Name: isolating and imaging live, intact pacemaker regions of mouse renal pelvis by vibratome sectioning
Uploaded: 2021-04-30T14:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning at JoVE.com

פרויקט זה מומן על ידי R01 DK124509 מ- NIDDK.

<ol>
	<li>Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyeloureteral+dynamics+in+the+intact+and+chronically+obstructed+multicalyceal+kidney.">Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney.</a> The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).</li><li>Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-coupled+pacemaker+system+in+renal+pelvis+of+the+unicalyceal+kidney.">Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney.</a> TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).</li><li>Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urodynamics+of+the+upper+urinary+tract.">Urodynamics of the upper urinary tract.</a> Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).</li><li>Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+function+of+the+mammalian+renal+papilla+and+the+peristalsis+of+the+surrounding+pelvis.">On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 379-385 (2011).</li><li>Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renal+pelvis:+machinery+that+concentrates+urine+in+the+papilla.">The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla.</a> Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).</li><li>Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+urinary+drainage+and+voiding.">Control of urinary drainage and voiding.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).</li><li>Brading, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+the+mammalian+urinary+outflow+tract.">The physiology of the mammalian urinary outflow tract.</a> Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).</li><li>Dixon, J. S., Gosling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+musculature+of+the+human+renal+calices,+pelvis+and+upper+ureter.">The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter.</a> Journal of Anatomy. 135, 129-137 (1982).</li><li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyeloureteric+peristalsis:+role+of+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cells+of+Cajal-like+cells+as+pacemakers.">Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers.</a> The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).</li><li>Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+spontaneous+electrical+and+contractile+activity+of+smooth+muscle+cells+in+the+rat+upper+urinary+tract.">Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract.</a> Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).</li><li>Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+basis+of+peristalsis+in+the+mammalian+upper+urinary+tract.">Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).</li><li>Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+stimulus+from+the+renal+pelvic+pacemaker+in+pig+kidney.">Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney.</a> Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).</li><li>Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+canine+renal+pelvic+peristalsis.">Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis.</a> Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).</li><li>Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+calyceal+and+pelvic+contraction+rhythms.">Renal calyceal and pelvic contraction rhythms.</a> American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).</li><li>Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cells+underlying+pacemaker+activity+in+the+guinea-pig+upper+urinary+tract.">Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract.</a> Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).</li><li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+electrical+and+Ca2++signals+in+the+mouse+renal+pelvis+that+drive+pyeloureteric+peristalsis.">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).</li><li>Lutzeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+process+of+ureteral+peristalsis+in+multicalyceal+kidneys.">Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys.</a> Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+driving+pyeloureteric+peristalsis:+modulatory+role+of+interstitial+cells.">Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).</li><li>Hashitani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cell+modulation+of+pyeloureteric+peristalsis+in+the+mouse+renal+pelvis+examined+using+FIBSEM+tomography+and+calcium+indicators.">Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ca2++entry+and+Ca2++stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis.">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+electrical+and+Ca2++signals+in+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cell+of+Cajal-like+cells+of+mouse+renal+pelvis.">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis.</a> The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).</li><li>Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+CGRP+on+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+involved+in+generating+spontaneous+contractions+in+the+mouse+renal+pelvis.">Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).</li><li>Iqbal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+ANO1/+TMEM16A+chloride+channel+profiles+distinguish+atypical+and+typical+smooth+muscle+cells+from+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis.">Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).</li><li>Grainger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+classification+of+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis.">Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).</li><li>Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+PDGFR&#945;+(+)+cells+in+spontaneously+active+urogenital+tissues.">Functional heterogeneity of PDGFR&#945; (+) cells in spontaneously active urogenital tissues.</a> Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).</li><li>Hashitani, H., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATYPICAL+or+INTERSTITIAL,+take+your+PIC.">ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ca2++entry+and+Ca2++stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis.">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li><li>Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+standards+for+reporting+animal+experiments+in+The+Journal+of+Physiology+and+Experimental+Physiology.">Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology.</a> Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).</li><li>Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+spatio-temporal+mapping+and+particle+analysis+techniques+to+quantify+intracellular+Ca+2++signaling+in+situ.">Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).</li><li>Leigh, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+machine-learning+driven+analysis+of+Ca2++spatio-temporal+maps.">A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps.</a> Cell Calcium. 91, 102260 (2020).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ה- RP מורכב מאוכלוסייה הטרוגנית של תאים עם צפיפות תאים דיפרנציאלית שנצפו באזורי RP שונים. PIC1s (המכונה בעבר ASMCs) הם הנפוצים ביותר PKJ, שבו פעילות קוצב הלב מקורה24. הפרוטוקול, המתואר כאן, מאפשר לחוקרים לבודד את אזור קוצב הלב משאר כליות העכבר. על ידי חיתוך קטעים של PKJ באמצעות ויברטום, אזורי קוצב הלב של RP (מזוהה כמו רצועות שריר המחוברות parenchyma) נשמרים שלמים, ובכך להרשות לעצמם את השימוש בהדמיה במקום כדי ללמוד במדויק תאי קוצב לב RP בשילוב עם כתבים פלואורסצנטי ספציפי לתא.
בעוד שגישה זו יכולה לספק תובנות חדשות על קצב RP, ישנם כמה שיקולים שהנסיינים צריכים להכיר כדי לשפר את תוצאות ההדמיה ואת יעילות החתך. עבור משתמש לא מאומן, שיטה זו של בידוד PKJ והדמיה קל יותר ללמוד מאשר ניתוח חד טיפוסי של תכשירי RP שטוחים. ניתוח חד של RP מכליות שלמות דורש שבועות של תרגול עקבי כדי לבודד בהצלחה רקמות קיימא לניסויים פיזיולוגיים. מכיוון שפרוטוקול חלוקת רטט זה דורש מעט ידע חד בניתוח, הוא נגיש למשתמשים שאין להם ניסיון בניתוח מבני שריר חלקים אחרים.
עם זאת, יש כמה נקודות קריטיות שיש לציין עבור פרוטוקול זה. דבקות מוצלחת בכליות לצלחת הדגימה של הוויברטום דורשת מיומנות וסבלנות. אם הכליה מכוונת באופן שגוי ונשענת על צד אחד, חלקים עקיפים ולא ישרים ייחתכו. בשל האופי העדין של PKJ, הזווית האלחונים יכולה לעתים קרובות להרוס את רצועות השרירים של אזור קוצב הלב. יתר על כן, הדמיה של מקטעים עקיפים גורמת לרכישת הדמיה לקויה מכיוון שרשתות סלולריות אינן נמצאות בדרך כלל באותו מישור מוקד. ההליך הוא גם זמן רב, עם חתך של כליה אחת לעתים קרובות לוקח עד שעה כדי להשלים, שבמהלכו ההתקנה דורשת ניטור.
בעוד התנועה של vibratome ניתן להאיץ, אם המהירות מוגברת יותר מדי (>20% ממה המומלץ בפרוטוקול), הלהב יהיה לגרוס ולא לחתוך את הכליה בצורה נקייה, וכתוצאה מכך אובדן של מבני PKJ עדינים. באופן דומה, מהירות חיתוך נמוכה מדי עלולה לגרום לסעיף להיות משונן. אופטימיזציה של מהירות חיתוך משרעת להב הוא חיוני. יש להסתפיד גם בטיפול בקטעי רטט. בשל אופיים העדין, שרירי PKJ משובשים בקלות במהלך הטיפול ויכולים לקרוע. משתמש מאומן היטב יוכל לקצור כ 1-2 אזורי PKJ לכל 4 פרוסות כליות המתאימות לניסויי הדמיה Ca2+ . בדרך כלל, מקטעי PKJ שאינם עומדים בקריטריוני הדמיה Ca2+ יש: 1) ביטוי GCaMP גרוע, 2) קיר PKJ מעוות, או 3) קיר PKJ שבור. עבור ניתוח נתונים, ניתן לדגום כ- 3-4 תאים לכל שדה תצוגה (FOV).
בעוד ישנם תאים רבים ב- FOV של PDGFRα-GCaMP6f ו- SMC-GCaMP3 PKJ, תנועות רקמות קטנות לעתים קרובות לא כוללות תאים מניתוח. בדרך כלל ניתן לפתור זאת על-ידי החלת פרוטוקול ייצוב על תמונות. בתנאים שבהם ההכנות אינן זזות, ניתן לדגום לפחות 3-5 תאים ממקטעי PDGFRα-GCaMP6f ו-5-6 תאים ממקטעי SMC-GCaMP3. בדרך כלל, הזמן שנדרש מהקרבת בעלי חיים (הגיל האופטימלי לעכברים הוא 8-16 שבועות) לביצוע ניסויי הדמיה Ca2+ הוא 2-3 שעות, וזה מספיק כדי להבטיח שלמות הרקמה, אם רקמות מודלגות בתפתרונות קרים כקרח לאורך כל ההליך בעת הצורך. לסיכום, פרוטוקול חיתוך ויברטום תואר כאן כדי ליצור הכנות שלמות של אזורי PKJ RP מכליות העכבר. טכניקה זו מאפשרת שימור של אזורי קוצב לב RP עבור inu Ca2 + מחקרי הדמיה לחקור מנגנוני קוצב לב RP.

אגן הכליות (RP) הוא מבנה שרירים חלק בצורת משפך המעביר שתן מהכליה לשופך. ה- RP מעביר שתן על ידי יצירת התכווצויות קצביות קבועות (פריסטלזיס)1,2,3,4,5, אשר דוחף בולוס של שתן מהכליה דיסט לשופכן ובסופו של דבר לשלפוחית השתן, שם הוא מאוחסן עד מיקרופון מתרחש6,7. אובדן פעילות סדירה זו יש השלכות חמורות, כולל הידרונפרוזיס ואי ספיקת כליות1,3,8; לפיכך, יש צורך קריטי ללמוד את המנגנונים שבביד התכווצויות RP קבועות וקצביות. הצירים הנאיסטרליים מקורם באזור הפרוקסימלי ביותר של RP-in צומת האגן-כליות (PKJ)9,10,11,12,13,14,15 (איור 1A-C) ומתפשטים בצורה דיסטית כדי לדחוף שתן מהפפילה ל- RP ( איור1B). פעילות קוצב לב חשמלית נרשמת PKJ כמו depolarizations חולף ספונטני10,11,12,13,15,16,17, אשר נחשבים לנבוע מתאי קוצב לב מיוחדים. תאי קוצב לב אלה, שנקראו בעבר תאי שריר חלקים לא טיפוסיים (ASMCs), נחשבים כדי ליצור או לתאם פעילות קוצב לב ולהניע את הצירים של תאי שריר חלקים "טיפוסיים" (SMCs)9,10,11,18,19,20,21,22,23.
ASMCs הם הנפוצים ביותר ב- RP הפרוקסימלי, ב- PKJ (איור 1A-C), שם התכווצויות פרייסטליות ופעילות קוצב לב חשמלית מקורן5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. מחקר שפורסם לאחרונה על ידי קבוצה זו זיהה קולטן-אלפא גורם גדילה נגזר טסיות דם (PDGFRα), בשילוב עם שרשרת כבדה שריר חלקה (smMHC), כסמן ביולוגי ייחודי עבור תאים ביניים אלה (ICs)24, ממצא כי אומת על ידי קבוצות אחרות25. בהתבסס על המורפולוגיה שלהם ודפוס ביטוי החלבון, תאים אלה נקראו PDGFRα+ IC type 1 (PIC1)24,26. PIC1s מתגוררים בשכבת השריר של PKJ שבו הם מציגים תדר גבוה, קצר משך Ca2 + ארעי, חשב שבבסיס הדור של פוטנציאל קוצב לב24. עם זאת, סוגי תאים אחרים קיימים ב- PKJ, כולל PDGFRα+ ICs שאינם smMHC בשכבה ההרפתקנית. דיווחים קודמים הראו כי ICs שאינם smMHC עשויים להשתתף ברגולציה של פעילות קוצב לב19. עם זאת, מחקר נוסף של קרנות ICs שאינן smMHC מופרע על ידי הבחנה לקויה במהלך Ca2 + מחקרי הדמיה. בדרך כלל, סוגי תאים הטרוגניים בתוך תכשירי RP נטענים ללא הבחנה עם Ca2 +- צבעים רגישים (למשל, Fluo-4). כדי להתגבר על אתגרים אלה וללמוד מגוון סוגי תאים ב- RP, ניתן להשתמש באינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs) כדי לבטא באופן סלקטיבי פלואורופורים רגישים Ca2 +בסוגי תאים של עניין.
רוב המחקרים המבהרים Ca2 + תכונות חולפות PIC1s / ASMCs הושגו על ידי הדמיה תכשירי רקמת RP שטוח יריעה19,21,27. כמו PIC1s הם סוג התא היחיד ב- PKJ לבטא smMHC, ביטוי מותנה של GECI, GCaMP, ב smMHC+ תאים מתאים ללמוד PIC1s בתצורה זו. עם זאת, כמו PIC1s ו PIC2s שניהם מבטאים PDGFRα, ביטוי מותנה של וריאנטים GCaMP ב PDGFRα+ תאים לאסור על הבחנת תאים בתכשירים שטוחים. כדי לעקוף בעיה זו, נעשה שימוש בגישת חתך ויברטומה כדי להבחין PIC1s ו PIC2s על פני קיר הרקמה PKJ24. כדי לחשוף אוכלוסיות תאיות נפרדות אלה, RP היה חתך קורונאלי, מה שמאפשר לזהות PIC2s ב adventitia ו PIC1s בקיר השריר מבוסס על תיוג אימונוהיסטוכימי ידוע דפוסי ביטוי GECI. כתוצאה מגישת הדמיה חדשנית זו של PKJ, נמצאו PIC1s ו- PIC2s להציג תכונות איתות ייחודיות של Ca2 + 24. יתר על כן, על ידי בידוד החלקים הפרוקסימליים ביותר של אזור PKJ (איור 2),אזור קוצב הלב של RP נשמר באופן שלא הושג בעבר. כאן, פרוטוקול מתואר כדי להראות כיצד לבודד תכשירי PKJ מכליות העכבר באמצעות חתך ויברטום, כיצד להגדיר את ההכנות האלה לניסויי הדמיה Ca2+ וכיצד להבחין בין סוגי התאים השונים על פני קיר PKJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>142485</td>
			<td>To store kidney slices in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Petri dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td>Kidney slice calcium imaging dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>152640</td>
			<td>To store kidney slices in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td>Kidney sharp dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>To dry the kidney before applying glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>13148</td>
			<td>GCaMP3 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>24105</td>
			<td>GCaMP6f Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>19079</td>
			<td>smMHC-CRE Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>13148</td>
			<td>PDGFRa-CRE Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B001PILFVY</td>
			<td>For adhering the kidney to the specimen plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Phamco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14083-08</td>
			<td>Used for internal dissecting scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for external dissecting scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used for fine dissection of kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillette Silver Blue double-edge blades</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B009XHQGYO</td>
			<td>For insertion into blade holder of vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>For calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 1001936060</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9677548</td>
			<td>Pins were cut in half to reduce their length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>For gently holding and moving the kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for internal dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>For sharp dissection and cleanup of isolated kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrocheck</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142075</td>
			<td>Optional component for calibrating blade movement during cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200 S Vibrating Blade Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14912000001</td>
			<td>Configuration 1 is used in our protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and imaging live, intact pacemaker regions of mouse renal pelvis by vibratome sectioning

אגן הכליות (RP) הוא מבנה שרירים חלק בצורת משפך המאפשר הובלת שתן תקינה מהכליה לשופך על ידי התכווצויות רגילות והנעה. התכווצויות RP רגילות מסתמכות על פעילות קוצב לב, שמקורה באזור הפרוקסימלי ביותר של ה- RP בצומת האגן-כליות (PKJ). בשל הקושי לגשת לשימור הכנות שלמות של PKJ, רוב החקירות על קצב RP התמקדו אלקטרופיזיולוגיה של תאים בודדים וניסויי הדמיה Ca2+ . למרות גילויים חשובים על RP קצב יצא מעבודה כזו, ניסויים אלה יש כמה מגבלות מהותיות, כולל חוסר היכולת לקבוע במדויק את הזהות התאית בהשעיות מעורבות וחוסר הדמיה במקום של פעילות קוצב לב RP. גורמים אלה הביאו להבנה מוגבלת של המנגנונים העומדים בבסיס התכווצויות RP קצביות רגילות. במאמר זה, פרוטוקול מתואר להכין מקטעים שלמים של PKJ העכבר באמצעות טכניקת חתך ויברטום. על ידי שילוב גישה זו עם עכברים המבטאים כתבים ספציפיים לתא ואינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית, החוקרים עשויים להיות מסוגלים ללמוד בצורה מדויקת יותר את סוגי התאים והמנגנונים הספציפיים האחראים על התכווצויות RP פרייסטלטיות החיוניות להובלת שתן תקינה.

במקום Ca2 + הדמיה של PKJ יכול לחשוף פעילות תאית חשובה של תאי קוצב לב RP. על ידי שימוש בעכברים המבטאים אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (כגון GCaMP), המונעים על ידי מקדמים ספציפיים לתא, ניתן להשיג מידע על קצב RP בדיוק ופרטים שאינם אפשריים מניסויי הדמיה Ca2+ מהתכנות RP שטוחות. תחילתו של ה-PKJ נבדלת על ידי המראה הפתאומי של עיגולי שרירים למחצה המושעים בין רקמת פרנצ'ימל כליות(איור 2C;PKJ פרוקסימלי מוקף בקופסה מקווקות). במהלך סבבי החתך הבאים, המדולה הפנימית הופכת להיות בולטת מרקמת קליפת המוח שמסביב. תחת מיקרוסקופ אור, המדולה הפנימית נראית מפוספסת באזורים, בהירה יותר בצבעה בהשוואה לרקמת קליפת המוח והופסקת על צירה הארוך עם שאר הכליה(איור 2B,D). בשלב זה, אזורי PKJ נוספים יתחילו להופיע. דוגמאות לכך מוצגות באיור 2D (מלבנים מקווקו, H ו- G) שבהם 3 עיגולים למחצה של שרירים מושעים על ידי רקמה ארכימלית. רצועות שרירים אלה יוצבו מקרוב לפפילה הפנימית, ובדרך כלל ישכנו עורק כליות (איור 2D, מלבנים מקווקוים; איור 2F-H,ראשי חץ שחורים). ככל שיותר מקטעים דיסטליים ייגזרים, רצועות שריר אלה ישתלבו כדי ליצור מבנה שלם ומאוחד יותר, המציין את סופו של אזור PKJ (איור 2E). איור 3A,B מציג קטע PKJ בהספק נמוך (4-10x) מעכבר המבטא GCaMP ב- PDGFRα+ תאים (GCaMP6f המובע על ידי Cre-רקומבינאז מובל המונע על ידי Pdgfra). באמצעות ציוני דרך כגון עורק הכליה(איור 3A;כוכבית), הנסיינים צריכים להיות מסוגלים להבחין בקלות בין קיר PKJ דק התלוי בין רקמה ארכימלית (איור 3B; כוכביות). הביטוי של GCaMP6f ברקמה מהונדסת ספציפית זו מתפשט על פני כל רוחב ה- PKJ, הן על פני השריר והן על פני השכבות ההרפתקניות (איור 3C).
ב PDGFRα+ GCaMP6f+ פרוסות כליות, רשת של תאים המשתרעת בדרך כלל על רוחב קיר PKJ תהיה פלואורסצנטית (איור 3C) ולהציג מתנדנד Ca2 + ארעי של משכי זמן ותדרים שונים. PDGFRα+ תאים בקיר PKJ מציגים שני סוגים שונים של משכי זמן ארעיים Ca2+ . בשכבה ההרפתקנית (מכוונת קרוב יותר לקליפת המוח), PDGFRα+ תאים הנמצאים כרשת של תאים ותהליכיהם מוגדרים. PDGFRα+ תאים הרפתקאות מפגינים בתדר נמוך (4 ± 2.7 הרץ) ומשך זמן ארוך (1 ± 0.67 שניות) Ca2+ ארעי. השכבה השנייה של PDGFRα+ תאים, הנמצאת בשכבת השריר (מכוונת קרוב יותר למדולה), מציגה תדרים ומשכי זמן ארעיים דומים של Ca2+ כמו SMC GCaMP3+ תאים (המתוארים להלן) מכיוון שהם מאותו סוג תא.
ב SMC GCaMP3+ פרוסות כליה, שכבה של GCaMP3+ תאים קיימת בשכבת השריר ( איור3D). בשכבה ההרפתקנית לא יהיה אות פלואורסצנטי (איור 3D;כוכבית). GCaMP3+ SMCs בשכבה השרירית מציגים בדרך כלל תדר גבוה (10 ± 4 הרץ) ומשך קצר (632 ± 74 שניות) Ca2+ ארעי. PDGFRα+ תאים הממוקמים ב-PKJ adventitia מעוררים ארעי Ca2+ ארוכי טווח בתדר נמוך(איור 3E,וידאו 1). עם זאת, ניסויי הדמיה Ca2+ מרקמות המבטאות GCaMP3 המונעים על ידי מקדם Myh11 מוגבלים להיבט השרירי של PKJ (איור 3D). בהשוואה ל- PDGFRα+ תאים בהרפתקאות, מחשבים נימיים ירו משך קצר יותר Ca2 + ארעי בתדירות גבוהה יותר(איור 3F, וידאו 2).
בנוסף להבנת תכונות איתות PKJ PDGFRα+ ICs, היישום של טכניקה זו כדי ללמוד סוגי תאים אחרים בכליה בחתך רטט הודגם במאמר זה. לאחר בדיקה מדוקדקת של מדולה הכלייתי (בעכברים המבטאים GCaMP6f ב PDGFRα+ תאים), נצפה מערך של אותות Ca2 + פלואורסצנטי בתוך והסביבה איסוף צינורות(וידאו 3)נצפה. Medullary PDGFRα+ תאים ירו ספונטני Ca2 + ארעי של תדירות משתנה ומשך. מחקרי הדמיה אלה של Ca2+ של מקטעי רטט כליות יכולים להיות מורחבים גם לחקר עורקי כליות (קוטר ~ 50-80 מ"מ) שלעתים קרובות שכנים מקטעי שריר PKJ(איור 2F,G; חצים לבנים). Ca2+ הדמיה של עורקי כליות (מרקמה המבטאת GCaMP בתאי שריר חלקים) מדגים Ca2 + ארעיים מתנדנדים ב- SMCs(וידאו 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig01.jpg"> איור 1: אנטומיה בסיסית של הכליות והמיקום של אזור קוצב הלב PKJ. (A)תרשים של הכליה השלמה המציגה את הכיוון של ה- RP והשופכן. עורק הכליה וריד הכליות מוצגים באדום וכחול, בהתאמה. (B)ניתן לחתוך את הכליה השלמה לאורך מישור קשת כדי לחשוף את ההיבט הפנימי של הכליה, כולל המדולה, פפילה (מדולה דיסטלית שבה מתכנסות צינורות איסוף), ו- RP פרוקסימלי ודיסטלי. (C)ניתן לסלק את המדולה והפפילה כדי לחשוף לחלוטין את ה- PKJ ואת ה- RP של הפרוקס. (D ו- E) מייצגים תמונות אור משודרות מאזור קוצב הלב PKJ ו- RP דיסטלי, בהתאמה. חתך רציף לקראת הקצה הדיסטלי של האגן גורם לחצי העיגולים של השריר באזור PKJ (Di) בשילוב לתוך טבעת שרירית אחת, עבה יותר (Ei) כי מקיף את הפפילה כולה. מלבנים שחורים, מקווקוים בדי ואי מראים אזורים משוערים בחלקי כליות קורונל שבהם נרכשו תמונות אור מועברות. התמצאות של תמונות D ו- E הן 90° נגד כיוון השעון ל- insets בהתאמה (Di ו- Ei). סרגלי קנה מידה ב- D ו- E = 20 מיקרומטר. קיצורים: RP = אגן הכליות; פרוקס RP = אגן כליות פרוקסימלי; PKJ = צומת אגן-כליות; פקעת דם = קולטן קולטן-אלפא-חיובי קולטן-אלפא-חיובי תאים; SMC = תא שריר חלק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig02.jpg"> איור 2: חתך ויברטום של כליות שלמות כדי ליצור חלקים דקים. (A)הכליות מותקנות בצד השופך עד לבסיס הכלי הוויברטום, ולהב סטנדרטי (המחובר לראש הוויברטום) משמש לחיתוך קטעים רציפים מהקצה הפרוקסימלי לקצה הדיסטלי של הכליה. (ב)ייצוג דיאגרמתי של קטע דק שנחתך מכליה עם ציוני דרך מובאים. מקטעי שריר PKJ (מלבן מקווקו שחור) נמצאים לעתים קרובות תלויים בין רקמה א-צחית. (C)תמונה מיקרוסקופית בהירה של קטע כליות פרוקסימלי. המראה של רצועות שרירים תלויות בין רקמה א-צחית מצביע על תחילת התחזיות הפרוקסימליות PKJ (המצוין בתוך מלבן מקווקו לבן). (D)תמונה מיקרוסקופית בהירה המייצגת את האזור האופטימלי שבו ניתן למצוא מקטעי PKJ מרובים (2-3) (אזורים בתוך מלבנים מקווקו לבן). רצועות שריר PKJ דקות תלויות בין פרנצ'ימה הכליות ומתיישרות היטב עם עורקי כליות ומדולה. (ה)תמונה מיקרוסקופית בהירה של קטע כליות דיסטלי. מקטעי שריר בודדים התמזגו כדי ליצור רצועת שריר אחת ורציפה (מלבן מקווקו לבן) המקיף את הפפילה הפנימית (לא קיים בתמונה זו). סרגלי קנה מידה C-E = 500 מיקרומטר. F-H Zoomed (20x) אזורים מלוח D מציינים את המיקום של PKJ (ראשי חץ שחורים), עורקי כליות (ראשי חץ לבנים) ואתרים לחתוך לבידוד PKJ (קווים לבנים מקווקו). סרגלי קנה מידה F-H = 100 מיקרומטר. קיצור: PKJ = צומת אגן-כליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62040/62040fig03.jpg"> איור 3: Ca2+ הדמיה של מקטעי ויברטום. (A)תמונה ייצוגית בהספק נמוך (4x) של מקטע רטט המציינת את המיקום של עורק הכליה (כוכבית). סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B)תמונה מייצגת זום (20x) של PKJ (מסומן) תלוי בין רקמה parenchymal כליות המציין מיקומים של שריר PKJ (ראש חץ לבן), עורק כליות (כוכבית). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) עוצמה גבוהה (40x) תמונה של PKJ מבטא GCaMP ב PDGFRα+ תאים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D)עוצמה גבוהה (20x) תמונה של PKJ מבטא GCaMP בתאי שריר חלקים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (E) מפת Spatiotemporal של Ca2 + ארעי שנדגמו מ- GCaMP+ PDGFRα+ תא המצוין בלוח C. חפש טבלה המקודדת עבור F/F0. (F)מפת Spatiotemporal של Ca2 + ארעי נדגמו מ GCaMP+ PDGFRα+ תא המצוין בלוח D. חפש טבלה המקודדת עבור F/F0. (G)נתונים מייצגים עבור Ca2 + תדר ארעי (Hz) עבור GCaMP+ PDGFRα+ תאים ותאי GCaMP+ smMHC. (H)נתונים מייצגים עבור Ca2 + משך ארעי (ים) עבור GCaMP+ PDGFRα+ תאים ותאי GCaMP+ smMHC. קיצורים: PKJ = צומת אגן-כליות; PDGFRα+ = קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי; smMHC = שרשרת שרירים שרירים חלקה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/62040fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: ספונטני Ca2+ ארעי ב- GCaMP+ PDGFRα+ תאים בחלקים של ויברטום PKJ. קיצורים: PKJ = צומת אגן-כליות; PDGFRα+ = קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_1.avi" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>
וידאו 2: ספונטני Ca2+ ארעי GCaMP+ תאי שריר חלקים בחלקים רטט צומת האגן-כליות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_2.avi" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>
וידאו 3: ספונטני Ca2+ ארעי ב- GCaMP+ PDGFRα+ תאים בקטעי רטט כליות medullary. קיצור: PDGFRα+ = קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם-אלפא-חיובי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_3.avi" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>
וידאו 4: משרעת נמוכה Ca2 + פעילות חולפת בחלקים של רטט של עורק הכליה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62040/Video_4.avi" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning at JoVE.com

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

מטרת פרוטוקול זה היא לבודד אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר באמצעות חלוקת רטט. לאחר מכן ניתן להשתמש במקטעים אלה בהדמיה של מקום Ca2+ כדי לפרט תכונות חולפות Ca2+ של תאי קוצב לב ותאים ביניים אחרים בפרוסות ויברטום.

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

פרוטוקול זה מניב אזורי קוצב לב שלמים של אגן הכליה, איבר השריר החלק בתוך הכליה השאיבה שתן לתוך השופכן לתוך שלפוחית השתן. שלא כמו בידוד תאים מאגן הכליות, גישה זו מספקת שלם בסביבות ממוקמות של אזורי קוצב לב אגן הכליות והכנה פיזיולוגית יותר לחקר קצב אגן הכליות. אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להיאבק לחתוך חלקים אחידים.משתמש בפעם הראשונה חייב להבטיח שהכליה היא רמה על שלב הוויברטום ואינו מאיץ את תהליך החיתוך. באמצעות מלקחיים פנימיים של רקמות ומספריים פנימיים, צובטים את המעיים ומרימים אותם מקיר הבטן. בו זמנית לחתוך את החלק התחתון של המעיים חופשי מהגוף בתריסריון הפרוקסימלי ואת המעי הגס דיסטלי כדי לקבל גישה למרחב retroperitoneal המכיל את הכליות.לצבוט בעדינות ולהרים את הקצה הדיסטלי של השופע עם מלקחיים רקמה. באמצעות מספריים ביתור, לחתוך מתחת השופכנות צבט לכיוון הכליה עד שהוא הפך משוחרר מרקמת החיבור שמסביב. ברגע שהכליות נחשפות, לחלץ אותם בנפרד.מלאו צלחת מצופה אלסטומר מסיליקון בתמיסת KRB קרה כקרח. מעבירים את הכליה לצלחת הניתוח ומוודאים שהיא שקועה לחלוטין. השתמש במספריים קפיציים עדינים ובמלקחיים פנימיים כדי להסיר רקמת שומן מבסיס הכליה כדי לחשוף את אגן הכליה הדיסטלי, או RP, ואת השופך הפרוקסימלי.הסר את השופך הפרוקסימלי וחלק של RP דיסטלי מהבסיס באמצעות מספריים קפיציים עדינים ומלקחיים. פירס כמוסת הכליה החיצונית עם מלקחיים קצה עדין, angling את הטיפים הרחק מגוף הכליה. באמצעות מלקחיים עם כל יד, לצבוט את הקצוות הרופפים של הקפסולה לקלף אותם לגזרים עד קרום כמוסת הכליה הנותרת מוסרת לחלוטין.הכנס סכין גילוח למחזיק הלהב של מכשיר הוויברטום והתאם את זווית הסיווג של הלהב לכ-18 מעלות. התאם את פרמטרי הלהב כאמור בכתב היד של הטקסט, והבטח שעובי מקטע הכליות לא יעלה על 150 מיקרומטר, מה שישפיע לרעה על ניסויי הדמיית יוני סידן. השתמש במלקחיים קהים כדי לתפוס בעדינות ולהסיר את הכליה המוכנה מתמיסת KRB קרה כקרח.מניחים מיד את הכליה על נייר סופג במשך כשנתיים עד ארבע שניות כדי להסיר לחות חיצונית עודפת. גלגלו בעדינות את הכליה על פני הנייר הסופג כדי להבטיח שכל צידי הפרנצ'ימה התייבשו כך שתהיה הידבקות אופטימלית של הכליה לשלב הוויברטום. יש למרוח מיד שכבה דקה של דבק ציאנואקרילט על בסיס צלחת הדגימה של הוויברטום ולהשתמש במלקחיים קהים כדי להניח את צד השופך בכליות על האזור המכוסה בדבק.יש למרוח בעדינות את הלחץ כלפי מטה על החלק העליון של הכליה עם הקצה השטוח של המלקחיים למשך כ-10 עד 20 שניות כדי לייבש את הדבק. אבטחו היטב את צלחת הדגימה לתחתית מגש החיץ והתאמו את רמת פתרון KRB כך שראש הכליה תהיה שקועה לחלוטין. לחיתוך ויברטום אוטומטי, בחר את תנוחות ההתחלה והסיום של מחזור חיתוך להב הוויברטום 0.5 עד 1 ס"מ מהכליה כדי להבטיח שכל מישור הכליות מקבל חתך.התחל את תהליך החיתוך האוטומטי, ודא שהלהב יוצר קשר עם הכליה. באמצעות מלקחיים, לאסוף קטעים המשוחררים מן הכליה ומיד להעביר אותם לבארות בודדות. המשך פרוטוקול החתך והשתמש במיקרוסקופ קל כדי לזהות אזורי PKJ בפרוסות הכליות עד שאזורי PKJ יתבהרו יותר.מלאו צלחת הדמיה מצופה אלסטומר מסיליקון בתמיסת KRB קרה כקרח. מעבירים פרוסת כליה בודדת לצלחת. הכנס סיכות Minutien סביב הפריפריה של פרוסת כליה כדי לאבטח את החלק לבסיס של צלחת ההדמיה.מניחים את צלחת ההדמיה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקלי מסתובב זקוף ומיד להתחיל זלוף עם פתרון KRB. השתמש בעדשה אובייקטיבית טבילת מים בהגדלה נמוכה כדי לאתר את פרוסת הכליה. מרכז את שדה ההדמיה באזורים של הפרוסה שבהם PKJ קיים באמצעות ציוני דרך.לאחר PKJ ממוקם, להשתמש בעדשה יעד טבילת מים הגדלה גבוהה יותר כדי להגדיל את תחום העניין. להבחין תאים שונים של עניין בסוגים שונים של משכי זמן חולפים יוני סידן בקיר PKJ. לאחר זיהוי תאים בעלי עניין, התאם את עוצמת הלייזר כדי להניב יחס אות לרעש טוב ותיעד תמונות בתדר דגימה זמני בין 16 ל-32 הרץ.תמונות מיקרוסקופיות בהירות של חלקי כליות שלמות מראות ציוני דרך מובאים של אזור PKJ יחיד. אזורי PKJ מרובים נוכחים קרוב למודולה הפנימית ולכליה הדיסטלית. מיקומם של עורקי הכליות PKJ וגבולות PKJ מוצגים כאן.מקטע PKJ מעכבר המבטא GCaMP בתאים חיוביים אלפא PDGFR מוצג כאן. קיר PKJ דק תלוי בין רקמה אקדחת פרקימלית ניתן להבחין באמצעות ציוני דרך כגון עורק הכליות. הביטוי של GCaMP6f ברקמה מהונדסת ספציפית זו מתפשט על פני כל רוחב ה- PKJ הן על פני השריר והן על פני השכבות ההרפתקניות.בפרוסות הכליות החיוביות PDGFR אלפא GCaMP6f, רשת של תאים המשתרעת בדרך כלל על פני רוחב דופן PKJ היא פלואורסצנטית ומציגה חולפי סידן מתנדנדים של משכי זמן ותדרים שונים. ב SMC GCaMP3 פרוסות כליה חיוביות, שכבה של תאים חיוביים GCaMP3 נמצאים בשכבת השריר. מפה spatiotemporal מראה כי PDGFR אלפא תאים חיוביים הממוקמים PKJ אדוונטיציה לעורר משך זמן ארוך בתדר נמוך סידן יון חולף, בעוד SMCs ירה ארעי סידן יון משך זמן קצר יותר בתדירות גבוהה יותר.באופן דומה, נצפו גם מערך של אותות יוני סידן פלואורסצנטיים בתוך צינורות איסוף וצינורות סידן מתנדנדים ארעיים ב- SMCs. בעת ניסיון הליך זה, חשוב שהכליה היא ברמה ככל האפשר במהלך חתך ויברטום כדי להבטיח פרוסות כליה אחידות משוחררות מהבלוק. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בידוד חד-תאי, אימונוהיסטוכימיה ומחקרים מולקולריים כדי להגביר את הבנתנו את מנגנוני קוצב הלב באגן הכליות.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

הסרת אקסוגניים חומרים מן החלק החיצוני של ליבות קפואות לחקירה בתוך הקהילות הביולוגיות העתיקה טפח

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

הזרקת hydrodynamic אגן הכליה נגיפי ביטוי של חלבונים בתוך הכליה.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...