Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM097165, GM116926 und Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 an Marco Conti unterstützt. Enrico M. Daldello wurde durch ein Stipendium der Lalor Foundation und Natasja G. J. Costermans durch ein Rubicon-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt.

Die Versuchsverfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California in San Francisco genehmigt (Protokoll AN182026).
1. Vorbereitung der Medien
<ol><li>Fügen Sie alle Komponenten hinzu, wie in Tabelle 1beschrieben, um das grundlegende Eizellentnahmemedium und das Eizellreifungsmedium herzustellen. Stellen Sie für das Basissammelmedium den pH-Wert auf 7,4 ein. Sowohl für das Sammel- als auch für das Reifemedium am Tag der A...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. 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G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Die vorgestellte Methode beschreibt eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von Ziel-mRNA an verschiedenen Übergängen während der in vitro Oozytenmionischen Reifung. IL-7, ein von der Eizelle freigesetztes Zytokin, das an der Kommunikation zwischen Eizelle und Kumuluszell beteiligt sein kann8,13, wurde ausgewählt, um diese Methode zu beschreiben. Es ist bekannt, dass IL-7 während der Eizellreifung<sup class...

Eine ausgewachsene Eizelle eines Säugetiers erfährt schnelle Veränderungen in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz. Diese Veränderungen sind unerlässlich, um die embryonale Entwicklung nach der Befruchtung aufrechtzuerhalten. Obwohl die mit der Kernreifung verbundenen Ereignisse relativ gut beschrieben sind, ist viel weniger über die molekularen Prozesse und Wege im Zytoplasma der Eizelle bekannt. In den letzten Stadien der Eizellreifung sind die Eizellen transkriptionell still, und die Genexpression hängt vollständig von der mRNA-Translation und dem Abbau ab1,2. Die Synthese von Proteinen, die für die Entwicklungskompetenz entscheidend sind, beruht daher auf einem Programm der zeitgesteuerten Translation langlebiger mRNAs, die früher während des Eizellwachstumssynthetisiertwurden 1,3. Im Rahmen eines Schwerpunkts auf der Definition dieses Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote durchgeführt wird, wird in diesem Artikel eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von mütterlichen Ziel-mRNAs in einzelnen Eizellen während der in vitro meiotischen Reifung präsentiert.
Bei dieser Methode wird der offene YPet-Leserahmen vor der 3'-UTR des interessierenden Transkripts geklont. Als nächstes werden mRNAs, die diesen Reporter kodieren, zusammen mit polyadenylierten mRNAs, die mCherry kodieren, in Eizellen mikroinjiziert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren. Die Reporterakkumulation wird während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen mittels Zeitraffermikroskopie gemessen. Die Akkumulation von gelb fluoreszierendem Protein (YFP) und mCherry wird in einzelnen Eizellen aufgezeichnet, und YFP-Signale werden durch das plateauierte Niveau der co-injizierten mCherry korrigiert. Nach der Datenerfassung werden die Translationsraten für verschiedene Zeitintervalle während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen berechnet, indem die Steigung der Kurve berechnet wird, die durch Kurvenanpassung erhalten wird.
Dieser Ansatz bietet ein Werkzeug, um Veränderungen in der Translation ausgewählter endogener mRNAs experimentell zu bestätigen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode die Charakterisierung regulatorischer Elemente, die die Translation während der meiotischen Reifung von Eizellen steuern, indem cis-regulatorische Elemente der 3'-UTR der Ziel-mRNAs4,5,6manipuliert werden. Die Manipulation der Poly(A)-Schwanzlänge ermöglicht auch den Einblick in die Adenylase/Deadenylase-Aktivität in Eizellen5. Mutagenese von cis-wirkenden Elementen oder RNA-Immunpräzipitation kann verwendet werden, um Wechselwirkungen mit verwandten RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen6,7. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um wesentliche Komponenten des Translationsprogramms zu identifizieren, die für die Entwicklungskompetenz der Eizellen entscheidend sind, indem die UTR-Translation von Ziel 3' in Modellen gemessenwird,die mit einer verminderten Eizellqualität verbunden sind 8,9,10. Dieses Methodenpapier stellt ein repräsentatives Experiment vor, bei dem entblähte Eizellen von 21 Tage alten C57 / BL6-Mäusen mit einem Ypet-Reporter mikroinjiziert wurden, der mit der 3' UTR von IL-7 verschmolzen ist. Das Setup und protokoll für die Eizellinjektion, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse wurden beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Ereignisse, die mit der Kernreifung der Eizellen verbunden sind, wurden gut beschrieben. Viel weniger ist jedoch über die molekularen Wege und Prozesse bekannt, die im Zytoplasma in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz stattfinden. Während der Eizellreifung hängen Veränderungen der Genexpression ausschließlich von der Translation und dem Abbau mütterlicher Boten-RNAs (mRNAs) und nicht von der Transkription ab. Die Durchführung des translationalen Programms spielt daher eine Schlüsselrolle bei der Etablierung der Eizellentwicklungskompetenz zur Aufrechterhaltung der Embryonalentwicklung. Diese Arbeit ist Teil eines Schwerpunkts auf der Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote stattfindet. In diesem Methodenpapier wird eine Strategie vorgestellt, um die Regulation der Translation von Ziel-mRNAs während der In-vitro-Eizellreifung zu untersuchen. Hier wird ein Ypet-Reporter mit der 3' unübersetzten Region (UTR) des interessierenden Gens verschmolzen und dann zusammen mit polyadenylierter mRNA, die für mCherry kodiert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren, in die Eizellen mikroinjiziert. Durch die Verwendung der Zeitraffermikroskopie zur Messung der Reporterakkumulation werden die Translationsraten bei verschiedenen Übergängen während der meiotischen Reifung der Eizellen berechnet. Hier wurden die Protokolle für die Isolierung und Injektion von Eizellen, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse am Beispiel des UTR-Reporters ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' beschrieben.

Denuded prophase I-arrestierte Eizellen von 21 Tage alten C57/BL6-Mäusen wurden mit einer Reportermischung injiziert, die mRNA enthielt, die für den Ypet-Reporter kodiert war, der mit der 3'-UTR von IL-7 und mRNA-kodierender mCherry verschmolzen war. YFP- und mCherry-Expression wurde in 39 Eizellen aufgezeichnet, von denen 30 gereift waren und 9 in Prophase I als Negativkontrolle verhaftet wurden. Drei reifende Eizellen wurden für die Analyse ausgeschlossen, da sie entweder eine verzögerte GVBD (N=2) hatten oder sich...

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Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.

Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Diese Methode kann verwendet werden, um regulatorische Elemente zu identifizieren und zu charakterisieren, die die Translation während der Eizellreifung steuern. Wir haben zeitraffermikroskopisch angewendet, um die Akkumulation von Reportern während der In-vitro-Eizellreifung zu beurteilen. Dies zeigt genau den Zeitpunkt, zu dem die translationale Aktivierung oder Repression während der Eizellreifung stattfindet.Öffnen Sie zunächst vorsichtig die Antralfollikel, indem Sie mit einer 26-Gauge-Nadel einen kleinen Schnitt in der Follikelwand machen. Isolieren Sie intakte COCs mit mehreren Schichten von Kumuluszellen mit einer mundbetriebenen Glaspipette. Verwenden Sie eine kleinere Pipette und entkernen Sie die COCs mechanisch durch wiederholtes Pipettieren.Saugen Sie die entsäten Eizellen an und legen Sie sie in eine Petrischale mit Einem Reifungsmedium, das mit einem Mikromolar Cilostamid ergänzt wird. Stellen Sie die Schale für zwei Stunden in einen Inkubator, damit sich die Eizellen von dem Stress erholen können, der durch ihre Isolierung von den Follikeln verursacht wird. Legen Sie ein 10 Zentimeter langes Kapillarrohr aus Borosilikatglas in einen mechanischen Puller, um Injektionsnadeln vorzubereiten.Biegen Sie die Nadelspitze in einem Winkel von 45 Grad mit einem beheizten Filament für eine optimale Injektion. 20 MikroliterTröpfchen des basischen Eizellensammelmediums in eine Polystyrolschale geben und die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl bedecken. Bereiten Sie ein größeres Volumen an Reportermischung vor, indem Sie jeweils 12,5 Mikrogramm pro Mikroliter Ypet UTR und mCherry hinzufügen.Lagern Sie Aliquoten davon bei minus 80 Grad Celsius. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie das Aliquot zwei Minuten lang bei 20.000 mal G und geben Es dann in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen über. Laden Sie die Injektionsnadel mit ca. 0,5 Mikrolitern Reportermischung auf.Legen Sie die Haltepipette und die Injektionsnadel in die Halter und positionieren Sie sie im Tröpfchen des Eizellensammelmediums. Öffnen Sie die Injektionsnadel, indem Sie sie vorsichtig gegen die Haltepipette klopfen. Legen Sie die Eizellen in ein Tröpfchen aus basischem Sammelmedium und injizieren Sie fünf bis 10 Pikoliter der Reportermischung.Inkubieren Sie die Eizellen und das Reifemedium mit einem mikromolaren Cilostamid für 16 Stunden, damit das mCherry-Signal ein Plateau erreicht. Bereiten Sie für die Zeitraffermikroskopie eine Petrischale mit zwei 20-Mikroliter-Tröpfchen Reifemedium für jeden injizierten Reporter, einem Tröpfchen mit einem mikromolaren Cilostamid zur Kontrolle von ProphaseN-I-arrestierten Eizellen und einem Tröpfchen ohne Cilostamid zur Reifung von Eizellen vor. Decken Sie die Tröpfchen mit leichtem Mineralöl ab und legen Sie sie in den Inkubator.Nach der Vorinkubation die injizierten Eizellen aus dem Inkubator entfernen und viermal im Reifemedium ohne Cilostamid waschen. Halten Sie einige Eizellen im Reifemedium mit einem mikromolaren Cilostamid als Prophase-I-Eizellkontrollgruppe. Übertragen Sie die injizierten Eizellen auf ihre jeweiligen Tröpfchen auf der zuvor vorbereiteten Zeitraffermikroskopschale.Gruppieren Sie die Eizellen mit einer geschlossenen Glaspipette, um ihre Bewegung während der Aufnahme zu verhindern. Stellen Sie die Schüssel unter das Mikroskop, das mit einem Leuchtdiodeneliminationssystem und einer motorisierten Stufe ausgestattet ist, die mit einer Umweltkammer ausgestattet ist, die bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid gehalten wird, wobei die im Textmanuskript genannten Parameter verwendet werden. Geben Sie die entsprechenden Einstellungen für das Zeitrafferexperiment ein, indem Sie auf Apps und dann auf Multidimensionale Erfassung klicken.Wählen Sie die erste Registerkarte Haupt und dann Zeitraffer, mehrere Stufenpositionen und mehrere Wellenlängen aus. Wählen Sie die Registerkarte Speichern, um den Speicherort des Experiments einzugeben. Wählen Sie dann die Registerkarte Zeitraffer, um die Anzahl der Zeitpunkte, die Dauer und das Zeitintervall einzugeben.Wählen Sie die Registerkarte Bühne, schalten Sie das Hellfeld ein und suchen Sie die Position der Eizellen, indem Sie ein neues Fenster öffnen und Erfassen, Erfassen und Live anzeigen auswählen. Sobald die Eizellen lokalisiert sind, wechseln Sie zurück zum mehrdimensionalen Erfassungsfenster und drücken Sie Plus, um die Position der Eizellen einzustellen. Wählen Sie die Registerkarte Wellenlängen und legen Sie drei verschiedene Wellenlängen für Hellfeld, YFP und mCherry fest.Passen Sie die Belichtung für Ypet und mCherry an und starten Sie dann das Zeitrafferexperiment, indem Sie auf Acquire klicken. Für die Analyse der Ypet drei Prime UTR Translation, führen Sie zwei Regionenmessungen für jede Eizelle durch, die Eizelle selbst durch Klicken auf Ellipsenregion und eine kleine Region, die die Eizelle umgibt, um für die Hintergrundsubtraktion verwendet zu werden, indem Sie auf rechteckige Region klicken. Exportieren Sie die Regionsmessdaten in eine Tabelle, indem Sie auf Protokoll öffnen und dann auf Protokolldaten klicken.Subtrahieren Sie für jede einzelne Eizelle und für alle gemessenen Zeitpunkte die Hintergrundbereichsmessung von der Eizellbereichsmessung getrennt für YFP- und mCherry-Wellenlängen. Die Expression von mCherry und YFP in Prophase I und reifenden Eizellen wurde in 39 Eizellen aufgezeichnet, von denen 30 gereift waren und neun in Prophase I als Negativkontrolle gestoppt wurden. Individuelle YFP-zu-mCherry-Verhältnisse für Signale von Prophase I-arrestierten und reifenden Eizellen wurden für das injizierte Volumen korrigiert, indem das YFP-Signal durch das durchschnittliche mCherry-Signal der letzten 10 Zeitpunkte für prophase I-arrestierte und reifende Eizellen geteilt wurde.Die Translationsraten des Reporter-YFP wurden durch Kurve gemessen, die das Verhältnis von YFP zu mCherry in Prophase I und in reifenden Eizellen während der ersten null bis zwei Stunden oder acht bis 10 Stunden nach der Freisetzung von Cilostamid mittels linearer Regression anpassen. Die Akkumulation des Reporters folgt keinem linearen Muster, wie ein signifikanter Unterschied in den Translationsraten zwischen null bis zwei Stunden und acht bis 10 Stunden nach der Freisetzung von Cilostamid zeigt, was auf eine Aktivierung der Interleukin-7-Translation während der myotischen Reifung der Eizellen hinweist. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass die Belichtungszeit zu Beginn der Aufnahme ausreichend ist.Denken Sie daran, dass das Signal während des Zeitverlaufs sättigen kann, wenn die Translation während der wiederaufnahme der Eizellmion aktiviert wird. Die Stabilität des MRMA kann durch PCR unter Verwendung von Primern für YFP bestätigt werden. Um Änderungen in der Übersetzung zu bestätigen, können Sie Western Blotting mit einem Antikörper gegen eine V5-Technologie verwenden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Beurteilung der Maternal Vascular Remodeling während der Schwangerschaft in der Gebärmutter Maus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funktionelle Manipulation der mütterlichen Gene Produkte verwenden<em&gt; In Vitro</em&gt; Oozytenreifung in Zebrabärbling

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Reifung von humanen Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten in Biowires Verwendung elektrischer Stimulation

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...