Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

この研究は、NIH R01 GM097165、GM116926、ユーニス・ケネディ・シュリバーNICHD国立生殖・不妊研究センターP50 HD055764からマルコ・コンティに支援されました。エンリコ・M・ダルデッロはラロール財団のフェローシップによって支援され、ナタシャ・G・J・コスターマンスはオランダ科学研究機構(NWO)のルビコン・フェローシップによって支援されました。

動物を含む実験的手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設動物管理および使用委員会(プロトコルAN182026)によって承認されました。
1. メディアの準備
<ol><li>表1に記載されているとおり、すべての成分を追加して、基本的な卵母細胞収集媒体および卵母細胞成熟培地を作る。基本的な収集媒体の場合は、pHを 7.4 に設定します。回収および成熟?...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

提示された方法は、インビトロ卵母細胞のmeiotic成熟中に異なる遷移における標的mRNAの翻訳の活性化および抑制を研究する戦略を記述する。IL-7は、卵母細胞-cumulus細胞通信8,13に関与し得る卵母細胞によって放出されるサイトカインを、この方法を記述する目的で選択した。IL-7は卵母細胞成熟8中にますます翻訳されることが...

完全に成長した哺乳類の卵母細胞は、受精およびトティポテンシーの獲得に備えて急速な変化を起す。これらの変化は、受精後の胚発生を維持するために不可欠である。核成熟に関連する事象は比較的よく記述されているが、卵母細胞質における分子プロセスおよび経路についてはあまり知られていない。卵母細胞成熟の最終段階では、卵母細胞は転写的に静かであり、遺伝子発現はmRNA翻訳と分解1,2に完全に依存する。したがって、発達能力に重要なタンパク質の合成は、卵母細胞の成長1,3の間に先に合成された長命mRNAの時限翻訳のプログラムに依存する。このプログラムの定義に焦点を当てたのは、meiotic成熟中および卵母細胞間遷移中に実行される母体母体翻訳のこのプログラムの定義に焦点を当て、この論文は、インビトロのmeiotic成熟の間に単一の卵母細胞における標的母性母体の翻訳の活性化と抑制を研究する戦略を提示する。
この方法では、YPetオープンリーディングフレームは、対象のトランスクリプトの3'UTRの上流にクローン化される。次に、このレポーターをコードするmRNAは、注入された体積を制御するためにmCherryをコードするポリアデニル化mRNAと共に卵母細胞にマイクロインジェクションされる。レポーター蓄積は、タイムラプス顕微鏡を用いた インビトロ 卵母細胞の精密成熟の間に測定される。黄色蛍光タンパク質(YFP)とmCherryの蓄積は、個々の卵母細胞に記録され、YFP信号は、共注入されたmCherryの高原レベルによって補正されます。データ取得後、カーブフィッティングにより得られた曲線の傾きを計算することにより、 インビトロ 卵母細胞の滑間成熟時に異なる時間間隔で翻訳速度を計算します。
このアプローチは、選択された内因性mRNAの翻訳の変化を実験的に確認するためのツールを提供します。また、この方法は、3'UTRの標的mRNA4,5,6のシス調節要素を操作することにより、卵母細胞の微細成熟時に翻訳を制御する調節要素の特性評価を容易にする。ポリ(A)尾長の操作はまた卵母細胞のアデニラーゼ/デアデニラーゼ活性への洞察を可能にする 5.シス作用要素またはRNA免疫沈降の変異生成は、同結合RNA結合タンパク質6,7との相互作用を研究するために使用することができる。さらに、この方法は、oocyteの品質が低下したモデルでターゲット3'UTR翻訳を測定することによって、卵子発達能力に不可欠な翻訳プログラムの必須成分を同定するために使用することができる8、9、10。この方法論文は、21日齢のC57/BL6マウスの裸卵母細胞がIL-7の3'UTRに融合したイペット記者とマイクロ注入された代表的な実験を提示する。卵母細胞注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのセットアップおよびプロトコルについて説明した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

卵母細胞核成熟に関連する事象がよく記載されている。しかし、トティポテンシーの受精と獲得に備えて細胞質に起こる分子経路やプロセスについては、あまり知られていない。卵母細胞成熟の間、遺伝子発現の変化は、転写ではなく母体メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳と分解のみに依存する。従って、翻訳プログラムの実行は、胚の発達を維持するための卵母細胞の発達能力を確立する上で重要な役割を果たす。この論文は、meiotic成熟時および卵母細胞間遷移時に行われる母体母体翻訳のプログラムの定義に焦点を当てる。本方法論文では、 インビトロ 卵母細胞成熟中の標的mRNAの翻訳の調節を研究する戦略を提示する。ここでは、Ypetレポーターが目的の遺伝子の3'未翻訳領域(UTR)に融合し、注入された体積を制御するためにmCherryのためにポリアデニル化mRNAコードと共に卵母細胞にマイクロインジェクターを注入する。タイムラプス顕微鏡を使用してレポーターの蓄積を測定することにより、卵母細胞系精密成熟中の異なる遷移で翻訳速度が計算されます。ここでは、卵母細胞の単離および注入、タイムラプス記録、およびデータ分析のためのプロトコルについて、Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTRレポーターを例として用いて説明した。

21日齢のC57/BL6マウスのI逮捕卵母細胞を否定したプロフェイズI逮捕卵母細胞は、Il-7の3'UTRとmRNAコードmCherryの3'UTRに融合したイペットレポーターをコードするmRNAを含むレポーターミックスを注射した。YFPとmCherryの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照として相Iで逮捕された。3つの成熟卵母細胞は、GVBDが遅れたか(N =2)か、録音中に皿内を移動したため(N=1)た?...

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Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

このプロトコルは、 インビトロ 成熟時の単一卵母細胞におけるmRNA翻訳の調節を研究するためのレポーターアッセイを記述する。

単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

この方法は、卵母細胞成熟時に翻訳を制御する調節要素を識別し、特徴付けるために使用することができる。我々は、インビトロ卵母細胞成熟を通じてレポーターの蓄積を評価するためにタイムラプス顕微鏡を適用した。これは、卵母細胞の成熟中に翻訳活性化または抑圧が行われる時間を正確に特定します。まず、26ゲージ針で卵胞壁に小さな切り傷を入れ、角包を慎重に開けます。口操作ガラスピペットを使用して、cumulus細胞のいくつかの層を持つ無傷のCOCを分離します。より小さなピペットを使用し、繰り返しピペット処理を行うことによってCOCを機械的に脱裸にします。裸卵母細胞を吸引し、クロスターミドの1ミクロモルを補った成熟培地を含むシャーレに入れます。卵母細胞が卵胞からの分離によって引き起こされるストレスから回復できるように、皿を2時間保育器に入れます。長さ10センチメートルのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブをメカニカルプーラーに入れ、注射針を準備します。最適な注入のために熱されたフィラメントを使用して45度の角度で針先を曲げてください。ポリスチレン皿に基本的な卵母細胞採取培地の20マイクロリットルの液滴を入れ、軽いミネラルオイルで液滴を覆います。Ypet UTRとmCherryのマイクロリットル当たり12.5マイクログラムをそれぞれ追加して、より大きな量のレポーターミックスを準備します。これらのアリコートをマイナス80度で保管してください。解凍すると、20,000倍Gで2分間アリコートを遠心分離し、新しいマイクロ遠心分離管に移します。注射針に約0.5マイクロリットルのレポーターミックスを積み込みます。保持ピペットと注射針をホルダーに入れ、卵母細胞採取培地の液滴に入れる。注入針を、保持ピペットにそっと叩いて開きます。卵母細胞を基本採取培地の液滴に入れ、レポーターミックスの5〜10ピコリターを注入する。卵母細胞と成熟培地を1マイクロモルクロスターミドで16時間インキュベートし、mCherry信号を高原にします。タイムラプス顕微鏡の場合は、注入されたレポーターごとに20マイクロリットルの成熟培地のペトリ皿、制御プロフェーズI逮捕卵母細胞のための1つの小臼歯シロスターミドを含む1滴、および成熟卵細胞のためのクロスタミドなしの1滴を準備する。軽いミネラルオイルで液滴を覆い、インキュベーターに入れます。インキュベーション後、注入した卵母細胞をインキュベーターから取り出し、シロスターミドなしで成熟培地で4回洗浄します。一つのミクロモルシロスタミドを熟成I卵子対照群として成熟培地に入れる。注入された卵母細胞を、以前に調製したタイムラプス顕微鏡皿のそれぞれの液滴に移す。閉じたガラスピペットで卵母細胞をクラスター化して、記録中の動きを防ぎます。テキスト原稿に記載されているパラメータを使用して、発光ダイオード除去システムと37°Cと5%の二酸化炭素で維持された環境室を装備した電動ステージを備えた顕微鏡の下に皿を置きます。[アプリ]をクリックし、[多次元取得]をクリックして、タイムラプス実験に適した設定を入力します。最初のタブを選択して、タイムラプス、複数のステージ位置、および複数の波長を選択します。[保存]タブを選択して、実験を保存する場所を入力します。次に、タブ Time-Lapse を選択して、時間ポイント数、期間、および時間間隔を入力します。タブステージを選択し、明視野をオンにし、新しいウィンドウを開いて取得、取得、およびライブを表示を選択して、卵母細胞の位置を見つけます。卵母細胞が見つかったら、多次元取得ウィンドウに戻り、プラスを押して卵母細胞の位置を設定します。「波長」タブを選択し、明視野、YFP、および mCherry の 3 つの異なる波長を設定します。Ypet と mCherry の露出を調整し、取得をクリックしてタイムラプス実験を開始します。Ypet 3素数UTR翻訳の解析では、卵母細胞、卵母細胞自体、楕円領域をクリックして、卵母細胞を取り巻く小さな領域を矩形領域をクリックして、2つの領域測定を行います。[ログを開く] をクリックし、[ログ データ] をクリックして、地域の測定データをスプレッドシートにエクスポートします。個々の卵母細胞と測定された時間ポイントごとに、YFPとmCherry波長について、卵母細胞領域測定からバックグラウンド領域測定値を別々に差し引きます。分相Iと成熟卵母細胞におけるmCherryとYFPの発現は39個の卵母細胞に記録され、そのうち30個が成熟し、9人が陰性対照としてプロフェイズIで逮捕された。I逮捕および成熟卵母細胞のシグナルに対する個々のYFP対mCherry比は、YFP信号をフェーズI逮捕および成熟卵母細胞の最後の10時点の平均mCherry信号で割ることによって、注入された体積について修正された。レポーターYFPの翻訳速度は、線形回帰を用いたシロスターミド放出の後、プロフェイズIおよび成熟卵母細胞におけるYFP対mCherry比を曲線で測定した。レポーターの蓄積は、ゼロ〜2時間と8〜10時間の間の翻訳速度の有意な差によって示されるように線形パターンに従わない、卵母細胞筋細胞成熟中にインターロイキン7翻訳の活性化を示す。このプロトコルを試す場合は、記録の開始時に露出時間が十分であることを確認してください。卵母細胞の再開中に翻訳が活性化された場合、信号は時間経過中に飽和する可能性があることを覚えておいてください。MRMAの安定性は、PCRにより、YFP用プライマーを用いて確認することができる。翻訳の変化を確認するには、V5技術に対する抗体を用いてウェスタンブロッティングを使用することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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用いた機能クローニング<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;卵母細胞発現システム

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マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

母親の遺伝子産物の機能操作の使用<em&gt;インビトロ</emゼブラフィッシュにおける&gt;卵成熟

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

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A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...