Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 GM097165, GM116926 ed Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello è stato sostenuto da una borsa di studio della Fondazione Lalor e Natasja G. J. Costermans è stata sostenuta da una borsa di studio Rubicon dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO).

Le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California a San Francisco (protocollo AN182026).
1. Preparazione dei mezzi di comunicazione
<ol><li>Aggiungere tutti i componenti, come descritto nella tabella 1, per rendere il mezzo di raccolta degli ovocite di base e il mezzo di maturazione degli ovocite. Per il supporto di raccolta di base, impostare il pH su 7.4. Sia per il ...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Il metodo presentato descrive una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione dell'mRNA bersaglio in diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro. IL-7, una citochina rilasciata dall'ovocito che può essere coinvolta nella comunicazione cellulare ovocita-cumulo8,13, è stata scelta allo scopo di descrivere questo metodo. IL-7 è noto per essere sempre più tradotto durante la maturazione degli ovoc...

Un ovocita di mammiferi completamente cresciuto subisce rapidi cambiamenti nella preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Questi cambiamenti sono essenziali per sostenere lo sviluppo embrionale dopo la fecondazione. Sebbene gli eventi associati alla maturazione nucleare siano relativamente ben descritti, molto meno si sa dei processi molecolari e delle vie nel citoplasma degli ovocite. Durante le fasi finali della maturazione degli ovociti, gli ovociti sono trascrittamente silenziosi e l'espressione genica dipende interamente dalla traduzione e dalladegradazione dell'mRNA 1,2. La sintesi di proteine critiche per la competenza allo sviluppo, quindi, si basa su un programma di traduzione a tempo di mRNA di lunga durata che sono stati sintetizzati in precedenza durante la crescita degli ovocite1,3. Come parte di un focus sulla definizione di questo programma di traduzione dell'mRNA materno eseguito durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovociti e zigoti, questo documento presenta una strategia per studiare l'attivazione e la repressione della traduzione degli mRNA materni bersaglio in singoli ovociti durante la maturazione meiotica in vitro.
In questo metodo, il frame di lettura aperto YPet viene clonato a monte dell'UTR 3 ' della trascrizione di interesse. Successivamente, gli mRNA che codificano questo reporter vengono micro-iniettati in ovociti insieme a mRNA poliadenylati che codificano mCherry per controllare il volume iniettato. L'accumulo di reporter viene misurato durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro utilizzando la microscopia time-lapse. L'accumulo di proteine fluorescenti gialle (YFP) e mCherry è registrato nei singoli ovociti, e i segnali YFP sono corretti dal livello stabilizzato della mCherry co-iniettata. Dopo l'acquisizione dei dati, i tassi di traslazione sono calcolati per intervalli di tempo diversi durante la maturazione meiotica degli ovocite in vitro calcolando la pendenza della curva ottenuta mediante raccordo a curva.
Questo approccio fornisce uno strumento per confermare sperimentalmente i cambiamenti nella traduzione di mRNA endogeni selezionati. Inoltre, questo metodo facilita la caratterizzazione di elementi normativi che controllano la traslazione durante la maturazione meiotica degli ovocite manipolando gli elementi cis-regolatori dell'UTR 3' degli mRNA target4,5,6. La manipolazione della lunghezza della coda poli(A) consente anche di comprendere l'attività dell'adenilasi/deadenylasi negli ovociti5. La mutagenesi degli elementi ad azione cis o l'immunoprecipitazione dell'RNA possono essere utilizzate per studiare le interazioni con le proteine leganti l'RNAimparentate 6,7. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per identificare componenti essenziali del programma di traduzione che sono fondamentali per la competenza allo sviluppo degli ovocite misurando la traduzione UTR target 3' nei modelli associati alla riduzione della qualità degli ovocite 8,9,10. Questo documento di metodo presenta un esperimento rappresentativo in cui ovociti denudati di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati micro-iniettati con un reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7. Sono stati descritti l'impostazione e il protocollo per l'iniezione di ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Gli eventi associati alla maturazione nucleare degli ovocite sono stati ben descritti. Tuttavia, molto meno si sa delle vie molecolari e dei processi che si svolgono nel citoplasma in preparazione alla fecondazione e all'acquisizione della totipotenza. Durante la maturazione degli ovocite, i cambiamenti nell'espressione genica dipendono esclusivamente dalla traduzione e dal degrado degli RNA messaggeri materni (mRNA) piuttosto che dalla trascrizione. L'esecuzione del programma trascizionale, quindi, svolge un ruolo chiave nello stabilire la competenza allo sviluppo degli ovocite per sostenere lo sviluppo degli embrioni. Questo articolo fa parte di un focus sulla definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno che avviene durante la maturazione meiotica e alla transizione tra ovocita e zigote. In questo documento di metodo viene presentata una strategia per studiare la regolazione della traduzione degli mRNA bersaglio durante la maturazione degli ovocite in vitro. Qui, un reporter Ypet viene fuso alla regione non tradotta 3 ' (UTR) del gene di interesse e quindi micro-iniettato in ovociti insieme alla codifica dell'mRNA poliadenilato per mCherry per controllare il volume iniettato. Utilizzando la microscopia time-lapse per misurare l'accumulo del reporter, i tassi di traduzione sono calcolati a diverse transizioni durante la maturazione meiotica degli ovocite. Qui, sono stati descritti i protocolli per l'isolamento e l'iniezione degli ovocite, la registrazione time-lapse e l'analisi dei dati, usando il reporter UTR Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' come esempio.

Gli ovociti arrestati dai prophase I di topi C57/BL6 di 21 giorni sono stati iniettati con un mix di reporter contenente mRNA che codifica per il reporter Ypet fuso all'UTR 3' di IL-7 e mRNA che codifica per mCherry. L'espressione YFP e mCherry è stata registrata in 39 ovociti, di cui 30 maturi, e 9 sono stati arrestati in prophase I come controllo negativo. Tre ovociti in maturazione sono stati esclusi per l'analisi perché avevano un GVBD ritardato (N=2) o si sono spostati nella piastra durante la registrazione (N=1)....

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Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Questo protocollo descrive un saggio di reporter per studiare la regolazione della traduzione dell'mRNA in singoli ovociti durante la maturazione in vitro.

Definizione del programma di traduzione dell'mRNA materno durante la maturazione in vitro utilizzando un saggio single oocyte reporter

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Questo metodo può essere utilizzato per identificare e caratterizzare elementi regolatori che controllano la traduzione durante la maturazione degli ovocite. Abbiamo applicato la microscopia time-lapse per valutare l'accumulo di reporter durante la maturazione degli ovocici in vitro. Ciò individua con precisione il momento in cui l'attivazione traslazione o la repressione avviene durante la maturazione degli ovocite.Per iniziare, aprire attentamente i follicoli astrali facendo un piccolo taglio nella parete del follicolo con un ago calibro 26. Isolare i COC intatti con diversi strati di cellule cumuli utilizzando una pipetta di vetro azionata dalla bocca. Utilizzare una pipetta più piccola e denudare meccanicamente i COC mediante pipettazione ripetuta.Aspirare gli ovociti denudati e metterli in una piastra di Petri con mezzo di maturazione integrato con un micromolare di cilostamide. Mettere il piatto in un'incubatrice per due ore per lasciare che gli ovociti si riprendano dallo stress indotto dal loro isolamento dai follicoli. Posizionare un tubo capillare in vetro borosilicato lungo 10 centimetri in un estrattore meccanico per preparare aghi di iniezione.Piegare la punta dell'ago con un angolo di 45 gradi utilizzando un filamento riscaldato per un'iniezione ottimale. Posizionare 20 goccioline di microliter di mezzo di raccolta di ovocite di base in un piatto di polistirolo e coprire le goccioline con olio minerale leggero. Preparare un volume maggiore di mix di reporter aggiungendo 12,5 microgrammi per microlitro di Ypet UTR e mCherry ciascuno.Memorizzare le aliquote di questi a meno 80 gradi Celsius. Dopo lo scongelamento, centrifugare l'aliquota per due minuti a 20.000 volte G, quindi trasferirla in un nuovo tubo di microcentrifugo. Caricare l'ago di iniezione con circa 0,5 microlitri di miscela di reporter.Posizionare la pipetta di tenuta e l'ago di iniezione nei supporti e posizionarli nella goccia del mezzo di raccolta degli ovocite. Aprire l'ago di iniezione toccandolo delicatamente contro la pipetta di tenuta. Metti gli ovociti in una goccia di mezzo di raccolta di base e inietta da cinque a 10 picoliter del mix di reporter.Incubare gli ovociti e il mezzo di maturazione con una cilostamide micromolare per 16 ore per consentire al segnale mCherry di stabilizzarsi. Per la microscopia time-lapse, preparare una piastra di Petri con due goccioline da 20 microliter di mezzo di maturazione per ogni reporter iniettato, una goccia con una cilostamide micromolare per il controllo degli ovociti arrestati con prophase I e una goccia senza cilostamide per gli ovociti in maturazione. Coprire le goccioline con olio minerale leggero e posizionarle nell'incubatrice.Dopo la pre-incubazione, rimuovere gli ovociti iniettati dall'incubatrice e lavarli quattro volte in mezzo di maturazione senza cilostamide. Mantenere alcuni ovociti in mezzo di maturazione con una cilostamide micromolare come gruppo di controllo degli ovociti prophase I. Trasferire gli ovociti iniettati nelle rispettive goccioline sul piatto del microscopio time-lapse precedentemente preparato.Raggruppare gli ovociti con una pipetta di vetro chiusa per impedirne il movimento durante la registrazione. Posizionare il piatto al microscopio dotato di un sistema di eliminazione del diodo emettitore di luce e di uno stadio motorizzato dotato di una camera ambientale mantenuta a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto testuale. Immettere le impostazioni appropriate per l'esperimento time-lapse facendo clic su App e quindi su Acquisizione multidimensionale.Selezionare la prima scheda Principale e selezionare time-lapse, posizioni di più fasi e lunghezze d'onda multiple. Selezionare la scheda Salvataggio per immettere la posizione in cui salvare l'esperimento. Selezionare quindi la tabulazione Time-Lapse per immettere il numero di punti di tempo, la durata e l'intervallo di tempo.Selezionare la scheda Stage, attivare brightfield e individuare la posizione degli ovociti aprendo una nuova finestra e selezionando Acquisisci, Acquisisci e Mostra in diretta. Una volta localizzati gli ovociti, tornare alla finestra di acquisizione multidimensionale e premere più per impostare la posizione degli ovociti. Selezionate le lunghezze d'onda della scheda e impostate tre diverse lunghezze d'onda per brightfield, YFP e mCherry.Regolate l'esposizione per Ypet e mCherry, quindi iniziate l'esperimento time-lapse facendo clic su Acquisisci (Acquire). Per l'analisi di Ypet tre prime traslazioni UTR, eseguire due misurazioni della regione per ogni ovocita, l'ovocita stessa facendo clic sulla regione dell'ellisse e una piccola regione che circonda l'ovocita da utilizzare per la sottrazione di sfondo facendo clic sulla regione rettangolare. Esportare i dati di misurazione dell'area in un foglio di calcolo facendo clic su Apri registro e quindi su Registra dati.Per ogni singolo ovocita e per tutti i punti di tempo misurati, sottrarre la misurazione della regione di sfondo dalla misurazione della regione degli ovocite separatamente per le lunghezze d'onda YFP e mCherry. L'espressione di mCherry e YFP in prophase I e ovociti in maturazione è stata registrata in 39 ovociti, di cui 30 sono stati maturati, e nove sono stati arrestati in prophase I come controllo negativo. I rapporti individuali da YFP a mCherry per i segnali di ovociti prophase I arrestati e in maturazione sono stati corretti per il volume iniettato dividendo il segnale YFP per il segnale mCherry medio degli ultimi 10 punti di tempo per gli ovociti prophase I-arrestati e in scadenza.I tassi di traduzione del reporter YFP sono stati misurati in curva adattando i rapporti YFP a mCherry in prophase I e negli ovociti in maturazione durante il primo zero a due ore, o da otto a 10 ore dopo il rilascio di cilostamide usando la regressione lineare. L'accumulo del reporter non segue uno schema lineare, come indicato da una significativa differenza nei tassi di traduzione tra zero e due ore e da otto a 10 ore dopo il rilascio di cilostamide, indicando l'attivazione della traduzione dell'interleuchina 7 durante la maturazione miotica degli ovocite. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi che il tempo di esposizione sia adeguato all'inizio della registrazione.Tieni presente che il segnale potrebbe saturarsi durante il corso di tempo se la traduzione viene attivata durante la ripresa meiotica degli ovocite. La stabilità dell'MRMA può essere confermata dalla PCR, utilizzando primer per YFP. Per confermare i cambiamenti nella traduzione, è possibile utilizzare western blotting con un anticorpo contro una tecnologia V5.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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