Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

이 작품은 NIH R01 GM097165, GM116926 및 유니스 케네디 슈리버 NICHD 국립 재생 및 불임 P50 HD055764에서 마르코 콘티에 의해 지원되었다. 엔리코 M. 달델로는 랄로 재단의 펠로우십에 의해 지원되었고 나타자 G. J. 코스터만스는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 루비콘 펠로우십에 의해 지원되었습니다.

동물과 관련된 실험 절차는 샌프란시스코 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 AN182026).
1. 미디어 준비
<ol><li>표 1에설명된 대로 모든 구성 요소를 추가하여 기본 난낭 수거 배지 및 난모세포 성숙 배지를 만듭니다. 기본 컬렉션 매체의 경우 pH를 7.4로 설정합니다. 수집 및 성숙 배지의 경우 사용 당일 소 세럼 알부민...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

제시된 방법은 시험관 내 oocyte meiotic 성숙 도중 다른 전환에서 표적 mRNA의 번역의 활성화 그리고 억압을 공부하는 전략을 설명합니다. IL-7은 난낭구-적혈구 세포 통신8,13에관여할 수 있는 난모세포에 의해 방출된 사이토카인이 본 방법을 설명하기 위해 선택되었다. IL-7은 난마귀 성숙도 8 동안 점점 더 번역되는 것으로 알려져 있...

완전히 자란 포유류 난소세포는 토티포텐시의 수정 및 획득에 대비하여 급격한 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 수정 후 배아 발달을 유지하는 데 필수적입니다. 핵 성숙과 관련된 사건은 비교적 잘 설명되어 있지만, 난모세포 세포질의 분자 과정과 경로에 대해 훨씬 적게 알려져 있습니다. 난모세포 성숙의 마지막 단계 동안, 난모세포는 전사적으로 침묵하며 유전자 발현은 mRNA 번역 및 분해1,2에전적으로 의존한다. 발달 능력에 중요한 단백질의 합성은, 그러므로, oocyte 성장1,3도중 이전에 합성된 장수 mRNA의 시간별 번역의 프로그램에 의존합니다. 메이오능 성숙 과 난소 -zygote 전환 중에 실행 된 모성 mRNA 번역의이 프로그램을 정의하는 초점의 일환으로,이 논문은 체외 메이오틱 성숙 동안 단일 oocytes에서 대상 모계 mRNAs의 번역의 활성화 및 억압을 연구하는 전략을 제시한다.
이 방법에서 YPet 오픈 판독 프레임은 관심 있는 성적증명서의 3' UTR의 상류로 복제됩니다. 다음으로, mRNA는 주입된 볼륨을 제어하기 위해 mCherry를 코딩하는 폴리아데니얼mRNA와 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 리포터 축적은 시간 경과 현미경 검사를 사용하여 체외 수막 마이오틱 성숙 중에 측정됩니다. 황색 형광 단백질(YFP)과 mCherry의 축적은 개별 난소세포에 기록되며, YFP 신호는 공동 주입된 mCherry의 고원 수준에 의해 수정된다. 데이터 수집 후, 변환 속도는 곡선 피팅에 의해 얻어진 곡선의 경사를 계산하여 체외 우피 메이오틱 성숙 중에 다른 시간 간격으로 계산됩니다.
이 방법은 선택한 내생 성 mRNA의 번역 의 변화를 실험적으로 확인하는 도구를 제공합니다. 또한, 이 방법은 표적 mRNA4,5,6의3'UTR의 시스-규제 요소를 조작하여 난파성 메이오틱 성숙 시 번역을 제어하는 조절 요소의 특성화를 용이하게 한다. 폴리(A) 꼬리 길이를 조작하면 난모세포5에서아데닐라제/데아데닐라제 활동에 대한 통찰력을 허용한다. 시스 작용 원소 또는 RNA 면역 침전의 돌연변이 발생은 코그네이트 RNA 결합 단백질6,7과의상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 오낭화 화질 감소와 관련된 모델에서 타겟 3'UTR 번역을 측정하여 난낭성 개발 능력에 중요한 번역 프로그램의 필수 구성 요소를 식별하는 데 사용할 수 있다 8,9,10. 이 방법 논문은 IL-7의 3'UTR에 융합된 Ypet 리포터와 함께 21일 된 C57/BL6 마우스의 디누드 난동구가 마이크로 주입된 대표적인 실험을 제시한다. 난구 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 설정 및 프로토콜이 설명되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

난수 핵 성숙과 관련된 사건은 잘 설명되어 있다. 그러나, 훨씬 적은 풍부하게 함의 풍부하게 하고 취득을 위한 준비에 있는 세포질에서 일어나는 분자 통로 및 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 난모성 성숙 도중, 유전자 발현의 변경은 전사보다는 모계 메신저 RNA (mRNA)의 번역 그리고 저하에 전적으로 달려 있습니다. 따라서 번역 프로그램의 실행은 배아 발달을 유지하기 위해 난소 세포 발달 역량을 확립하는 데 중요한 역할을합니다. 이 논문은 메이오틱 성숙 과 난소 - zygote 전환 에서 발생하는 모계 mRNA 번역의 프로그램을 정의하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 논문에서는 체외 내분피 성숙 중에 표적 mRNA의 번역 을 연구하는 전략이 제시됩니다. 여기서, Ypet 기자는 관심 있는 유전자의 3'un번역 영역(UTR)에 융합된 다음, 주입된 부피를 제어하기 위해 mCherry를 위한 폴리아데니얼mRNA 인코딩과 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 시간 경과 현미경 을 사용하여 기자 축적을 측정함으로써, 번역 속도는 난소 메이오틱 성숙 동안 다른 전환에서 계산됩니다. 여기서, 난소 분리 및 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 프로토콜이 Ypet/interleukin-7(IL-7)-3'UTR 리포터를 예로 들 수 있다.

21일 된 C57/BL6 마우스의 탈누드 prophase I-체포 난동세포는 Il-7 및 mRNA 인코딩 mCherry의 3'UTR에 융합된 Ypet 기자를 코딩하는 mRNA를 포함하는 기자 믹스를 주입하였다. YFP와 mCherry 표현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 음의 통제로 1단계에서 체포되었다. 3개의 성숙한 난동체는 지연된 GVBD(N=2)를 가지고 있거나 기록(N=1) 동안 접시에 이동했기 때문에 분석을 위해 제외되었습?...

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Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

이 프로토콜은 시험관 내 성숙 시 단일 난초에서 mRNA 번역의 조절을 연구하기 위해 기자 분석에 설명합니다.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

이 방법은 난모세포 성숙 시 번역을 제어하는 규제 요소를 식별하고 특성화하는 데 사용될 수 있습니다. 시험관 내 난해성 전반에 걸쳐 기자 축적을 평가하기 위해 시간 경과 현미경 검사를 적용했습니다. 이것은 정확하게 번역 활성화 또는 억압이 oocyte 성숙 도중 일어나는 시간을 정확하게 찾아내습니다.시작하려면 26 게이지 바늘로 여포 벽에 작은 절단을 함으로써 개미 여포를 조심스럽게 엽니다. 입으로 작동하는 유리 파이펫을 사용하여 여러 층의 적혈구로 손상되지 않은 COC를 분리합니다. 더 작은 파이펫을 사용하고 반복 파이프팅을 통해 COC를 기계적으로 디누드합니다.탈모한 난토를 흡입하고 시트로스타미드의 마이크로몰라 1장으로 보충된 성숙 매체를 곁들인 페트리 접시에 넣습니다. 난모세포가 여포로부터의 고립으로 인한 스트레스로부터 회복될 수 있도록 2시간 동안 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 10센티미터 길이의 보로실리케이트 유리 모세관 튜브를 기계 풀러에 넣고 주사 바늘을 준비합니다.최적의 주사를 위해 가열 된 필라멘트를 사용하여 45도 각도로 바늘 끝을 구부립니다. 폴리스티렌 접시에 기본 oocyte 수집 매체의 20 마이크로 리터 방울을 놓고, 가벼운 미네랄 오일로 방울을 덮습니다. Ypet UTR및 mCherry각각의 마이크로리터 당 12.5 마이크로그램을 추가하여 더 많은 양의 리포터 믹스를 준비합니다.영하 80도에 이들의 알리쿼트를 보관하십시오. 해동시 알리쿼트(aliquot)를 20, 000회 G로 2분간 원심분리한 다음 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮긴다. 기자 믹스의 약 0.5 마이크로 리터로 주사 바늘을적재한다.홀더에 홀딩 파이펫과 주입 바늘을 놓고 오피테 수집 매체의 액적에 놓습니다. 조심스럽게 보유 파이펫에 대해 눌러 주입 바늘을 엽니 다. 보낭을 기본 수집 매체의 액적에 놓고 리포터 믹스의 5~10피콜리터를 주입합니다.16시간 동안 1개의 마이크로몰러 시로사미드로 난모세포와 성숙 배지를 배양하여 mCherry 신호를 고원에 허용합니다. 시간 경과 현미경 검사법의 경우, 각 주입 된 기자에 대한 성숙 배지의 20 마이크로 리터 방울, 제어 prophase I-체포 oocytes를위한 마이크로 몰러 cilostamide 1 방울, 성숙 난모를위한 시로스타미드가없는 한 방울로 페트리 접시를 준비하십시오. 경광물 오일로 물방울을 덮고 인큐베이터에 넣습니다.사전 인큐베이션 후 인큐베이터에서 주입 된 난모세포를 제거하고 cilostamide없이 성숙 배지에서 4 번 세척하십시오. 1개의 마이크로몰러 cilostamide를 프로페이즈 I oocyte 대조군으로 성숙 배지에 일부 난토를 보관하십시오. 이전에 준비된 시간 경과 현미경 접시에 주입된 난모세포를 각각의 물방울로 옮깁니다.녹음 중에 움직임을 방지하기 위해 밀폐 된 유리 파이펫으로 난모를 클러스터합니다. 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 식기 방출 다이오드 제거 시스템과 환경 챔버가 장착된 전동 단계는 텍스트 원고에 언급된 매개변수를 사용하여 37도 및 이산화탄소 5%로 유지되는 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 앱을 클릭한 다음 다차원 인수를 클릭하여 시간 경과 실험에 적합한 설정을 입력합니다.첫 번째 탭 Main을 선택하고 시간 경과, 여러 스테이지 위치 및 여러 파장을 선택합니다. 탭 저장을 선택하여 실험을 저장해야 하는 위치를 입력합니다. 그런 다음 탭 Time-Lapse를 선택하여 시간 점, 기간 및 시간 간격을 입력합니다.탭 스테이지를 선택하고, 밝은 필드를 전환하고, 새 창을 열고 획득, 획득 및 라이브 표시를 선택하여 난모세포의 위치를 찾습니다. 난모세포가 있는 후에는 다차원 획득 창으로 돌아가 서 플러스를 눌러 난모세포의 위치를 설정합니다. 탭 파장을 선택하고 밝은 필드, YFP 및 mCherry에 대한 세 가지 다른 파장을 설정합니다.Ypet 및 mCherry에 대한 노출을 조정한 다음 획득을 클릭하여 시간 경과 실험을 시작합니다. Ypet 3개의 주요 UTR 번역을 분석하기 위해 각 난소에 대해 두 개의 영역 측정, 타원 영역을 클릭하여 난소 세포 자체, 직사각형 영역을 클릭하여 배경 감산에 사용할 난모세포 주변의 작은 영역을 수행합니다. 리전 측정 데이터를 열기 로그를 클릭한 다음 데이터를 기록하여 스프레드시트로 내보냅니다.각 개별 난소 및 측정된 모든 시간점에 대해 YFP 및 mCherry 파장에 대해 별도로 난낭 영역 측정에서 백그라운드 영역 측정을 뺍니다. mCherry와 YFP의 발현은 39개의 난초로 기록되었으며, 그 중 30개가 성숙되었고, 9명은 부정적 통제로 1단계에서 체포되었다. Prophase I-체포 및 성숙 난귀세포의 신호에 대한 개별 YFP 대 mCherry 비율은 Prophase I-체포 및 성숙 난모세포에 대한 마지막 10 시간 지점의 평균 mCherry 신호로 YFP 신호를 분할하여 주입 된 부피에 대해 수정되었다.기자 YFP의 번역률은 YFP대 mCherry 비율을 prophase I에서 피팅하고, 첫 0~2시간 동안, 또는 선형 회귀를 사용하여 시로사다미드 방출 후 8~10시간 동안 성숙한 난귀에 의해 측정되었다. 리포터의 축적은 시로스타미드 방출 후 0~2시간에서 8~10시간 사이의 번역률의 현저한 차이로 표시된 선형 패턴을 따르지 않으며, 이는 난소근 성숙 시 인터류키닌 7 번역의 활성화를 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때 기록 시작 시 노출 시간이 적절한지 확인합니다.오키테 메이오틱 재개 중에 번역이 활성화되면 시간 과정에서 신호가 포화될 수 있습니다. MRMA의 안정성은 YFP에 대한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 확인될 수 있다. 번역의 변화를 확인하려면 V5 기술에 대한 항체로 서양 얼룩을 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

를 사용하여 기능성 복제<em&gt; Xenopus의</em&gt; 난자 발현 시스템

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

전기 자극을 사용하여 Biowires 인간 줄기 세포 유래 심근 세포의 성숙

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...