Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM097165, GM116926 et Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 à Marco Conti. Enrico M. Daldello a été soutenu par une bourse de la Fondation Lalor et Natasja G. J. Costermans a été soutenu par une bourse Rubicon de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO).

Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à San Francisco (protocole AN182026).
1. Préparation des médias
<ol><li>Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour faire le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le support de collecte de base, réglez le pH sur 7,4. Pour le milieu de collect...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

La méthode présentée décrit une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction de l’ARNm cible à différentes transitions au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro. IL-7, une cytokine libérée par l’ovocyte qui peut être impliquée dans la communication cellulaire ovocyte-cumulus 8,13, a été choisie dans le but de décrire ce procédé. IL-7 est connu pour être de plus en plus traduit pendant la ma...

Un ovocyte de mammifère adulte subit des changements rapides dans la préparation à la fécondation et à l’acquisition de la totipotence. Ces changements sont essentiels pour soutenir le développement embryonnaire après la fécondation. Bien que les événements associés à la maturation nucléaire soient relativement bien décrits, on en sait beaucoup moins sur les processus moléculaires et les voies dans le cytoplasme des ovocytes. Au cours des dernières étapes de la maturation des ovocytes, les ovocytes sont transcriptionnellement silencieux, et l’expression des gènes dépend entièrement de la traduction et de la dégradation de l’ARNm1,2. La synthèse des protéines critiques pour la compétence développementale s’appuie donc sur un programme de traduction chronométré d’ARNm à longue durée de vie qui ont été synthétisés plus tôt au cours de la croissancedes ovocytes 1,3. Dans le cadre d’un accent sur la définition de ce programme de traduction maternelle de l’ARNm exécuté pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote, cet article présente une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction des ARNm maternels cibles dans des ovocytes simples au cours de la maturation méiotique in vitro.
Dans cette méthode, le cadre de lecture ouvert YPet est cloné en amont de l’UTR 3' de la transcription d’intérêt. Ensuite, les ARNm codant pour ce rapporteur sont micro-injectés dans les ovocytes avec des ARNm polyadenylé codant pour contrôler le volume injecté. L’accumulation de reporter est mesurée pendant la maturation méiotique in vitro d’ovocyte utilisant la microscopie de time-lapse. L’accumulation de protéines fluorescentes jaunes (YFP) et de mCherry est enregistrée dans les ovocytes individuels, et les signaux YFP sont corrigés par le niveau stabilisé du mCherry co-injecté. Après l’acquisition des données, les taux de translation sont calculés pour différents intervalles de temps au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro en calculant la pente de la courbe obtenue par ajustement de courbe.
Cette approche fournit un outil pour confirmer expérimentalement les changements dans la traduction des ARNm endogènes sélectionnés. De plus, cette méthode facilite la caractérisation des éléments régulateurs qui contrôlent la traduction lors de la maturation méiotique des ovocytes en manipulant les éléments cis-régulateurs du 3' UTR des ARNm cibles4,5,6. La manipulation de la longueur de la queue poly(A) permet également de mieux comprendre l’activité de l’adénylase/deadenylase dans les ovocytes5. La mutagenèse d’éléments cis-agissants ou d’immunoprécipitation de l’ARN peut être utilisée pour étudier les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN apparenté6,7. De plus, cette méthode peut être utilisée pour identifier les composants essentiels du programme de traduction qui sont essentiels pour la compétence développementale des ovocytes en mesurant la traduction de l’UTR cible 3' dans des modèles associés à une diminution de la qualité des ovocytes 8,9,10. Ce document de méthode présente une expérience représentative où des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours ont été micro-injectés avec un journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7. L’installation et le protocole pour l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Des événements liés à la maturation nucléaire d’oocyte ont été bien décrits. Cependant, on en sait beaucoup moins sur les voies moléculaires et les processus qui ont lieu dans le cytoplasme en préparation de la fécondation et de l’acquisition de la totipotence. Au cours de la maturation des ovocytes, les changements dans l’expression des gènes dépendent exclusivement de la traduction et de la dégradation des ARN messagers maternels (ARNm) plutôt que de la transcription. L’exécution du programme translationnel joue donc un rôle clé dans l’établissement de la compétence développementale des ovocytes pour soutenir le développement de l’embryon. Cet article fait partie d’un accent sur la définition du programme de traduction maternelle de l’ARNm qui a lieu pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote. Dans cet article de méthode, une stratégie est présentée pour étudier la régulation de la traduction des ARNm cibles au cours de la maturation in vitro des ovocytes. Ici, un rapporteur Ypet est fusionné à la région non traduite 3' (UTR) du gène d’intérêt, puis micro-injecté dans les ovocytes avec l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry pour contrôler le volume injecté. En utilisant la microscopie time-lapse pour mesurer l’accumulation de rapporteur, les taux de traduction sont calculés à différentes transitions au cours de la maturation méiotique des ovocytes. Ici, les protocoles pour l’isolement et l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits, utilisant le Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR reporter comme exemple.

Des ovocytes I-arrêtés de prophase dénudés des souris C57/BL6 de 21 jours ont été injectés avec un mélange de journaliste contenant l’ADN messagère codant le journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7 et adn messagère codant mCherry. L’expression de YFP et de mCherry a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et 9 ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Trois ovocytes en maturation ont été exclus pour l’analyse parce qu’ils avaient un GVBD retardé (...

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Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Cette méthode peut être utilisée pour identifier et caractériser les éléments régulateurs qui contrôlent la traduction pendant la maturation des ovocytes. Nous avons appliqué la microscopie de time-lapse pour évaluer l’accumulation de rapporteur dans toute la maturation in vitro d’oocyte. Cela permet de déterminer avec précision le moment où l’activation translationnelle ou la répression a lieu pendant la maturation des ovocytes.Pour commencer, ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de calibre 26. Isolez les COC intacts avec plusieurs couches de cellules de cumulus à l’aide d’une pipette en verre actionnée par la bouche. Utilisez une pipette plus petite et denudez mécaniquement les COC par pipetage répété.Aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Pétri avec un milieu de maturation complété par une micromolaire de cilostamide. Placez le plat dans un incubateur pendant deux heures pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par leur isolement des follicules. Placez un tube capillaire en verre borosilicate de 10 centimètres de long dans un tiroir mécanique pour préparer les aiguilles d’injection.Pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 45 degrés à l’aide d’un filament chauffé pour une injection optimale. Placez 20 gouttelettes microlitres du milieu de collecte des ovocytes de base dans un plat en polystyrène et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère. Préparez un plus grand volume de mélange de rapporteurs en ajoutant 12,5 microgrammes par microlitre d’UTR Ypet et de mCherry chacun.Conservez les aliquotes de ceux-ci à moins 80 degrés Celsius. Lors de la décongélation, centrifuger la partie aliquote pendant deux minutes à 20 000 fois G, puis la transférer dans un nouveau tube à microcentrifugation. Chargez l’aiguille d’injection avec environ 0,5 microlitres de mélange de rapporteur.Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection dans les supports et placez-les dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien. Placer les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injecter cinq à 10 picolitres du mélange rapporteur.Incuber les ovocytes et le milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire pendant 16 heures pour permettre au signal mCherry de se stabiliser. Pour la microscopie time-lapse, préparer une boîte de Petri avec deux gouttelettes de 20 microlitres de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté, une gouttelette avec un cilostamide micromolaire pour contrôler les ovocytes arrêtés par I de la prophase, et une gouttelette sans cilostamide pour les ovocytes en maturation. Couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère et placez-les dans l’incubateur.Après pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Gardez certains ovocytes dans un milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire comme groupe témoin d’ovocyte de la prophase I. Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée.Regroupez les ovocytes avec une pipette en verre fermée pour empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement. Placez la parabole au microscope équipée d’un système d’élimination des diodes électroluminescentes et d’une scène motorisée équipée d’une chambre environnementale maintenue à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit de texte. Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse en cliquant sur Applications, puis sur Acquisition multidimensionnelle.Sélectionnez le premier onglet Main, puis sélectionnez time-lapse, plusieurs positions de scène et plusieurs longueurs d’onde. Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée. Sélectionnez ensuite l’onglet Time-Lapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps.Sélectionnez l’onglet Scène, activez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre et en sélectionnant Acquérir, Acquérir et Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et appuyez sur plus pour définir l’emplacement des ovocytes. Sélectionnez l’onglet Longueurs d’onde et définissez trois longueurs d’onde différentes pour brightfield, YFP et mCherry.Ajustez l’exposition pour Ypet et mCherry, puis démarrez l’expérience time-lapse en cliquant sur Acquérir. Pour l’analyse de la translation UTR à trois nombres premiers de Ypet, effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte, l’ovocyte lui-même en cliquant sur la région de l’ellipse et une petite région entourant l’ovocyte à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan en cliquant sur la région rectangulaire. Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant sur Ouvrir le journal, puis sur Consigner les données.Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points de temps mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry. L’expression de mCherry et de YFP dans la prophase I et les oocytes de maturation a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et neuf ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Des rapports individuels de YFP à mCherry pour des signaux des ovocytes I-arrêtés et de maturation de prophase ont été corrigés pour le volume injecté en divisant le signal de YFP par le signal moyen de mCherry des 10 derniers points de temps pour les ovocytes I-arrêtés et mûrissants de prophase.Des taux de traduction du rapporteur YFP ont été mesurés par la courbe ajustant les rapports YFP à mCherry dans la prophase I et dans les ovocytes de maturation pendant les premières zéro à deux heures, ou huit à 10 heures après libération de cilostamide utilisant la régression linéaire. L’accumulation du rapporteur ne suit pas un modèle linéaire, comme l’indique une différence significative dans les taux de traduction entre zéro à deux heures et huit à 10 heures après la libération de cilostamide, indiquant l’activation de la traduction de l’interleukine 7 au cours de la maturation myotique des ovocytes. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous que le temps d’exposition est adéquat au début de l’enregistrement.Gardez à l’esprit que le signal peut saturer pendant le cours du temps si la traduction est activée pendant la reprise méiotique des ovocytes. La stabilité du MRMA peut être confirmée par PCR, en utilisant des amorces pour YFP. Pour confirmer les changements de traduction, vous pouvez utiliser western blotting avec un anticorps contre un technicien V5.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

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Recherche

Biologie du développement

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Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

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