Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R01 GM097165, GM116926 и Юнис Кеннеди Шрайвер NICHD Национальными центрами трансляционных исследований в области репродукции и бесплодия P50 HD055764 Марко Конти. Энрико М. Далделло был поддержан стипендией Фонда Лалора, а Натасья Г. Я. Костерманс была поддержана стипендией Рубикона от Нидерландской организации научных исследований (NWO).

Экспериментальные процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Сан-Франциско (протокол AN182026).
1. Подготовка СМИ
<ol><li>Добавьте все компоненты, как описано в таблице 1,<...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Представленный метод описывает стратегию изучения активации и подавления трансляции целевой мРНК при различных переходах при мейотическом созревании мейотического созревания ооцитов in vitro. IL-7, цитокин, высвобождаемый ооцитом, который может быть вовлечен в ооцитар-кучевую клето?...

Полностью выращенный ооцит млекопитающего претерпевает быстрые изменения при подготовке к оплодотворению и приобретении котипотентности. Эти изменения необходимы для поддержания эмбрионального развития после оплодотворения. Хотя события, связанные с ядерным созреванием, относительно хорошо описаны, гораздо меньше известно о молекулярных процессах и путях в цитоплазме ооцитов. На заключительных стадиях созревания ооцитов ооциты транскрипционно молчат, а экспрессия генов полностью зависит от трансляции и деградации мРНК1,2. Синтез белков, критически важных для развития компетентности, поэтому опирается на программу временной трансляции долгоживущих мРНК, которые были синтезированы ранее во время роста ооцитов1,3. В рамках акцента на определении этой программы трансляции материнской мРНК, выполняемой во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу, в статье представлена стратегия изучения активации и подавления трансляции целевых материнских мРНК в одиночных ооцитах при мейотическом созревании in vitro.
В этом методе открытая рамка чтения YPet клонируется выше 3' UTR интересуемой транскрипты. Затем мРНК, кодирующие этот репортер, микроинъецируются в ооциты вместе с полиаденилированными мРНК, кодируемыми mCherry, для контроля инъецируемого объема. Накопление репортера измеряется во время мейотического созревания ооцитов in vitro с помощью покадровой микроскопии. Накопление желтого флуоресцентного белка (YFP) и mCherry регистрируется в отдельных ооцитах, а сигналы YFP корректируются плато-уровнем совместно вводимого mCherry. После сбора данных рассчитываются скорости трансляции для различных временных интервалов во время мейотического созревания мейотических яйцеклеток in vitro путем вычисления наклона кривой, полученной путем подгонки кривой.
Этот подход предоставляет инструмент для экспериментального подтверждения изменений в трансляции выбранных эндогенных мРНК. Кроме того, этот метод облегчает характеристику регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время мейотического созревания ооцитов путем манипулирования цис-регуляторными элементами 3' UTR целевых мРНК4,5,6. Манипуляции с длиной поли(А) хвоста также позволяют понять активность аденилазы/моденилазы в ооцитах5. Мутагенез цис-действующих элементов или иммунопреципитация РНК может быть использован для изучения взаимодействий с родственными РНК-связывающими белками6,7. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации основных компонентов программы трансляции, которые имеют решающее значение для компетентности развития ооцитов, путем измерения целевой трансляции 3' UTR в моделях, связанных со снижением качества ооцитов 8,9,10. В этой методной работе представлен репрезентативный эксперимент, в котором оголенные ооциты 21-дневных мышей C57 / BL6 были микроинъецированы с репортером Ypet, слитым с 3'UTR IL-7. Описаны установка и протокол для инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

События, связанные с созреванием ядер ооцитов, хорошо описаны. Однако гораздо меньше известно о молекулярных путях и процессах, которые происходят в цитоплазме при подготовке к оплодотворению и приобретению тотипотентности. Во время созревания ооцитов изменения в экспрессии генов зависят исключительно от трансляции и деградации материнских матричных РНК (мРНК), а не от транскрипции. Таким образом, выполнение трансляционной программы играет ключевую роль в установлении компетентности развития ооцитов для поддержания развития эмбриона. Данная работа является частью фокуса на определении программы трансляции материнской мРНК, которая происходит во время мейотического созревания и при переходе ооцитов в зиготу. В данной методе представлена стратегия исследования регуляции трансляции целевых мРНК при созревании ооцитов in vitro. Здесь репортер Ypet сливается с 3'-й нетранслируемой областью (UTR) интересуемого гена, а затем микроинъецируется в ооциты вместе с полиаденилированной мРНК, кодирующей для mCherry для контроля введенного объема. Используя покадровую микроскопию для измерения репортерного накопления, скорость трансляции рассчитывается при различных переходах во время мейотического созревания ооцитов. Здесь описаны протоколы выделения и инъекции ооцитов, покадровой записи и анализа данных с использованием репортера Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR в качестве примера.

Оголенные профазные I-арестованные ооциты 21-дневных мышей C57/BL6 вводили репортерную смесь, содержащую мРНК, кодирующую репортера Ypet, слитую с 3'UTR IL-7 и мРНК, кодирующих mCherry. Экспрессия YFP и mCherry была зарегистрирована в 39 ооцитах, из которых 30 были зрелыми, а 9 были арестованы в профазе I в каче...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Этот протокол описывает репортерный анализ для изучения регуляции трансляции мРНК в отдельных ооцитах во время созревания in vitro.

Определение программы трансляции материнской мРНК при созревании in vitro с помощью анализа одного репортера ооцитов

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Этот метод может быть использован для выявления и характеристики регуляторных элементов, контролирующих трансляцию во время созревания ооцитов. Мы применили покадровую микроскопию для оценки накопления репортеров на протяжении созревания ооцитов in vitro. Это точно определяет время, когда трансляционная активация или репрессия происходит во время созревания ооцитов.Для начала осторожно откройте антральные фолликулы, сделав небольшой разрез в стенке фолликула иглой 26 калибра. Изолируйте неповрежденные КОК с несколькими слоями кучевых клеток с помощью стеклянной пипетки, управляемой ртом. Используйте пипетку меньшего размера и механически обнажить КОК путем повторного пипетирования.Аспирировать оголенные ооциты и поместить их в чашку Петри со средой созревания, дополненной одним микромоляром цилостамида. Поместите блюдо в инкубатор на два часа, чтобы яйцеклетки оправились от стресса, вызванного их выделением из фолликулов. Поместите боросиликатную стеклянную капиллярную трубку длиной 10 сантиметров в механический съемник для приготовления инъекционных игл.Согните наконечник иглы под углом 45 градусов, используя нагретую нить для оптимальной инъекции. Поместите 20 микролитровых капель основной среды сбора ооцитов в полистирольная посуду и накройте капли легким минеральным маслом. Приготовьте больший объем репортерной смеси, добавив по 12,5 мкг на микролитр Ypet UTR и mCherry каждый.Храните их аликвоты при минус 80 градусах Цельсия. После оттаивания центрифугируют аликвотку в течение двух минут при 20 000 G, затем переложите ее на новую микроцентрифужную трубку. Загрузите инъекционную иглу примерно 0,5 микролитра репортерной смеси.Поместите удерживающая пипетку и инъекционную иглу в держатели и поместите их в каплю среды сбора ооцитов. Откройте инъекционную иглу, осторожно постукивая ею по удерживающей пипетке. Поместите ооциты в каплю основной среды сбора и ввести от пяти до 10 пиколитров репортерной смеси.Инкубируют ооциты и среду созревания одним микромолярным цилостамидом в течение 16 часов, чтобы сигнал mCherry вышел на плато. Для покадровой микроскопии приготовьте чашку Петри с двумя 20 микролитрами капли среды созревания для каждого введенного репортера, одной каплей с одним микромолярным цилостамидом для контроля профазных I-арестованных ооцитов и одной каплей без цилостамида для созревания ооцитов. Накройте капли легким минеральным маслом и поместите их в инкубатор.После предварительной инкубации удаляют введенные ооциты из инкубатора и промывают их четыре раза в среде созревания без цилостамида. Держите некоторые ооциты в среде созревания с помощью одного микромолярной цилостамида в качестве профазы I контрольной группы ооцитов. Перенесите введенные ооциты в соответствующие капли на предварительно подготовленной тарелке для покадрового микроскопа.Сгруппировать ооциты с помощью закрытой стеклянной пипетки, чтобы предотвратить их движение во время записи. Поместите тарелку под микроскоп, оснащенный системой устранения светодиодов и моторизованной ступенью, оснащенной экологической камерой, поддерживаемой при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, используя параметры, указанные в текстовой рукописи. Введите соответствующие параметры для эксперимента с замедленной съемкой, щелкнув Приложения, а затем Многомерное получение.Выберите первую вкладку Главная и выберите покадровую съемку, несколько положений ступеней и несколько длин волн. Выберите вкладку Сохранение, чтобы ввести место, где должен быть сохранен эксперимент. Затем выберите вкладку Time-Lapse, чтобы ввести количество точек времени, продолжительность и интервал времени.Выберите вкладку Рабочая область, включите brightfield и найдите положение ооцитов, открыв новое окно и выбрав Получить, Получить и Показать в реальном времени. Как только ооциты будут расположены, переключитесь обратно в многомерное окно сбора и нажмите плюс, чтобы установить местоположение ооцитов. Выберите вкладку Длины волн и задайте три разные длины волн для brightfield, YFP и mCherry.Отрегулируйте экспозицию для Ypet и mCherry, затем запустите эксперимент с покадровой съемкой, нажав на «Получить». Для анализа трансляции Ypet три основных UTR выполните два измерения области для каждой яйцеклетки, саму яйцеклетку, щелкнув по области эллипса, и небольшую область, окружающую ооцит, которая будет использоваться для фонового вычитания, щелкнув прямоугольную область. Экспортируйте данные измерения региона в электронную таблицу, щелкнув Открыть журнал, а затем Данные журнала.Для каждой отдельной яйцеклетки и для всех измеренных временных точек вычтите измерение фоновой области из измерения области ооцитов отдельно для длин волн YFP и mCherry. Экспрессия mCherry и YFP в профазных I и созревающих ооцитах была зарегистрирована в 39 ооцитах, из которых 30 были зрелыми, а девять были арестованы в профазе I в качестве отрицательного контроля. Индивидуальные соотношения YFP к mCherry для сигналов профазных I-арестованных и созревающих ооцитов корректировали на вводимый объем путем деления сигнала YFP на средний сигнал mCherry последних 10 временных точек для профазных I-арестованных и созревающих ооцитов.Скорость трансляции репортерного YFP измеряли кривой, подгоняющей отношение YFP к mCherry в профазе I и в созревающих ооцитах в течение первых нулевых-двух часов или от восьми до 10 часов после высвобождения цилостамида с использованием линейной регрессии. Накопление репортера не следует линейной схеме, о чем свидетельствует значительная разница в скорости трансляции от нуля до двух часов и от восьми до 10 часов после высвобождения цилостамида, что указывает на активацию трансляции интерлейкина 7 во время созревания миоций ооцитов. При попытке этого протокола убедитесь, что время экспозиции является достаточным в начале записи.Имейте в виду, что сигнал может насыщаться во время временного курса, если трансляция активируется во время мейотического возобновления ооцитов. Стабильность МРМА может быть подтверждена ПЦР, с использованием праймеров для YFP. Чтобы подтвердить изменения в переводе, вы можете использовать вестерн-блоттинг с антителом против технологии V5.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Функциональная Клонирование Использование<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов выражение системы

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Оценка материнской сосудистого ремоделирования во время беременности в матке мышей

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Функциональная Манипуляция материнских генных продуктов с помощью<em&gt; In Vitro</em&gt; Созревание ооцитов в данио рерио

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Созревание стволовых клеток человека, полученных кардиомиоцитов в Biowires Использование электрической стимуляции

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Анализ 5-кратного точечного блоттинга Количественный анализ уровня метилирования ДНК дифференцировки хондроцитов<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Быстрое и эффективное выражение нескольких белков в птичьих эмбрионах с использованием мРНК Электропорации

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...