Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello blev støttet af et stipendium fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans blev støttet af et Rubicon-stipendium fra Den Nederlandske Organisation for Videnskabelig Forskning (NWO).

Forsøgsprocedurerne med dyr blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee fra University of California i San Francisco (protokol AN182026).
1. Forberedelse af medier
<ol><li>Tilføj alle komponenter, som beskrevet i tabel 1, for at gøre den grundlæggende oocytsamlingsmedium og oocytmodningsmedium. For det grundlæggende indsamlingsmedium skal pH-vinduet indstilles til 7,4. For både indsamlings- og modningsmedium tilsættes 3 mg/mL bovin serumalbumin (BSA) ...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Den præsenterede metode beskriver en strategi for undersøgelse af aktivering og undertrykkelse af oversættelse af mål mRNA ved forskellige overgange under in vitro oocyt meiotisk modning. IL-7, en cytokin frigivet af oocyt, der kan være involveret i oocyt-cumulus cellekommunikation8,13, blev valgt med det formål at beskrive denne metode. IL-7 er kendt for at blive mere og mere oversat under oocyt modning8 og giver mulighed f...

En fuldt udvokset pattedyr oocyt gennemgår hurtige ændringer i forberedelsen til befrugtning og erhvervelse af totipotency. Disse ændringer er afgørende for at opretholde embryonal udvikling efter befrugtning. Selv om de begivenheder, der er forbundet med nuklear modning er relativt godt beskrevet, meget mindre er kendt om de molekylære processer og veje i oocyt cytoplasma. I de sidste faser af oocytmodningen er oocytter transskriptionsløst tavse, og genekspressionen er helt afhængig af mRNA-oversættelse og -nedbrydning1,2. Syntesen af proteiner, der er kritiske for udviklingskompetence, er derfor afhængig af et program med tidsindvis oversættelse af langlivede mRNA'er, der er blevet syntetiseret tidligere under oocytvækst1,3. Som en del af et fokus på at definere dette program af moderens mRNA oversættelse udført under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang, præsenterer dette papir en strategi for at studere aktivering og undertrykkelse af oversættelsen af målet maternelle mRNA'er i enkelt oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metode er YPet åben læseramme klonet opstrøms for 3 'UTR af udskriften af interesse. Dernæst er mRNA'er, der kodning denne reporter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenylerede mRNA'er kodning mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Reporter akkumulering måles under in vitro oocyt meiotisk modning ved hjælp af time-lapse mikroskopi. Akkumulering af gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres af det plateauede niveau af den co-injicerede mCherry. Efter dataindsamlingen beregnes omregningshastighederne for forskellige tidsintervaller under in vitro oocytmet meiotisk modning ved at beregne hældningen af kurven opnået ved kurvetilpasning.
Denne tilgang giver et værktøj til eksperimentelt at bekræfte ændringer i oversættelsen af udvalgte endogene mRNA'er. Desuden gør denne metode det lettere at karakterisere de lovgivningsmæssige elementer, der styrer oversættelsen under oocytmeiotisk modning ved at manipulere cis-regulatoriske elementer i 3' UTR af mål mRNA4,5,6. Manipulation af poly(A) halelængden giver også indsigt i adenylase/deadenylaseaktivitet i oocytter5. Mutagenesis af cis-virkende elementer eller RNA immunoprecipitation kan bruges til at studere interaktioner med cognate RNA bindende proteiner6,7. Derudover kan denne metode bruges til at identificere væsentlige komponenter i oversættelsesprogrammet, der er kritiske for oocyte udviklingskompetence ved at måle mål 3 'UTR oversættelse i modeller forbundet med nedsat oocyt kvalitet 8,9,10. Denne metode papir præsenterer et repræsentativt eksperiment, hvor denuded oocytter af 21-dages gamle C57/BL6 mus er blevet mikro-injiceres med en Ypet reporter smeltet til 3 'UTR af IL-7. Opsætningen og protokollen for oocytinjektion, time-lapse-registrering og dataanalyse er blevet beskrevet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Begivenheder i forbindelse med oocytkernemodning er blevet godt beskrevet. Men meget mindre er kendt om de molekylære veje og processer, der finder sted i cytoplasmaet som forberedelse til befrugtning og erhvervelse af totipotens. Under oocytmodning afhænger ændringer i genekspression udelukkende af oversættelse og nedbrydning af moderens messenger RNA'er (mRNA'er) snarere end af transskription. Udførelsen af oversættelsesprogrammet spiller derfor en central rolle i etableringen af oocyt udviklingskompetence til at opretholde embryoudvikling. Dette papir er en del af et fokus på at definere programmet for moderens mRNA oversættelse, der finder sted under meiotisk modning og på oocyte-til-zygote overgang. I dette metodedokument fremlægges en strategi for undersøgelse af reguleringen af oversættelsen af mål mRNA'er under in vitro oocyt modning. Her er en Ypet reporter smeltet til de 3 'uoversatte region (UTR) af genet af interesse og derefter mikro-injiceres i oocytter sammen med polyadenyleret mRNA kodning for mCherry at kontrollere for injiceret volumen. Ved at bruge time-lapse mikroskopi til at måle reporter akkumulering, er oversættelse satser beregnes ved forskellige overgange under oocyt meiotisk modning. Her er protokollerne for oocytisolation og injektion, time-lapse-registrering og dataanalyse blevet beskrevet ved hjælp af Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reporter som et eksempel.

Denuded prophase I-anholdt oocytes af 21-dages gamle C57/BL6 mus blev injiceret med en reporter mix, der indeholder mRNA kodning af Ypet reporter smeltet til 3 'UTR af IL-7 og mRNA kodning mCherry. YFP og mCherry udtryk blev registreret i 39 oocytter, hvoraf 30 blev modnet, og 9 blev arresteret i prophase I som en negativ kontrol. Tre modne oocytter blev udelukket til analyse, fordi de enten havde en forsinket GVBD (N = 2) eller flyttede i skålen under optagelsen (N = 1). Figur 3 viser mChe...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Denne protokol beskriver en reporter analyse for at studere reguleringen af mRNA oversættelse i enkelt oocytter under in vitro modning.

Definition af programmet for maternal mRNA oversættelse under In vitro Modning ved hjælp af en enkelt Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Denne metode kan bruges til at identificere og karakterisere regulatoriske elementer, der styrer oversættelse under oocytmodning. Vi anvendte time-lapse mikroskopi til at vurdere reporter akkumulering hele in-vitro oocyt modning. Dette præcist angiver det tidspunkt, hvor translationel aktivering eller undertrykkelse finder sted under oocyt modning.Til at begynde med skal du forsigtigt åbne antral folliklerne ved at lave et lille snit i follikelvæggen med en 26 gauge nål. Isoler intakte COC'er med flere lag cumulus-celler ved hjælp af en munddrevet glaspipette. Brug en mindre pipette og mekanisk denude cocs ved gentagne pipetter.Aspirere denuded oocytter og læg dem i en petriskål med modning medium suppleret med en mikromolar af cilostamide. Placer skålen i en inkubator i to timer for at lade oocytterne komme sig efter stress forårsaget af deres isolering fra folliklerne. Placer en 10 centimeter lang borosilicate glas kapillær rør i en mekanisk puller til at forberede injektion nåle.Bøj nålespidsen i en 45-graders vinkel ved hjælp af en opvarmet glødetråd for optimal injektion. Placer 20 mikroliter dråber af grundlæggende oocyt indsamling medium i en polystyren parabol, og dække dråber med let mineralsk olie. Forbered en større mængde reporter mix ved at tilføje 12,5 mikrogram per mikroliter af Ypet UTR og mCherry hver.Opbevar aliquots af disse ved minus 80 grader Celsius. Ved optøning centrifuge aliquot i to minutter ved 20.000 gange G, og overfør det derefter til et nyt mikrocentrifugerør. Indsprøjtningsnålen fyldes med ca. 0,5 mikroliter reporterblanding.Placer holdepipetten og injektionsnålen i holderne, og placer dem i dråben på oocytopsamlingsmediet. Åbn injektionsnålen ved forsigtigt at banke den mod holdepipetten. Placer oocytter i en dråbe af grundlæggende indsamling medium og injicere fem til 10 picoliters af reporter mix.Inkubat oocytter og modning medium med en mikromolar cilostamide i 16 timer for at tillade mCherry signalet til plateau. For time-lapse mikroskopi, forberede en petriskål med to 20 mikroliter dråber modning medium for hver injiceret reporter, en dråbe med en mikromolar cilostamide til kontrol prophase I-anholdt oocytter, og en dråbe uden cilostamide til modning oocytter. Dæk dråberne med let mineralsk olie og læg dem i inkubatoren.Efter for inkubation fjernes de injicerede oocytter fra inkubatoren og vaskes fire gange i modningsmedium uden cilostamide. Hold nogle oocytter i modning medium med en mikromolar cilostamide som en prophase I oocyte kontrolgruppe. Overfør de injicerede oocytter til deres respektive dråber på den tidligere forberedte time-lapse mikroskop skål.Klynge oocytterne med en lukket glaspipette for at forhindre deres bevægelse under optagelsen. Placer skålen under mikroskopet udstyret med et lysdiodefjernelsessystem og et motoriseret stadium udstyret med et miljøkammer, der holdes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid, ved hjælp af de parametre, der er nævnt i tekstmanuskriptet. Angiv de relevante indstillinger for time-lapse-eksperimentet ved at klikke på Apps og derefter på Multidimensional Acquisition.Vælg den første fane Main, og vælg time-lapse, flere fasepositioner og flere bølgelængder. Vælg fanen Gem for at angive den placering, hvor eksperimentet skal gemmes. Vælg derefter fanen Time-Lapse for at angive antallet af tidspoint, varighed og tidsinterval.Vælg fanen Fase, tænd brightfield, og find placeringen af oocytterne ved at åbne et nyt vindue og vælge Hent, Hent og Vis Live. Når oocytterne er placeret, skal du skifte tilbage til det flerdimensionale anskaffelsesvindue og trykke på plus for at indstille oocytternes placering. Vælg fanen Bølgelængder, og angiv tre forskellige bølgelængder for brightfield, YFP og mCherry.Juster eksponeringen for Ypet og mCherry, og start derefter time-lapse-eksperimentet ved at klikke på Anskaffelse. Til analyse af Ypet tre primære UTR oversættelse, udføre to region målinger for hver oocyte, oocyte selv ved at klikke på ellipse region, og en lille region omkring oocyt, der skal anvendes til baggrund subtraktion ved at klikke på rektangulær region. Eksporter områdemålingsdataene til et regneark ved at klikke på Åbn log og derefter logfør data.For hver enkelt oocyt og for alle målte tidspunkter trækkes baggrundsregionsmålingen fra målingen af oocytområdet separat for YFP og mCherry bølgelængder. Udtrykket af mCherry og YFP i prophase I og modning oocytter blev registreret i 39 oocytter, hvoraf 30 blev modnet, og ni blev arresteret i prophase I som en negativ kontrol. Individuelle YFP til mCherry nøgletal for signaler af prophase I-anholdt og modning oocytter blev korrigeret for injiceret volumen ved at dividere YFP signalet med den gennemsnitlige mCherry signal af de sidste 10 tidspunkter for prophase I-anholdt og modning oocytter.Oversættelseshastigheder af reporter YFP blev målt ved kurve montering af YFP til mCherry nøgletal i profase I og i modning oocytter i løbet af de første nul til to timer, eller otte til 10 timer efter cilostamide frigivelse ved hjælp af lineær regression. Akkumuleringen af reporteren følger ikke et lineært mønster, som det fremgår af en signifikant forskel i oversættelseshastigheder mellem nul til to timer og otte til 10 timer efter cilostamide frigivelse, hvilket indikerer aktivering af interleukin 7 oversættelse under oocyt myotisk modning. Når du forsøger denne protokol, skal du sørge for, at eksponeringstiden er tilstrækkelig i begyndelsen af optagelsen.Husk, at signalet kan mætte i løbet af tidsforløbet, hvis oversættelsen aktiveres under oocytmeiotisk genoptagelse. Mrma'ens stabilitet kan bekræftes af PCR ved hjælp af primere til YFP. For at bekræfte ændringer i oversættelsen kan du bruge vestlig blotting med et antistof mod en V5-teknologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En Metode til Lineage Sporing af hornhindeceller Brug Multi-color Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funktionel kloning ved anvendelse af en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyt Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering af Maternal Vascular Remodeling under graviditet i Mus livmoderen

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funktionel Manipulation af Maternal Gene produkter ved hjælp af<em&gt; In vitro</em&gt; Oocytmodning i Zebrafisk

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Modning af humane stamceller afledt Cardiomyocytter i Biowires Brug af elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkeblot-analyse, der kvantificerer DNA-methyleringsniveauet for chondrocyt-differentiering<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...