Name: isolating and imaging live, intact pacemaker regions of mouse renal pelvis by vibratome sectioning
Uploaded: 2021-04-30T14:00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning at JoVE.com

Этот проект финансировался R01 DK124509 от NIDDK.

<ol>
	<li>Constantinou, C. E., Djurhuus, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyeloureteral+dynamics+in+the+intact+and+chronically+obstructed+multicalyceal+kidney.">Pyeloureteral dynamics in the intact and chronically obstructed multicalyceal kidney.</a> The American Journal of Physiology. 241 (5), 398-411 (1981).</li><li>Constantinou, C. E., Yamaguchi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-coupled+pacemaker+system+in+renal+pelvis+of+the+unicalyceal+kidney.">Multiple-coupled pacemaker system in renal pelvis of the unicalyceal kidney.</a> TheAmerican Journal of Physiology. 241 (5), 412-418 (1981).</li><li>Constantinou, C. E., Hrynczuk, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urodynamics+of+the+upper+urinary+tract.">Urodynamics of the upper urinary tract.</a> Investigative Urology. 14 (3), 233-240 (1976).</li><li>Schmidt-Nielsen, B., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+function+of+the+mammalian+renal+papilla+and+the+peristalsis+of+the+surrounding+pelvis.">On the function of the mammalian renal papilla and the peristalsis of the surrounding pelvis.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 379-385 (2011).</li><li>Dwyer, T. M., Schmidt-Nielsen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renal+pelvis:+machinery+that+concentrates+urine+in+the+papilla.">The renal pelvis: machinery that concentrates urine in the papilla.</a> Physiology. 18 (1), 1-6 (2003).</li><li>Hill, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+urinary+drainage+and+voiding.">Control of urinary drainage and voiding.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 10 (3), 480-492 (2015).</li><li>Brading, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+the+mammalian+urinary+outflow+tract.">The physiology of the mammalian urinary outflow tract.</a> Experimental Physiology. 84 (1), 215-221 (1999).</li><li>Dixon, J. S., Gosling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+musculature+of+the+human+renal+calices,+pelvis+and+upper+ureter.">The musculature of the human renal calices, pelvis and upper ureter.</a> Journal of Anatomy. 135, 129-137 (1982).</li><li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyeloureteric+peristalsis:+role+of+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cells+of+Cajal-like+cells+as+pacemakers.">Pyeloureteric peristalsis: role of atypical smooth muscle cells and interstitial cells of Cajal-like cells as pacemakers.</a> The Journal of Physiology. 576, 695-705 (2006).</li><li>Lang, R. J., Takano, H., Davidson, M. E., Suzuki, H., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+spontaneous+electrical+and+contractile+activity+of+smooth+muscle+cells+in+the+rat+upper+urinary+tract.">Characterization of the spontaneous electrical and contractile activity of smooth muscle cells in the rat upper urinary tract.</a> Journal of Urology. 166 (1), 329-334 (2001).</li><li>Lang, R. J., Exintaris, B., Teele, M. E., Harvey, J., Klemm, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+basis+of+peristalsis+in+the+mammalian+upper+urinary+tract.">Electrical basis of peristalsis in the mammalian upper urinary tract.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 25 (5), 310-321 (1998).</li><li>Morita, T., Ishizuka, G., Tsuchida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+stimulus+from+the+renal+pelvic+pacemaker+in+pig+kidney.">Initiation and propagation of stimulus from the renal pelvic pacemaker in pig kidney.</a> Investigative Urology. 19 (3), 157-160 (1981).</li><li>Tsuchida, S., Morita, T., Harada, T., Kimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+and+propagation+of+canine+renal+pelvic+peristalsis.">Initiation and propagation of canine renal pelvic peristalsis.</a> Urologia Internationalis. 36 (5), 307-314 (1981).</li><li>Yamaguchi, O. A., Constantinou, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+calyceal+and+pelvic+contraction+rhythms.">Renal calyceal and pelvic contraction rhythms.</a> American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 257 (4), 788-795 (1989).</li><li>Klemm, M. F., Exintaris, B., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cells+underlying+pacemaker+activity+in+the+guinea-pig+upper+urinary+tract.">Identification of the cells underlying pacemaker activity in the guinea-pig upper urinary tract.</a> Journal of Physiology. 519 (3), 867-884 (1999).</li><li>Lang, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+electrical+and+Ca2++signals+in+the+mouse+renal+pelvis+that+drive+pyeloureteric+peristalsis.">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in the mouse renal pelvis that drive pyeloureteric peristalsis.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 37 (4), 509-515 (2010).</li><li>Lutzeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+process+of+ureteral+peristalsis+in+multicalyceal+kidneys.">Pacemaker process of ureteral peristalsis in multicalyceal kidneys.</a> Urologia Internationalis. 37 (4), 240-246 (1982).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+driving+pyeloureteric+peristalsis:+modulatory+role+of+interstitial+cells.">Pacemaker mechanisms driving pyeloureteric peristalsis: modulatory role of interstitial cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 77-101 (2019).</li><li>Hashitani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+cell+modulation+of+pyeloureteric+peristalsis+in+the+mouse+renal+pelvis+examined+using+FIBSEM+tomography+and+calcium+indicators.">Interstitial cell modulation of pyeloureteric peristalsis in the mouse renal pelvis examined using FIBSEM tomography and calcium indicators.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (5-6), 797-813 (2017).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ca2++entry+and+Ca2++stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis.">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Parkington, H. C., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+electrical+and+Ca2++signals+in+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+and+interstitial+cell+of+Cajal-like+cells+of+mouse+renal+pelvis.">Spontaneous electrical and Ca2+ signals in typical and atypical smooth muscle cells and interstitial cell of Cajal-like cells of mouse renal pelvis.</a> The Journal of Physiology. 583, 1049-1068 (2007).</li><li>Hashitani, H., Lang, R. J., Mitsui, R., Mabuchi, Y., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+effects+of+CGRP+on+typical+and+atypical+smooth+muscle+cells+involved+in+generating+spontaneous+contractions+in+the+mouse+renal+pelvis.">Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (8), 2030-2045 (2009).</li><li>Iqbal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+and+ANO1/+TMEM16A+chloride+channel+profiles+distinguish+atypical+and+typical+smooth+muscle+cells+from+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis.">Potassium and ANO1/ TMEM16A chloride channel profiles distinguish atypical and typical smooth muscle cells from interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 165 (7), 2389-2408 (2012).</li><li>Grainger, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+classification+of+interstitial+cells+in+the+mouse+renal+pelvis.">Identification and classification of interstitial cells in the mouse renal pelvis.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3283-3307 (2020).</li><li>Hashitani, H., Mitsui, R., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+PDGFR&#945;+(+)+cells+in+spontaneously+active+urogenital+tissues.">Functional heterogeneity of PDGFR&#945; (+) cells in spontaneously active urogenital tissues.</a> Neurourology and Urodynamics. 39 (6), 1667-1678 (2020).</li><li>Hashitani, H., Lang, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATYPICAL+or+INTERSTITIAL,+take+your+PIC.">ATYPICAL or INTERSTITIAL, take your PIC.</a> Journal of Physiology. 598 (15), 3061-3062 (2020).</li><li>Lang, R. J., Hashitani, H., Tonta, M. A., Suzuki, H., Parkington, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Ca2++entry+and+Ca2++stores+in+atypical+smooth+muscle+cell+autorhythmicity+in+the+mouse+renal+pelvis.">Role of Ca2+ entry and Ca2+ stores in atypical smooth muscle cell autorhythmicity in the mouse renal pelvis.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (8), 1248-1259 (2007).</li><li>Grundy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+standards+for+reporting+animal+experiments+in+The+Journal+of+Physiology+and+Experimental+Physiology.">Principles and standards for reporting animal experiments in The Journal of Physiology and Experimental Physiology.</a> Experimental Physiology. 100 (7), 755-758 (2015).</li><li>Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+spatio-temporal+mapping+and+particle+analysis+techniques+to+quantify+intracellular+Ca+2++signaling+in+situ.">Applications of spatio-temporal mapping and particle analysis techniques to quantify intracellular Ca 2+ signaling in situ.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-13 (2019).</li><li>Leigh, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+machine-learning+driven+analysis+of+Ca2++spatio-temporal+maps.">A high throughput machine-learning driven analysis of Ca2+ spatio-temporal maps.</a> Cell Calcium. 91, 102260 (2020).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

RP состоит из гетерогенной популяции клеток с дифференциальной плотностью клеток, наблюдаемой в различных областях RP. PIC1 (ранее называемые ASMC) наиболее распространены в PKJ, где активность кардиостимулятора возникает24. Протокол, описанный здесь, позволяет исследователям изолировать область кардиостимулятора от остальной части почки мыши. Разрезая участки PKJ с использованием вибратома, области кардиостимулятора RP (идентифицированные как мышечные полосы, прикрепленные к паренхиме) остаются нетронутыми, что позволяет использовать визуализацию in situ для точного изучения клеток кардиостимулятора RP в сочетании с клеточными флуоресцентными репортерами.
Хотя этот подход может дать новое представление о темповом RP, есть некоторые соображения, с которыми экспериментаторы должны быть знакомы для улучшения результатов визуализации и эффективности секционирования. Для неподготовленного пользователя этот метод изоляции и визуализации PKJ легче освоить, чем типичный резкий рассечение препаратов RP с плоским листом. Резкое рассечение РП из целых почек требует недель последовательной практики, чтобы успешно изолировать жизнеспособные ткани для физиологических экспериментов. Поскольку этот протокол сечения вибратома требует небольших острых знаний о рассечении, он доступен для пользователей, которые не имеют опыта вскрытия других гладкомышеных структур.
Тем не менее, есть некоторые критические моменты, которые следует отметить для этого протокола. Успешное прилипание почек к пластине образца вибратома требует ловкости и терпения. Если почка ориентирована неправильно и наклонена в одну сторону, будут обрезаны косые, а не прямые участки. Из-за деликатного характера PKJ косой угол часто может разрушить мышечные полосы области кардиостимулятора. Кроме того, визуализация косых участков приводит к плохому получению изображений, поскольку клеточные сети обычно не находятся в одной фокальной плоскости. Процедура также занимает много времени, при этом секционирование одной почки часто занимает до часа, в течение которого установка требует мониторинга.
В то время как движение вибратома может быть ускорено, если скорость увеличивается слишком сильно (>20%, чем рекомендуется в протоколе), лезвие будет измельчать, а не чисто резать почку, что приводит к потере деликатных структур PKJ. Аналогичным образом, слишком низкая скорость резания может привести к тому, что секция станет неровной. Оптимизация скорости резания и амплитуды лезвия имеет важное значение. Необходимо также соблюдать осторожность при обращении с вибратомными секциями. Из-за своей деликатной природы мышцы PKJ легко нарушаются во время обработки и могут порваться. Хорошо обученный пользователь сможет собрать примерно 1-2 области PKJ на 4 среза почки, которые подходят для экспериментов с визуализацией Ca2 +. Как правило, участки PKJ, которые не соответствуют критериям визуализации Ca2+, имеют: 1) плохую экспрессию GCaMP, 2) искаженную стенку PKJ или 3) сломанную стенку PKJ. Для анализа данных можно было бы взять пробу примерно по 3-4 ячейки на поле зрения (FOV).
В то время как в FOV PDGFRα-GCaMP6f и SMC-GCaMP3 PKJ есть много клеток, небольшие движения тканей часто исключают клетки из анализа. Обычно эту проблему можно решить, применив протокол стабилизации к изображениям. В условиях, когда препараты не перемещаются, по меньшей мере 3-5 клеток могут быть отобраны из секций PDGFRα-GCaMP6f и 5-6 клеток из секций SMC-GCaMP3. Как правило, время, занимаемое от жертвоприношения животных (оптимальный возраст для мышей составляет 8-16 недель) до выполнения экспериментов с визуализацией Ca2+, составляет 2-3 ч, что достаточно для обеспечения целостности тканей, если ткани инкубируются в ледяных растворах на протяжении всей процедуры, когда это необходимо. Таким образом, здесь был описан протокол резки вибратома для генерации неповрежденных препаратов областей RP PKJ из почки мыши. Этот метод позволяет сохранить области кардиостимулятора RP для исследований визуализации in situ Ca2 + для изучения механизмов кардиостимулятора RP.

Почечная лоханка (RP) представляет собой воронкообразную гладкую мышечную структуру, которая транспортирует мочу из почки в мочеточник. РП транспортирует мочу, генерируя регулярные ритмические сокращения (перистальтика)1,2,3,4,5,которые выталкивают болюс мочи из почки дистально в мочеточник и, в конечном счете, в мочевой пузырь, где она хранится до тех пор, пока не произойдет мочеиспускание6,7. Потеря этой регулярной активности имеет тяжелые последствия, включая гидронефроз и почечную недостаточность1,3,8; следовательно, существует острая необходимость в изучении механизмов, лежащих в основе регулярных, ритмичных сокращений РП. Перистальтические сокращения возникают из наиболее близкой области RP-в тазово-почечном соединении (PKJ)9,10,11, 12,13,14,15 (Фиг.1A-C)и распространяются дистально для выталкивании мочи из сосочка в РП(Рисунок 1В). Электрическая активность кардиостимулятора регистрируется в PKJ как спонтанные переходные деполяризации10,11,12,13,15, 16,17,которые, как полагают, возникают из специализированных клеток кардиостимулятора. Считается, что эти кардиостимуляторы, ранее называемые атипичными гладкомышечными клетками (ASMC), генерируют или координируют активность кардиостимулятора и управляют сокращениями «типичных» гладкомышечных клеток (SMC)9,10,11, 18,19,20, 21,22,23.
ASMC наиболее распространены в проксимальном RP, на PKJ(Рисунок 1A-C),где перистальтические сокращения и электрическая активность кардиостимулятора возникают5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22. Недавно опубликованное исследование этой группы идентифицировало рецептор фактора роста тромбоцитов-альфа (PDGFRα) в сочетании с тяжелой цепью гладкомышеского миозина (smMHC) в качестве уникального биомаркера для этих интерстициальных клеток (ИС)24,что было подтверждено другими группами25. Основываясь на их морфологии и структуре экспрессии белка, эти клетки были названы PDGFRα+ IC типа 1 (PIC1)24,26. PIC1 находятся в мышечном слое PKJ, где они отображают высокочастотные, кратковременные переходные периоды Ca2 +, которые, как считается, лежат в основе генерации потенциалов кардиостимулятора24. Однако в PKJ существуют и другие типы клеток, в том числе несмМГК-экспрессирующие PDGFRα+ ИС (PIC2s) в адвентитном слое. В предыдущих докладах высказывались предположение о том, что ИС, не являющиеся smMHC, могут участвовать в регулировании деятельности кардиостимуляторов19. Однако дальнейшему изучению ИС, не являющихся smMHC, препятствует плохое различие во время исследований визуализации Ca2+. Как правило, гетерогенные типы клеток в препаратах RP без разбора нагружаются Ca2+-чувствительными красителями (например, Fluo-4). Чтобы преодолеть эти проблемы и изучить различные типы клеток в RP, генетически закодированные индикаторы Ca2 + (GECIs) могут быть использованы для селективной экспрессии Ca2 +-чувствительных флуорофоров в интересующих типах клеток.
Большинство исследований, разъясняющих переходные свойства Ca2+ в PIC1s/ASMC, были достигнуты путем визуализации тканевых препаратов RP с плоским листом19,21,27. Поскольку PIC1s являются единственным типом клеток в PKJ для экспрессии smMHC, условная экспрессия GECI, GCaMP, в smMHC+ клетках подходит для изучения PIC1s в этой конфигурации. Однако, поскольку PIC1s и PIC2 экспрессируют PDGFRα, условная экспрессия вариантов GCaMP в клетках PDGFRα+ запрещает различение клеток в препаратах с плоским листом. Чтобы обойти эту проблему, был использован подход к разделу вибратома для различения PIC1 и PIC2 по всей стенке ткани PKJ24. Чтобы выявить эти дискретные клеточные популяции, RP был разделен коронально, что позволило идентифицировать PIC2s в адвентициях и PIC1 в мышечной стенке на основе известных иммуногистохимических моделей маркировки и экспрессии GECI. В результате этого нового подхода к визуализации PKJ было обнаружено, что PIC1 и PIC2 демонстрируют различные сигнальные свойства Ca2+ 24. Кроме того, путем выделения наиболее близких участков области PKJ(рисунок 2)область кардиостимулятора RP была сохранена таким образом, который не был достигнут ранее. Здесь описан протокол, чтобы показать, как изолировать препараты PKJ из почки мыши с помощью вибратомного сечения, как настроить эти препараты для экспериментов с визуализацией Ca2 + и как различать различные типы клеток через стенку PKJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>142485</td>
			<td>To store kidney slices in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Petri dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td>Kidney slice calcium imaging dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well culture plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>152640</td>
			<td>To store kidney slices in</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td>Kidney sharp dissection dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td>To dry the kidney before applying glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>13148</td>
			<td>GCaMP3 Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129S-Gt(ROSA)26Sor/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>24105</td>
			<td>GCaMP6f Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6.FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>19079</td>
			<td>smMHC-CRE Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>13148</td>
			<td>PDGFRa-CRE Mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B001PILFVY</td>
			<td>For adhering the kidney to the specimen plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Phamco-Aaper</td>
			<td>SDA 2B-6</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14083-08</td>
			<td>Used for internal dissecting scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>Used for external dissecting scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Used for fine dissection of kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillette Silver Blue double-edge blades</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B009XHQGYO</td>
			<td>For insertion into blade holder of vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>For calcium imaging analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>NDC 1001936060</td>
			<td>For anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9677548</td>
			<td>Pins were cut in half to reduce their length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon elastomer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9285739</td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Adson Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91106-12</td>
			<td>For gently holding and moving the kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for internal dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>For sharp dissection and cleanup of isolated kidney</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrocheck</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14048142075</td>
			<td>Optional component for calibrating blade movement during cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200 S Vibrating Blade Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14912000001</td>
			<td>Configuration 1 is used in our protocol</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and imaging live, intact pacemaker regions of mouse renal pelvis by vibratome sectioning

Почечная лоханка (РП) представляет собой воронкообразную гладкую мышечную структуру, которая облегчает нормальную транспортировку мочи из почки в мочеточник регулярными, пропульсивными сокращениями. Регулярные сокращения RP зависят от активности кардиостимулятора, которая происходит из наиболее проксимальной области RP в тазово-почечном соединении (PKJ). Из-за трудностей с доступом и сохранением неповрежденных препаратов PKJ большинство исследований по кардиостимулятору RP были сосредоточены на одноклеточной электрофизиологии и экспериментах с визуализацией Ca2+. Хотя в результате такой работы появились важные откровения о темповом замещения RP, эти эксперименты имеют несколько внутренних ограничений, включая неспособность точно определить клеточную идентичность в смешанных суспензиях и отсутствие визуализации in situ активности кардиостимулятора RP. Эти факторы привели к ограниченному пониманию механизмов, лежащих в основе нормальных ритмических сокращений RP. В этой статье описан протокол для подготовки неповрежденных сегментов PKJ мыши с использованием метода вибратомного секционирования. Комбинируя этот подход с мышами, экспрессифицируя клеточные репортеры и генетически закодированные индикаторы Ca2+, исследователи могут более точно изучить конкретные типы клеток и механизмы, ответственные за перистальтические сокращения RP, которые жизненно важны для нормального транспорта мочи.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning at JoVE.com

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

Целью этого протокола является изоляция неповрежденных областей кардиостимулятора почечной лоханки мыши с помощью вибратомного сечения. Эти участки затем могут быть использованы для визуализации in situ Ca2+ для выяснения переходных свойств Ca2+ клеток кардиостимулятора и других интерстициальных клеток в срезах вибратома.

Изоляция и визуализация живых, интактных кардиостимуляторных областей почечной лоханки мыши путем вибратомного сечения

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Этот протокол дает неповрежденные области кардиостимулятора почечной лоханки, гладкомышеского органа в почке, который перекачивает мочу в мочеточник и в мочевой пузырь. В отличие от изоляции клеток из почечной лоханки, этот подход обеспечивает интактные среды in situ областей кардиостимулятора почечной лоханки и более физиологичную подготовку для изучения кардиостимуляции почечной лоханки. Человек, который никогда не выполнял эту технику, может изо всех сил пытаться разрезать однородные участки.Первый пользователь должен убедиться, что почка находится на уровне вибратома и не ускоряет процесс резки. Используя внутренние тканевые щипцы и внутренние расслоители ножницы, защемляйте кишечник и поднимайте его подальше от брюшной стенки. Одновременно разрезайте нижнюю часть кишечника, свободную от тела в проксимальной части двенадцатиперстной кишки и дистальной части толстой кишки, чтобы получить доступ к забрюшину, содержащему почки.Аккуратно защемить и приподнять дистальный конец мочеточник тканевыми щипцами. Используя ножницы для рассечения, разрезайте под защемленным мочеточником по направлению к почке, пока он не освободится от окружающей соединительной ткани. Как только почки будут подвергнуты воздействию, извлеките их по отдельности.Наполните блюдо с силиконовым эластомером ледяным холодным раствором KRB. Перенесите почку в тарелку для рассечения и убедитесь, что она полностью погружена. Используйте тонкие пружинные ножницы и внутренние щипцы для удаления жировой ткани из основания почки, чтобы обнажить дистальную почечную лоханку, или RP, и проксимальный мочеточник.Удалите проксимальный мочеточник и часть дистального отдела РП с основания с помощью тонких пружинных ножниц и щипцов. Проткните наружную почечную капсулу тонкими щипцами, отводя кончики от тела почек. Используя щипцы каждой рукой, защемляйте свободные концы капсулы и очищайте их до тех пор, пока оставшаяся почечная мембрана капсулы не будет полностью удалена.Вставьте лезвие бритвы в держатель лезвия инструмента вибратома и отрегулируйте угол зазора лезвия примерно до 18 градусов. Отрегулируйте параметры лезвия, как указано в текстовой рукописи, гарантируя, что толщина сечения почки не превышает 150 микрометров, что негативно повлияет на эксперименты по визуализации ионов кальция. Используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно схватить и извлечь приготовленную почку из ледяного холодного раствора KRB.Немедленно поместите почку на абсорбивную бумагу примерно на две-четыре секунды, чтобы удалить лишнюю внешнюю влагу. Аккуратно прокатите почку по абсорбирующей бумаге, чтобы убедиться, что все стороны паренхимы высохли, чтобы была оптимальная адгезия почки к стадии вибратома. Немедленно нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на основание пластины образца вибратома и используйте тупые щипцы, чтобы поместить мочеточник почек стороной вниз на область, покрытую клеем.Осторожно надавите вниз на верхнюю часть почки плоским краем щипцов в течение примерно 10-20 секунд, чтобы высушить клей. Прочно закрепите пластину образца на дне буферного лотка и отрегулируйте уровень раствора KRB так, чтобы верхняя часть почки была полностью погружена. Для автоматического сечения вибратома выберите начальное и конечное положения цикла резки лезвия вибратома на 0,5-1 сантиметр от почки, чтобы гарантировать, что вся плоскость почек будет разделена.Запустите автоматический процесс резки, убедившись, что лезвие контактирует с почкой. С помощью щипцов собирайте от почки участки, которые высвобождаются из почки и сразу же переносите их в отдельные колодцы. Продолжайте протокол секционирования и используйте световой микроскоп для идентификации областей PKJ в срезах почек, пока области PKJ не станут более очевидными.Наполните силиконовую эластомерную форму ледяным холодным раствором KRB. Перенесите в блюдо отдельный ломтик почки. Вставьте булавки Minutien по периферии среза почки, чтобы закрепить участок к основанию тарелки для визуализации.Поместите тарелку для визуализации на ступень вертикального вращающегося дискового конфокального микроскопа и немедленно начните перфузию раствором KRB. Используйте объектив с низким увеличением погружения в воду, чтобы найти срез почки. Центрируйте поле изображения на участках среза, где присутствует PKJ, используя ориентиры.Как только PKJ будет найден, используйте объектив с погружением в воду с более высоким увеличением, чтобы увеличить интересуемую область. Различают различные клетки, представляющие интерес для различных типов переходных периодов ионов кальция в стенке PKJ. После того, как интересующие ячейки были идентифицированы, отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы получить хорошее отношение сигнал/шум, и записывайте изображения с временной частотой дискретизации от 16 до 32 Гц.Легкие микроскопические изображения целых участков почек показывают аннотированные ориентиры одной области PKJ. Множественные области PKJ присутствуют близко к внутреннему продолговатему мозгу и дистальной почке. Здесь показаны местоположения почечных артерий PKJ и границ PKJ.Здесь показан участок PKJ от мыши, экспрессирующей GCaMP в альфа-положительных клетках PDGFR. Тонкую стенку PKJ, подвешенную между паренхималистной тканью, можно различить с помощью таких ориентиров, как почечная артериола. Экспрессия GCaMP6f в этой специфической трансгенной ткани распространяется по всей ширине PKJ как в мышечном, так и в адвентициальном слоях.В PDGFR альфа GCaMP6f положительных почечных срезах сеть клеток, которая обычно простирается по ширине стенки PKJ, является флуоресцентной и отображает колеблющиеся переходные переходные ионы кальция различной продолжительности и частоты. В положительных почечных срезах SMC GCaMP3 в мышечном слое присутствует слой положительных клеток GCaMP3. Пространственно-височно-височно-повальная карта показывает, что альфа-положительные клетки PDGFR, расположенные в адвентиции PKJ, вызывают длительные низкочастотные переходные ионы кальция, тогда как SMC чаще запускают переходные ионы кальция меньшей продолжительности.Аналогичным образом, также наблюдался массив флуоресцентных сигналов ионов кальция внутри и вокруг собирающих протоков и колебательных переходных процессов ионов кальция в SMC. При попытке этой процедуры важно, чтобы почка была как можно более ровной во время вибратомного сечения, чтобы обеспечить равномерное высвобождение срезов почек из блока. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как изоляция одиночных клеток, иммуногистохимия и молекулярные исследования, чтобы расширить наше понимание механизмов кардиостимулятора в почечной лоханке.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Живая съемка данио рерио Эмбриональные мозга с помощью конфокальной микроскопии

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Экс естественных Культура мышиных эмбриональных Внешний Live-визуализации меланобластов миграции

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Removal of Exogenous Materials from the Outer Portion of Frozen Cores to Investigate the Ancient Biological Communities Harbored Inside

Удаление экзогенных материалов из внешней части замороженных ядер по расследованию Древние биологических сообществ таил Внутри

The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Гидродинамические почечной лоханки инъекции для выражения-вирусных белков в почках

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Одноклеточное разрешение Трехмерная визуализация нетронутых органоидов

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...