Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 GM097165, GM116926 og Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 til Marco Conti. Enrico M. Daldello ble støttet av et stipend fra Lalor Foundation og Natasja G. J. Costermans ble støttet av et Rubicon-stipend fra Nederlands organisasjon for vitenskapelig forskning (NWO).

De eksperimentelle prosedyrene som involverte dyr ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved University of California i San Francisco (protokoll AN182026).
1. Utarbeidelse av medier
<ol><li>Legg til alle komponentene, som beskrevet i Tabell 1, for å lage det grunnleggende oocyttsamlingsmediet og oocyttmodningsmediet. For det grunnleggende samlingsmediet setter du pH til 7,4. For både oppsamlings- og modningsmedium, tilsett 3 mg/ml bovint serumalbumin (...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Den presenterte metoden beskriver en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelse av mål mRNA ved ulike overganger under in vitro oocytt meiotisk modning. IL-7, en cytokin utgitt av oocytten som kan være involvert i oocyte-cumulus cellekommunikasjon8,13, ble valgt med det formål å beskrive denne metoden. IL-7 er kjent for å bli stadig mer oversatt under oocyttmodning8 og muliggjør god visualisering av...

En fullvoksen pattedyr oocytt gjennomgår raske endringer i forberedelsen til befruktning og oppkjøp av totipotens. Disse endringene er avgjørende for å opprettholde embryonal utvikling etter befruktning. Selv om hendelsene knyttet til kjernefysisk modning er relativt godt beskrevet, er mye mindre kjent om molekylære prosesser og veier i oocyttcyttcytoplasma. I de siste stadiene av oocyttmodning er oocytter transkripsjonelt stille, og genuttrykk er helt avhengig av mRNA-oversettelse og nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som er kritisk for utviklingskompetanse, er derfor avhengig av et program for tidsbelastet oversettelse av langvarige mRNAer som har blitt syntetisert tidligere under oocyttvekst1,3. Som en del av et fokus på å definere dette programmet for mors mRNA-oversettelse utført under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen, presenterer denne artikkelen en strategi for å studere aktivering og undertrykkelse av oversettelsen av mål maternal mRNAer i enkle oocytter under in vitro meiotisk modning.
I denne metoden klones den åpne leserammen YPet oppstrøms for 3' UTR av transkripsjonen av interesse. Deretter blir mRNAer som koder denne reporteren mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylerte mRNAer som koder mCherry for å kontrollere for injisert volum. Reporter akkumulering måles under in vitro oocytt meiotisk modning ved hjelp av tidsforløpmikroskopi. Akkumuleringen av gult fluorescerende protein (YFP) og mCherry registreres i individuelle oocytter, og YFP-signaler korrigeres av det platåede nivået av co-injisert mCherry. Etter datainnsamling beregnes oversettelseshastigheter for ulike tidsintervaller under in vitro oocytt meiotisk modning ved å beregne hellingen av kurven oppnådd ved kurvetilpasning.
Denne tilnærmingen gir et verktøy for å eksperimentelt bekrefte endringer i oversettelsen av utvalgte endogene mRNAer. I tillegg forenkler denne metoden karakterisering av regulatoriske elementer som kontrollerer oversettelse under oocytt meiotisk modning ved å manipulere cis-regulatoriske elementer i 3' UTR for mål mRNAer4,5,6. Manipulering av poly (A) hale lengde gir også innsikt i adenylase / deadenylase aktivitet i oocytter5. Mutagenese av cis-fungerende elementer eller RNA immunoprecipitation kan brukes til å studere interaksjoner med cognate RNA bindende proteiner6,7. I tillegg kan denne metoden brukes til å identifisere viktige komponenter i oversettelsesprogrammet som er kritiske for oocyttutviklingskompetanse ved å måle mål 3' UTR-oversettelse i modeller knyttet til redusert oocyttkvalitet 8,9,10. Dette metodepapiret presenterer et representativt eksperiment der denuderte oocytter av 21-dagers C57/BL6-mus har blitt mikroinjisert med en Ypet-reporter smeltet sammen til 3' UTR av IL-7. Oppsettet og protokollen for oocyttinjeksjon, tidsforløpregistrering og dataanalyse er beskrevet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Hendelser knyttet til oocytt kjernefysisk modning er godt beskrevet. Imidlertid er mye mindre kjent om molekylære veier og prosesser som foregår i cytoplasma som forberedelse til befruktning og oppkjøp av totipotens. Under oocyttmodning avhenger endringer i genuttrykk utelukkende av oversettelse og nedbrytning av mors budbringer-RNAer (mRNAer) i stedet for transkripsjon. Gjennomføring av oversettelsesprogrammet spiller derfor en nøkkelrolle i etableringen av oocyttutviklingskompetanse for å opprettholde embryoutvikling. Dette dokumentet er en del av et fokus på å definere programmet for mors mRNA-oversettelse som foregår under meiotisk modning og ved oocytt-til-zygote-overgangen. I dette metodenotatet presenteres en strategi for å studere regulering av oversettelse av mål-mRNAer under in vitro oocyttmodning. Her er en Ypet-reporter smeltet sammen til 3's uoversatte region (UTR) av genet av interesse og deretter mikroinjisert i oocytter sammen med polyadenylert mRNA-koding for mCherry for å kontrollere for injisert volum. Ved å bruke intervallmikroskopi for å måle reporterakkumulering, beregnes oversettelseshastigheter ved ulike overganger under oocyttmet meiotisk modning. Her er protokollene for oocyttisolasjon og injeksjon, tidsforløpopptak og dataanalyse beskrevet ved hjelp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reporter som eksempel.

Denuded prophase I-arresterte oocytter av 21-dagers C57/BL6 mus ble injisert med en reporter blanding som inneholder mRNA koding Ypet reporter smeltet til 3 ' UTR av IL-7 og mRNA koding mCherry. YFP og mCherry uttrykk ble registrert i 39 oocytter, hvorav 30 ble modnet, og 9 ble arrestert i profase I som en negativ kontroll. Tre modne oocytter ble utelukket for analyse fordi de enten hadde en forsinket GVBD (N = 2) eller flyttet i parabolen under innspillingen (N = 1). Figur 3 viser mCherry- ...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Denne protokollen beskriver en reporteranalyse for å studere reguleringen av mRNA-oversettelse i enkle oocytter under in vitro modning.

Definere programmet for maternal mRNA-oversettelse under in vitro modning ved hjelp av en enkelt Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Denne metoden kan brukes til å identifisere og karakterisere regulatoriske elementer som kontrollerer oversettelse under oocyttmodning. Vi brukte tidsforløpmikroskopi for å vurdere reporterakkumulering gjennom in-vitro oocyttmodning. Dette fastslår nøyaktig tidspunktet når translasjonsaktivering eller undertrykkelse finner sted under oocyttmodning.Til å begynne med, åpne forsiktig antralsekkene ved å lage et lite kutt i follikkelveggen med en 26 gauge nål. Isoler intakte COCer med flere lag cumulus-celler ved hjelp av en munndrevet glasspipette. Bruk en mindre pipette og fornekt COCene mekanisk ved gjentatt pipettering.Aspirer de denuderte oocyttene og legg dem i en petriskål med modningsmedium supplert med en mikromolar cilostamid. Legg parabolen i en inkubator i to timer for å la oocyttene komme seg fra stresset forårsaket av isolasjonen fra folliklene. Plasser et 10 centimeter langt borosilikatglass kapillærrør i en mekanisk puller for å forberede injeksjonsnåler.Bøy nålespissen i en 45-graders vinkel ved hjelp av en oppvarmet filament for optimal injeksjon. Legg 20 mikroliterdråper av grunnleggende oocyttoppsamlingsmedium i en polystyrenfat, og dekk dråpene med lett mineralolje. Forbered et større volum av reporterblanding ved å legge til 12,5 mikrogram per mikroliter Ypet UTR og mCherry hver.Lagre aliquots av disse ved minus 80 grader Celsius. Ved opptining, sentrifuger aliquot i to minutter ved 20.000 ganger G, og overfør det deretter til et nytt mikrocentrifugerør. Last injeksjonsnålen med ca. 0,5 mikroliter reporterblanding.Plasser pipetten og injeksjonsnålen i holderne og plasser dem i dråpen av oocyttoppsamlingsmedium. Åpne injeksjonsnålen ved å banke den forsiktig mot pipetten. Plasser oocytter i en dråpe grunnleggende samlingsmedium og injiser fem til ti picoliters av reporterblandingen.Inkuber oocyttene og modningsmediet med en mikromolar cilostamid i 16 timer for å la mCherry-signalet platå. For tidsforløpmikroskopi, lag en Petri-tallerken med to 20 mikroliterdråper modningsmedium for hver injisert reporter, en dråpe med en mikromolar cilostamid for kontrollprofase I-arresterte oocytter, og en dråpe uten cilostamid for modning av oocytter. Dekk dråpene med lett mineralolje og legg dem i inkubatoren.Etter pre-inkubasjon, fjern de injiserte oocyttene fra inkubatoren og vask dem fire ganger i modningsmedium uten cilostamid. Hold noen oocytter i modningsmedium med en mikromolar cilostamid som en profase I oocyte kontrollgruppe. Overfør de injiserte oocyttene til sine respektive dråper på den tidligere forberedte mikroskopfatet.Klynge oocyttene med en lukket glasspipette for å forhindre bevegelse under innspillingen. Plasser parabolen under mikroskopet utstyrt med et lysdiode elimineringssystem og et motorisert stadium utstyrt med et miljøkammer opprettholdt ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, ved hjelp av parametrene nevnt i tekstmanuskriptet. Angi de riktige innstillingene for tidsforløpeksperimentet ved å klikke på Apper og deretter Flerdimensjonalt oppkjøp.Velg den første fanen Hoved, og velg tidsforløp, flere faseposisjoner og flere bølgelengder. Velg fanen Lagre for å angi stedet der eksperimentet skal lagres. Velg deretter fanen Tidsforløp for å angi antall tidspoeng, varighet og tidsintervall.Velg fanen Scene, slå på brightfield, og finn plasseringen av oocyttene ved å åpne et nytt vindu og velge Hent, Hent og Vis direkte. Når oocyttene er plassert, bytter du tilbake til det flerdimensjonale oppkjøpsvinduet og trykker på pluss for å angi plasseringen av oocyttene. Velg fanen Bølgelengder, og angi tre forskjellige bølgelengder for brightfield, YFP og mCherry.Juster eksponeringen for Ypet og mCherry, og start deretter tidsforløpeksperimentet ved å klikke på Acquire. For analyse av Ypet tre prime UTR oversettelse, utføre to region målinger for hver oocytt, oocytten selv ved å klikke på ellipse regionen, og en liten region rundt oocytten som skal brukes til bakgrunns subtraksjon ved å klikke på rektangulær region. Eksporter områdemålingsdataene til et regneark ved å klikke Åpne logg og deretter Loggdata.For hver enkelt oocytt og for alle målte tidspunkter trekker du bakgrunnsregionmålingen fra målingen av oocyttområdet separat for YFP- og mCherry-bølgelengder. Uttrykket av mCherry og YFP i profase I og modne oocytter ble registrert i 39 oocytter, hvorav 30 ble modnet, og ni ble arrestert i profase I som en negativ kontroll. Individuelle YFP- til mCherry-forhold for signaler om profase I-arresterte og modne oocytter ble korrigert for injisert volum ved å dele YFP-signalet med det gjennomsnittlige mCherry-signalet fra de siste 10 tidspunktene for profase I-arresterte og modne oocytter.Oversettelsesratene til reporteren YFP ble målt ved kurvetilpasning av YFP- til mCherry-forholdet i profase I og i modning av oocytter i løpet av de første null til to timene, eller åtte til ti timer etter cilostamidfrigjøring ved hjelp av lineær regresjon. Akkumuleringen av reporteren følger ikke et lineært mønster, som indikert av en betydelig forskjell i oversettelseshastigheter mellom null til to timer og åtte til 10 timer etter cilostamid-utgivelsen, noe som indikerer aktivering av interleukin 7 oversettelse under oocytt myotisk modning. Når du prøver denne protokollen, må du kontrollere at eksponeringstiden er tilstrekkelig i begynnelsen av opptaket.Husk at signalet kan mette i løpet av tidskurset hvis oversettelse aktiveres under oocytt meiotisk gjenopptakelse. Stabiliteten til MRMA kan bekreftes av PCR ved hjelp av primere for YFP. For å bekrefte endringer i oversettelsen kan du bruke vestlig blotting med et antistoff mot en V5-teknologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metode for Lineage Sporing av Korneale Cells Bruke Multi-farge Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funksjonell Cloning Ved hjelp av en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Vurdering av Maternal vaskulær remodelle under graviditeten i Mouse Livmor

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funksjonell Manipulering av mors Gene Products Bruke<em&gt; In Vitro</em&gt; Oocytmodningen i Sebrafisk

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Modning av human-stamcelle avledet kardiomyocytter i Biowires ved hjelp av elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em&gt; I Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...