Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM097165, GM116926 en Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 aan Marco Conti. Enrico M. Daldello werd ondersteund door een fellowship van de Lalor Foundation en Natasja G. J. Costermans werd ondersteund door een Rubicon fellowship van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO).

De experimentele procedures met betrekking tot dieren werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Californië in San Francisco (protocol AN182026).
1. Voorbereiding van media
<ol><li>Voeg alle componenten toe, zoals beschreven in tabel 1,om het basismedium voor het verzamelen van oöcyten en het rijpingsmedium voor oöcyten te maken. Stel voor het basisinzamelingsmedium de pH in op 7,4. Voeg voor zowel het verzamel- als het...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

De gepresenteerde methode beschrijft een strategie om activering en onderdrukking van de vertaling van doelmiER bij verschillende overgangen tijdens in vitro oöcytmeiotische rijping te bestuderen. IL-7, een cytokine vrijgegeven door de oöcyt die betrokken kan zijn bij oöcyt-cumulus cel communicatie8,13, werd gekozen voor het beschrijven van deze methode. HET is bekend dat IL-7 steeds vaker wordt vertaald tijdens oöcytrijping8 ...

Een volgroeide zoogdierocyt ondergaat snelle veranderingen in de voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Deze veranderingen zijn essentieel om de embryonale ontwikkeling na de bevruchting te ondersteunen. Hoewel de gebeurtenissen die gepaard gaan met nucleaire rijping relatief goed worden beschreven, is er veel minder bekend over de moleculaire processen en paden in het oöcytcytoctoplasma. Tijdens de laatste stadia van de rijping van de oöcyt zijn oöcytcellen transcriptief stil en is de genexpressie volledig afhankelijk van mRNA-vertaling en afbraak1,2. De synthese van eiwitten die van cruciaal belang zijn voor ontwikkelingscompetentie is daarom gebaseerd op een programma van getijde vertaling van langlevende mRNAs die eerder zijn gesynthetiseerd tijdens oöcytgroei1,3. Als onderdeel van een focus op het definiëren van dit programma van maternale mRNA-vertaling uitgevoerd tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang, presenteert dit artikel een strategie om de activering en onderdrukking van de vertaling van doel maternale mRNAs in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro meiotische rijping te bestuderen.
Bij deze methode wordt het YPet open leesframe gekloond vóór de 3' UTR van het transcript van belang. Vervolgens worden mRNAs die coderen voor deze reporter micro geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNAs die coderen voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Reporter accumulatie wordt gemeten tijdens in vitro oöcyt meiotische rijping met behulp van time-lapse microscopie. De accumulatie van geel fluorescerend eiwit (YFP) en mCherry wordt geregistreerd in individuele oöcyten en YFP-signalen worden gecorrigeerd door het plateauniveau van de co-geïnjecteerde mCherry. Na het verkrijgen van gegevens worden de omrekeningssnelheden berekend voor verschillende tijdsintervallen tijdens de in vitro oöcytmeiotische rijping door de helling van de curve te berekenen die wordt verkregen door curve-fitting.
Deze aanpak biedt een hulpmiddel om veranderingen in de vertaling van geselecteerde endogene mRNAs experimenteel te bevestigen. Bovendien vergemakkelijkt deze methode de karakterisering van regulerende elementen die de vertaling tijdens de oöcytmeiotische rijping regelen door cis-regulerende elementen van de 3' UTR van doelmaRNAs4,5,6temanipuleren . Manipulatie van de poly(A) staartlengte geeft ook inzicht in adenylase/deadenylase activiteit in oöcyten5. Mutagenese van cis-acterende elementen of RNA-immunoprecipitatie kan worden gebruikt om interacties met cognate RNA-bindende eiwitten6,7te bestuderen . Bovendien kan deze methode worden gebruikt om essentiële componenten van het vertaalprogramma te identificeren die van cruciaal belang zijn voor de ontwikkelingscompetentie van oöcyt door doel 3' UTR-vertaling te meten in modellen die verband houden met verminderde oöcytkwaliteit 8,9,10. Dit methodedocument presenteert een representatief experiment waarbij gedenudeerde oöcyten van 21 dagen oude C57/BL6 muizen micro-geïnjecteerd zijn met een Ypet reporter gefuseerd met de 3' UTR van IL-7. De installatie en het protocol voor oöcytinjectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse zijn beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Gebeurtenissen in verband met nucleaire rijping van oöcyten zijn goed beschreven. Er is echter veel minder bekend over de moleculaire paden en processen die plaatsvinden in het cytoplasma ter voorbereiding op bevruchting en verwerving van totipotentie. Tijdens de rijping van de oöcyt zijn veranderingen in genexpressie uitsluitend afhankelijk van de vertaling en afbraak van maternal messenger RNAs (mRNAs) in plaats van van transcriptie. De uitvoering van het vertaalprogramma speelt daarom een sleutelrol bij het vaststellen van oöcytontwikkelingscompetentie om de embryoontwikkeling te ondersteunen. Dit artikel maakt deel uit van een focus op het definiëren van het programma van maternale mRNA-vertaling dat plaatsvindt tijdens de meiotische rijping en bij de oöcyt-naar-zygote-overgang. In dit methodedocument wordt een strategie gepresenteerd om de regulering van de vertaling van doelmaBO's tijdens de rijping van in vitro oöcyt te bestuderen. Hier wordt een Ypet-verslaggever gefuseerd met het 3' onvertaalde gebied (UTR) van het interessegen en vervolgens micro-geïnjecteerd in oöcyten samen met polyadenylated mRNA-codering voor mCherry om te controleren op geïnjecteerd volume. Door time-lapse microscopie te gebruiken om de accumulatie van verslaggevers te meten, worden vertaalsnelheden berekend bij verschillende overgangen tijdens de oöcytmeiotische rijping. Hier zijn de protocollen voor oöcytisolatie en injectie, time-lapse-opname en gegevensanalyse beschreven, met behulp van de UTR-verslaggever Ypet/interleukine-7 (IL-7)-3' als voorbeeld.

Gedenudeerde profase I-arrested oöcyten van 21-daagse C57/BL6 muizen werden geïnjecteerd met een reporter mix met mRNA die codeert voor de Ypet reporter versmolten met de 3' UTR van IL-7 en mRNA codering mCherry. YFP en mCherry expressie werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan 30 gerijpt, en 9 werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Drie rijpende oöcyten werden uitgesloten voor analyse omdat ze ofwel een vertraagde GVBD (N=2) hadden of tijdens de opname in de schaal bewogen (N=1). <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Dit protocol beschrijft een reportertest om de regulatie van mRNA-vertaling in enkelvoudige oöcyten tijdens in vitro rijping te bestuderen.

Het programma van maternale mRNA-vertaling definiëren tijdens in vitro rijping met behulp van een enkele oöcytreportertest

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Deze methode kan worden gebruikt om regulerende elementen te identificeren en te karakteriseren die de vertaling tijdens de rijping van de oöcyt regelen. We hebben time-lapse microscopie toegepast om de accumulatie van verslaggevers tijdens de rijping van de in-vitroöcyt te beoordelen. Dit geeft nauwkeurig het tijdstip aan waarop translationele activering of onderdrukking plaatsvindt tijdens de rijping van de oöcyt.Om te beginnen, open voorzichtig de antrale follikels door een kleine snede in de follikelwand te maken met een naald van 26 gauge. Isoleer intacte COC's met verschillende lagen cumuluscellen met behulp van een mondbediende glazen pipet. Gebruik een kleinere pipet en denude de COC's mechanisch door herhaaldelijk pipetten.Aspireer de gedendeerde oöcyten en plaats ze in een petrischaaltje met rijpingsmedium aangevuld met één micromolar cilostamide. Plaats de schaal twee uur in een incubator om de oöcyten te laten herstellen van de stress die wordt veroorzaakt door hun isolatie van de follikels. Plaats een 10 centimeter lange borosilicaat glazen capillaire buis in een mechanische trekker om injectienaalden voor te bereiden.Buig de naaldpunt onder een hoek van 45 graden met behulp van een verwarmd filament voor een optimale injectie. Doe 20 microliterdruppels van basisocyt verzamelmedium in een polystyreenschaal en bedek de druppels met lichte minerale olie. Bereid een groter volume reporter mix door het toevoegen van 12,5 microgram per microliter van Ypet UTR en mCherry elk.Bewaar aliquots hiervan bij min 80 graden Celsius. Bij het ontdooien centrifugeer je de aliquot gedurende twee minuten op 20.000 keer G en breng je het vervolgens over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Laad de injectienaald met ongeveer 0,5 microliter reportermix.Plaats de holdingpipet en de injectienaald in de houders en plaats ze in de druppel van het oöcytopvangmedium. Open de injectienaald door deze voorzichtig tegen de pipet te tikken. Plaats oöcyten in een druppel basisinzamelingsmedium en injecteer vijf tot tien picoliters van de reportermix.Incubeer de oöcyten en het rijpingsmedium gedurende 16 uur met één micromolar cilostamide om het mCherry-signaal te laten plateauen. Voor time-lapse microscopie, bereid een Petrischaal met twee 20 microliter druppels rijpingsmedium voor elke geïnjecteerde verslaggever, een druppel met een micromolar cilostamide voor controle profase I-arrested oöcyten, en een druppel zonder cilostamide voor rijpende oöcyten. Bedek de druppels met lichte minerale olie en plaats ze in de incubator.Verwijder na de pre-incubatie de geïnjecteerde oöcyten uit de incubator en was ze vier keer in rijpingsmedium zonder cilostamide. Bewaar sommige oöcyt in rijpingsmedium met één micromolar cilostamide als profase I oöcytcontrolegroep. Breng de geïnjecteerde oöcyten over in hun respectieve druppels op de eerder bereide time-lapse microscoopschotel.Cluster de oöcyten met een gesloten glazen pipet om hun beweging tijdens de opname te voorkomen. Plaats de schotel onder de microscoop uitgerust met een lichtgevende diode eliminatie systeem en een gemotoriseerde fase uitgerust met een milieukamer onderhouden op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide, met behulp van de parameters vermeld in de tekst manuscript. Voer de juiste instellingen voor het timelapse-experiment in door op Apps te klikken en vervolgens op Multidimensionale acquisitie.Selecteer het eerste tabblad Hoofd en selecteer time-lapse, posities in meerdere werkgebieden en meerdere golflengten. Selecteer het tabblad Opslaan om de locatie in te voeren waar het experiment moet worden opgeslagen. Selecteer vervolgens het tabblad Time-Lapse om het aantal tijdspunten, duur en tijdsinterval in te voeren.Selecteer het tabblad Werkgebied, schakel brightfield in en zoek de positie van de oöcyten door een nieuw venster te openen en Acquire, Acquire en Show Live te selecteren. Zodra de oöcyten zich bevinden, schakelt u terug naar het multidimensionale acquisitievenster en drukt u op plus om de locatie van de oöcyten in te stellen. Selecteer het tabblad Golflengten en stel drie verschillende golflengten in voor brightfield, YFP en mCherry.Pas de belichting voor Ypet en mCherry aan en start vervolgens het time-lapse-experiment door op Acquire te klikken. Voor de analyse van Ypet drie priem UTR-vertaling, voert u twee regiometingen uit voor elke oöcyt, de oöcyt zelf door op ellipsgebied te klikken en een klein gebied rond de oöcyt dat moet worden gebruikt voor achtergrondaftrek door op rechthoekig gebied te klikken. Exporteer de regiometingsgegevens naar een spreadsheet door te klikken op Logboek openen en vervolgens op Logboekgegevens.Trek voor elke afzonderlijke oöcyt en voor alle gemeten tijdpunten de achtergrondregiometing afzonderlijk af van de oöcytregiometing voor YFP- en mCherry-golflengten. De expressie van mCherry en YFP in profase I en rijpende oöcyten werd geregistreerd in 39 oöcyten, waarvan er 30 gerijpt waren, en negen werden gearresteerd in profase I als een negatieve controle. Individuele YFP-naar-mCherry-verhoudingen voor signalen van profase-I-arrested en rijpende oöcyten werden gecorrigeerd voor geïnjecteerd volume door het YFP-signaal te delen door het gemiddelde mCherry-signaal van de laatste 10 tijdspunten voor profase I-arrested en rijpende oöcyten.De omrekeningssnelheden van de reporter YFP werden gemeten door middel van een curve die paste bij de YFP-naar-mCherry-verhoudingen in profase I en in rijpende oöcyten gedurende de eerste nul tot twee uur, of acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide met behulp van lineaire regressie. De accumulatie van de verslaggever volgt geen lineair patroon, zoals aangegeven door een significant verschil in vertaalsnelheden tussen nul tot twee uur en acht tot 10 uur na het vrijkomen van cilostamide, wat wijst op activering van interleukine 7-vertaling tijdens oöcyt myotische rijping. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat de belichtingstijd aan het begin van de opname voldoende is.Houd er rekening mee dat het signaal tijdens de tijdscursus kan verzadigen als de vertaling wordt geactiveerd tijdens de hervatting van het oöcytmeiotisch. De stabiliteit van de MRMA kan worden bevestigd door PCR, met behulp van primers voor YFP. Om veranderingen in de vertaling te bevestigen, kunt u Western blotting gebruiken met een antilichaam tegen een V5-technologie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beoordeling van de moeder Vasculaire Verbouwing tijdens de zwangerschap in de muis Baarmoeder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functionele Manipulatie van Maternal Gene producten met behulp van<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturatie van zebravis

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Rijping van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten als Biowires gebruiken elektrische stimulatie

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...