Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM097165, GM116926 ו יוניס קנדי שרייבר NICHD המרכזים הלאומיים למחקר תרגום רבייה ועקרות P50 HD055764 למרקו קונטי. אנריקו מ. דלדלו נתמך על ידי מלגת קרן לור ונטסיה ג'יי קוסטרמן נתמכה על ידי מלגת רוביקון מארגון המחקר המדעי של הולנד (NWO).

ההליכים הניסיוניים שבהם מעורבים בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (פרוטוקול AN182026).
1. הכנת אמצעי תקשורת
<ol><li>הוסף את כל הרכיבים, כמתואר בטבלה 1, כדי להפוך את אוסף ביציות הבסיסי בינוני בינוני התבגרות ?...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

השיטה המוצגת מתארת אסטרטגיה ללמוד הפעלה והדחקה של תרגום mRNA היעד במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית במבחנה ביצית. IL-7, ציטוקינים שפורסמו על ידי ביצית שעשויים להיות מעורבים בתקשורת תא ביצית8,13, נבחר לצורך תיאור שיטה זו. IL-7 ידוע להיות מתורגם יותר ויותר במה?...

ביצית יונקים בוגרת עוברת שינויים מהירים כהכנה להפריה ורכישה של טוטיפופוטנציה. שינויים אלה חיוניים כדי לקיים התפתחות עוברית לאחר ההפריה. למרות האירועים הקשורים התבגרות גרעינית מתוארים היטב יחסית, הרבה פחות ידוע על התהליכים המולקולריים ואת המסלולים בציטופלסמה ביצית. במהלך השלבים הסופיים של התבגרות ביצית, ביציות שקטות שעתוק, וביטוי גנים תלוי לחלוטין בתרגום mRNA והשפלה1,2. הסינתזה של חלבונים קריטיים ליכולת התפתחותית, אם כן, מסתמכת על תוכנית של תרגום מתוזמן של mRNAs ארוכי טווח שעברו סינתזה מוקדם יותר במהלך צמיחת ביצית1,3. כחלק מהתמקדות בהגדרת תוכנית זו של תרגום mRNA אימהי שבוצע במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה, מאמר זה מציג אסטרטגיה ללמוד את ההפעלה והדיכוי של התרגום של mRNAs אימהי היעד ביציות בודדות במהלך אימהות מיוטית במבחנה.
בשיטה זו, מסגרת הקריאה הפתוחה של YPet משובטת במעלה הזרם של UTR 3 ' של תמליל העניין. לאחר מכן, mRNAs קידוד כתב זה מוזרק מיקרו לתוך ביציות יחד עם mRNAs polyadenylated קידוד mCherry כדי לשלוט על נפח מוזרק. הצטברות הכתב נמדדת במהלך התבגרות מיוטית במבחנה באמצעות מיקרוסקופיה של זמן לשגות. הצטברות של חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) ו- mCherry נרשמת ביציות בודדות, ואותות YFP מתוקנים על ידי הרמה של mCherry מוזרק במשותף. לאחר רכישת נתונים, שיעורי תרגום מחושבים עבור מרווחי זמן שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית במבחנה על ידי חישוב השיפוע של העקומה המתקבל על ידי התאמת עקומה.
גישה זו מספקת כלי לאישור ניסיוני של שינויים בתרגום של mRNAs אנדוגני נבחרים. בנוסף, שיטה זו מקלה על אפיון של אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות מיוטית ביצית על ידי מניפולציה של אלמנטים cis-תקינה של 3 ' UTR של mRNAs היעד4,5,6. מניפולציה של אורך הזנב פולי(A) גם מאפשר תובנה לתוך פעילות אדניאלאז / deadenylase ביציות5. Mutagenesis של אלמנטים cis-acting או immunoprecipitation RNA יכול לשמש כדי ללמוד אינטראקציות עם חלבונים מחייבים RNA קוגנט6,7. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות רכיבים חיוניים של תוכנית התרגום כי הם קריטיים עבור יכולת התפתחותית ביצית על ידי מדידת יעד 3 ' תרגום UTR במודלים הקשורים לירידה באיכות ביצית 8,9,10. נייר שיטה זה מציג ניסוי מייצג שבו ביציות של עכברי C57/BL6 בני 21 יום הוזרקו במיקרו עם כתב Ypet מותך UTR 3 ' של IL-7. ההתקנה והפרוטוקול להזרקת ביצית, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים תוארו.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

אירועים הקשורים התבגרות גרעינית ביצית תוארו היטב. עם זאת, הרבה פחות ידוע על המסלולים המולקולריים והתהליכים המתרחשים בציטופלסמה כהכנה להפריה ורכישה של totipotency. במהלך התבגרות ביצית, שינויים בביטוי גנים תלויים אך ורק בתרגום והשפלה של RNAs שליח אימהי (mRNAs) ולא על שעתוק. ביצוע תוכנית התרגום, אם כן, ממלא תפקיד מפתח בביסוס יכולת התפתחותית ביצית לקיים התפתחות עובר. מאמר זה הוא חלק מהתמקדות בהגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי המתרחשת במהלך התבגרות מיוטית ובמעבר ביצית לזיגוטה. במאמר שיטה זו, מוצגת אסטרטגיה ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNAs היעד במהלך התבגרות ביצית במבחנה. כאן, כתב Ypet הוא התמזגו לאזור 3' לא מתורגם (UTR) של הגן של עניין ולאחר מכן מיקרו מוזרק לתוך ביציות יחד עם קידוד mRNA polyadenylated עבור mCherry לשלוט עבור נפח מוזרק. על ידי שימוש במיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי למדוד הצטברות כתב, שיעורי התרגום מחושבים במעברים שונים במהלך התבגרות מיוטית ביצית. כאן תוארו הפרוטוקולים לבידוד והזרקה של ביציות, הקלטת זמן לשגות וניתוח נתונים, באמצעות כתב UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' כדוגמה.

Denuded prophase אני נעצר ביציות של עכברי C57/BL6 בן 21 יום הוזרקו עם תערובת כתב המכיל mRNA קידוד כתב Ypet התמזגו 3 ' UTR של IL-7 ו mRNA קידוד mCherry. YFP ו- mCherry expression נרשמו ב-39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ו-9 נעצרו בהפצה I כשליטה שלילית. שלושה ביציות התבגרות לא נכללו לניתוח כי הם גם היו GVBD מעוכב (N = 2) או הועבר בצלחת במהלך ההקלט?...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות ולאפיין אלמנטים רגולטוריים השולטים בתרגום במהלך התבגרות ביציות. יישמנו מיקרוסקופיה של זמן לשגות כדי להעריך הצטברות כתבים לאורך כל התבגרות ביצית במבחנה. פעולה זו מאתרת במדויק את הזמן שבו הפעלה או דיכוי תרגום מתרחש במהלך התבגרות ביצית.כדי להתחיל, בזהירות לפתוח את זקיקי antral על ידי ביצוע חתך קטן בקיר הזקיק עם מחט 26 מד. לבודד COCs שלמים עם מספר שכבות של תאי קומולוס באמצעות פיפטה זכוכית המופעלת בפה. השתמש פיפטה קטנה יותר מכנית denude COCs על ידי pipetting חוזר.שואפים את ביציות denuded ומניחים אותם בצלחת פטרי עם מדיום התבגרות בתוספת מיקרומולאר אחד של cilostamide. מניחים את המנה באינקובטור במשך שעתיים כדי לאפשר ביציות להתאושש מן הלחץ המושרה על ידי בידודם מן הזקיקים. מניחים צינור נימי זכוכית בורוסיליקט באורך 10 ס"מ במשיכה מכנית להכנת מחטי הזרקה.לכופף את קצה המחט בזווית של 45 מעלות באמצעות חוט מחומם להזרקה אופטימלית. מניחים 20 טיפות מיקרוליטר של מדיום איסוף ביציות בסיסי בצלחת פוליסטירן, ומכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל. הכינו נפח גדול יותר של תערובת כתבים על ידי הוספת 12.5 מיקרוגרם למיקרוליטר של Ypet UTR ו- mCherry כל אחד.לאחסן aliquots של אלה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה, צנטריפוגה aliquot במשך שתי דקות ב 20, 000 פעמים G, ולאחר מכן להעביר אותו צינור מיקרוצנטריפוגה חדש. לטעון את מחט ההזרקה עם כ 0.5 microliters של תערובת כתב.מניחים את פיפטה מחזיק ואת מחט ההזרקה למחזיקים ומניחים אותם טיפה של מדיום אוסף ביצית. פתח את מחט ההזרקה על ידי הקשה בעדינות על זה נגד פיפטה מחזיק. מניחים ביציות בטיפה של מדיום איסוף בסיסי ומזריקים חמישה עד עשרה פיקוליטרים של תערובת הכתבים.דגירה ביציות ואת מדיום התבגרות עם cilostamide מיקרומולאר אחד במשך 16 שעות כדי לאפשר את אות mCherry לרמה. למיקרוסקופיה של זמן לשגות, להכין צלחת פטרי עם שתי טיפות 20 מיקרוליטר של מדיום התבגרות עבור כל כתב מוזרק, טיפה אחת עם cilostamide מיקרומולארי אחד עבור שליטה פרופה אני נעצר ביציות, טיפה אחת ללא cilostamide עבור התבגרות ביציות. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי קל ומניחים אותן באינקובטור.לאחר הדגירה המוקדמת, להסיר את ביציות מוזרק מן האינקובטור ולשטוף אותם ארבע פעמים במדיום התבגרות ללא cilostamide. שמור כמה ביציות במדיום התבגרות עם cilostamide מיקרומולאר אחד כקבוצת ביקורת prophase אני ביצית. מעבירים את ביציות מוזרק טיפות בהתאמה שלהם על צלחת מיקרוסקופ זמן לשגות שהוכן בעבר.Cluster את ביציות עם פיפטה זכוכית סגורה כדי למנוע את תנועתם במהלך ההקלטה. מניחים את המנה מתחת למיקרוסקופ המצוידת במערכת חיסול דיודה פולטת אור ובשלב ממונע המצויד בתא סביבתי המתוחזק ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני, תוך שימוש בפרמטרים המוזכרים בכתב היד. הזן את ההגדרות המתאימות לניסוי זמן לשגות על ידי לחיצה על יישומים ולאחר מכן רכישה רב ממדית.בחר את הכרטיסיה הראשית הראשונה ובחר זמן לשגות, מיקומי שלבים מרובים ואורך גל מרובים. בחר את הכרטיסיה שמירה כדי להזין את המיקום שבו יש לשמור את הניסוי. לאחר מכן בחר את הכרטיסיה זמן לשגות כדי להזין את מספר נקודות הזמן, משך הזמן ומרווח הזמן.בחר את שלב הכרטיסיה, הפעל את brightfield ואתר את מיקום ביציות על-ידי פתיחת חלון חדש ובחירה באפשרות רכוש, רכוש והצג בשידור חי. לאחר איתור ביציות, חזור לחלון הרכישה הרב-ממדי ולחץ על הפלוס כדי להגדיר את מיקום ביציות. בחר את אורכי הגל של הכרטיסיה והגדר שלושה אורכי גל שונים עבור brightfield, YFP ו- mCherry.התאם את החשיפה עבור Ypet ו- mCherry ולאחר מכן התחל את ניסוי הזמן-לשגות על-ידי לחיצה על רכישה. לניתוח של Ypet שלושה תרגום UTR הממשלה, לבצע שתי מדידות אזור עבור כל ביצית, ביצית עצמה על ידי לחיצה על אזור אליפסה, ואזור קטן המקיף את ביצית לשמש חיסור רקע על ידי לחיצה על אזור מלבני. יצא את נתוני מדידת האזור לגיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על פתח יומן רישום ולאחר מכן רשום נתונים.עבור כל ביצית בודדת ועבור כל נקודות הזמן הנמדדות, הפחת את מדידת אזור הרקע ממדידת אזור ביצית בנפרד עבור אורכי גל של YFP ו- mCherry. הביטוי של mCherry ו- YFP בתעמולה I וביצית התבגרות נרשם ב -39 ביציות, מתוכן 30 התבגרו, ותשעה נעצרו ב prophase אני כשליטה שלילית. יחסי YFP ל- mCherry בודדים עבור אותות של פרופאז I-נעצר וביצית התבגרות תוקנו עבור נפח מוזרק על ידי חלוקת אות YFP על ידי האות mCherry הממוצע של 10 נקודות הזמן האחרונות עבור פצצה אני נעצר והתבגרות ביציות.שיעורי התרגום של הכתב YFP נמדדו על ידי עקומה התאמת YFP כדי mCherry היחסים prophase אני ב התבגרות ביציות במהלך האפס הראשון עד שעתיים, או שמונה עד 10 שעות לאחר שחרור cilostamide באמצעות רגרסיה ליניארית. הצטברות הכתב אינה עוקבת אחר דפוס ליניארי, כפי שצוין על ידי הבדל משמעותי בשיעורי התרגום בין אפס לשעתיים ושמונה עד 10 שעות לאחר שחרור cilostamide, המציין הפעלה של תרגום interleukin 7 במהלך התבגרות מיוטית ביצית. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, ודא שזמן החשיפה מתאים בתחילת ההקלטה.זכור כי האות עשוי לרוויה במהלך קורס הזמן אם התרגום מופעל במהלך חידוש meiotic ביצית. היציבות של MRMA עשויה להיות מאושרת על ידי PCR, באמצעות פריימרים עבור YFP. כדי לאשר שינויים בתרגום, אתה יכול להשתמש סופג מערבי עם נוגדן נגד טק V5.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

מניפולציה פונקציונלית של מוצרים אימהיים הגן באמצעות<em&gt; במבחנה</em&gt; הבשלת ביצית דג הזברה

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...