasından ikinci seri seyreltme plakasına on mikrolitre maya ekleyin. O zaman buna 100 mikrolitre deneysel ortam ekleyin.İyice karıştırın. Mayanızın flocculate eğilimi yoksa, bu adımdan hemen sonra mikroskop plakasına eklenmeye hazırdır. Hemen kaplamaya devam edin.Bununla birlikte, kullandığınız maya suşlarının flokülasyon eğilimi varsa, aşağıdaki isteğe bağlı sonication adımı gerekli olacaktır. Sonicating ise, ilk pipet maya çözeltisini sonication önce bir kez daha karıştırın. Seyreltilmiş mayayı sonicator üzerine yerleştirin ve 96 kuyu pimlerini her bir kuyunun çözeltisine batırın, ancak kuyunun dibine dokunmayın.Floküle maya hücrelerini parçalamak için yeterince güçlü olan, ancak hücreleri öldürmeyen veya yüksek stres tepkilerine neden olmayan sonication programını ayarlayın. Belirli bir deney için en iyi sonication programını tanımlamak için bazı testler gerekebilir. Program tamamlandıktan sonra, hücreleri çıkarın ve hemen bir sonraki adıma geçin.Mikroskop plakasına ikinci seri seyreltme plakasından 15 mikrolitre maya ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için, ancak plakanın kuyularının altına bağlı Concanavalin A'yı rahatsız etmemek için dikkatlice yapın. Ardından, mikroskop plakasına 400 mikrolitrelik son hacme 200 mikrolitre deneysel ortam ekleyin.Pipet dikkatlice karıştırın. Plakayı nefes alabilen bir zarla örtün. Plakanın kenarlarının iyi kapalı olduğundan emin olun.Maya hücrelerinin plakanın altındaki Concanavalin A'ya bağlanması için mikroskop plakasını altında tiftik ve statik serbest doku ile 411 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Plaka artık görüntülenmeye hazır. Mikroskopta, plakanın üst ve alt kısmını tiftik ve statik serbest mendille silin ve döküntüleri gidermek için basınçlı havayı plakanın dibine üfleyin.Plakayı mikroskopa yerleştirin. A1 kuyusunun sol üst köşede olduğundan ve mikroskobun hücre büyümesi için doğru sıcaklığa ısıtıldığından emin olun. Ayrıca plakanın mikroskopa düzgün bir şekilde sıkıştırıldığından ve plakanın tabanının düz olduğundan emin olun.Plakanın plastik bir kapağı varsa, mikroskopiye başlamadan önce bunu çıkarın. Bu, aşağı akış analizi için iyi görüntüler yakalamak için önemli olacaktır. Tüm mikroskop plakasını görüntülemek için X ve Y koordinatları ve odak konumları ile otomatik olarak oluşturulan bir dosyayı yüklüyoruz.Önceden oluşturulmuş bir dosya kullanıyorsanız, hücrelerin doğru odak düzleminde olduğundan emin olmak için mikroskop plakasındaki birkaç konumu kontrol edin. Odak düzleminin hücrelerin biraz üzerinde olması yararlıdır, böylece koyu bir jantla çevrilidirler ve arka plandan daha parlaktırlar. Deneme için kullanacağınız zaman noktası sayısını ve zaman noktası aralığını ayarlayın.Hem büyüme hızı hem de floresan yoğunluğu verilerini topluyorsanız, bir floresan görüntüleme programı da ayarlayın. Görüntülenecek her kanaldaki parlaklığı, mikroskop plakasındaki hiçbir konumun aşırı pozlanmaması için ayarlayın. Canlı modda değilken kullanacağınız pozlamayı test edin.Floresan görüntüler için floresan çıplak gözle görülmelidir. Ancak aksi takdirde düşük pozlama değerleri ayarlamanızı öneririz. Tek tek hücreler tarafından tohumlanan uygun aralıklı koloniler plakanın yüzeyi boyunca bir monolayerde büyür.Sonuç olarak, otomatik görüntü analizi birçok bireysel mikrokolon için büyüme hızını doğru bir şekilde hesaplamak için kullanılabilir. Floresan belirteçler, aynı kuyuda büyüyen birden fazla suşu ayırt etmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, paylaşılan bir ortamda büyüyen bireysel mikrokolonlar için büyüme oranlarının tüm dağılımları hesaplanabilir.Bu deneyle elde edilebilen büyük numune boyutları, farklı suşlar veya büyüme koşulları arasındaki ortalama farklılıkların kesin olarak tahmin edilmesine de olanak sağlar. Burada, bir dizi mutasyon biriktirme çizgisinden tek kuyularda yetişen eşleştirilmiş koloni kümeleri ve kuyu içi GFP referans kontrol kolonileri için büyüme oranları gösterilmiştir. Hücrelerin mikroskop plakasında topaklanma gözlenirse, kümeler kaplamadan önce sonication ile parçalanmalıdır.Parçalanamayan kümelerdeki hücreler plaka yüzeyi boyunca düzlemsel bir mikrokolonyda büyümez ve bu da büyüme hızının doğru hesaplanmasını imkansız hale getirir. Tüm ortamlar mikrokolony büyüme hızı tahlili ile uyumlu değildir. Maya özü içeren veya düşük pH'a sahip medya da dahil olmak üzere bazı medya formları, hücrelerin Concanavalin A.'ya bağlanmasını önler.Hücreleri çok yoğun bir şekilde kaplamaktan kaçınmak önemlidir. Hücreler çok yakından kaplandığında, daha hızlı büyüyen mikrokolonlar daha erken zaman noktalarında birleşir ve burada renk izleme kaybı olarak gösterilir. Bu etki, yavaş büyüyen kolonilerin yeterli zaman noktalarından veri toplanmadan önce komşularıyla birleşme olasılığı daha düşük olduğu için büyüme hızı tahminlerini önyargılı hale getirebilir.Büyüme koşullarına bağlı olarak, hücrelerin bir alt kümesi büyümeye başlamadan önce bir gecikme evresine uğrayabilir. Mevcut tüm zaman noktalarına bir büyüme eğrisi sığdırmak yerine büyüme hızını hesaplamak için koloni alanlarını kullanırken bunu hesaba katmak önemlidir. Açıklanan protokol, maya büyümesi ve evrimi ile ilgili çok çeşitli soruları araştırmak için kullanılabilir.Esnek mikro plaka formatı, diğer maya türlerine, farklı büyüme koşullarına, diğer mikroplara ve potansiyel olarak kültürdeki diğer hücrelere uyarlanabileceği anlamına gelir.

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genom çapında Gen Delesyonlar içinde<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Yüksek Verimli PCR ile

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...