Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NIH R01 GM097165, GM116926 y Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 a Marco Conti. Enrico M. Daldello recibió el apoyo de una beca de la Fundación Lalor y Natasja G. J. Costermans recibió el apoyo de una beca Rubicon de la Organización Neerlandesa para la Investigación Científica (NWO).

Los procedimientos experimentales con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco (protocolo AN182026).
1. Preparación de medios
<ol><li>Añadir todos los componentes, como se describe en la Tabla 1,para hacer el medio básico de recolección de ovocitos y el medio de maduración de ovocitos. Para el medio de recolección básico, establezca el pH en 7.4. Tanto para el medio de recolecc...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

El actual método describe una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción del mRNA de la blanco en diversas transiciones durante la maduración meiótica in vitro del oocyte. IL-7, un cytokine lanzado por el oocyte que se puede implicar en la comunicación8de la célula del oocyte-cumulus,13,fue elegido con el fin de describir este método. Il-7 se sabe para ser traducido cada vez más durante la maduración<sup class="xref...

Un ovocito mamífero completamente crecido sufre cambios rápidos en la preparación para la fertilización y la adquisición de totipotency. Estos cambios son esenciales para sostener el desarrollo embrionario después de la fertilización. Aunque los eventos asociados con la maduración nuclear están relativamente bien descritos, se sabe mucho menos sobre los procesos moleculares y las vías en el citoplasma de los ovocitos. Durante las etapas finales de la maduración de los ovocitos, los ovocitos son transcripcionalmente silenciosos, y la expresión génica depende totalmente de la traducción y degradación delARNm 1,2. La síntesis de proteínas críticas para la competencia en el desarrollo, por lo tanto, se basa en un programa de traducción cronometiva de ARNm de larga vida que se han sintetizado antes durante el crecimientode los ovocitos 1,3. Como parte de un foco en la definición de este programa de la traducción maternal del mRNA ejecutada durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto, este papel presenta una estrategia para estudiar la activación y la represión de la traducción de los mRNAs maternales de la blanco en solos ovocitos durante la maduración meiotic in vitro.
En este método, el marco de lectura abierto YPet se clona aguas arriba de la 3' UTR de la transcripción de interés. A continuación, los ARNm que codifican este reportero se microinyectan en los ovocitos junto con los ARNm poliadenilados que codifican mCherry para controlar el volumen inyectado. La acumulación del reportero se mide durante la maduración meiótica in vitro del oocyte usando microscopia del lapso de tiempo. La acumulación de proteína fluorescente amarilla (YFP) y mCherry se registra en ovocitos individuales, y las señales de YFP se corrigen por el nivel estancado de la mCherry co-inyectada. Después de la adquisición de datos, las tasas de traducción se calculan para diferentes intervalos de tiempo durante la maduración meiótica de ovocitos in vitro calculando la pendiente de la curva obtenida por el ajuste de la curva.
Este enfoque proporciona una herramienta para confirmar experimentalmente los cambios en la traducción de ARNm endógenos seleccionados. Además, este método facilita la caracterización de los elementos reguladores que controlan la traslación durante la maduración meiótica de los ovocitos mediante la manipulación de elementos cis-reguladores de la UTR 3' de los ARNm diana4,5,6. La manipulación de la longitud de la cola de poli(A) también permite comprender la actividad de la adenilasa/deadenilasa enlos ovocitos 5. La mutagénesis de elementos de acción cis o inmunoprecipitación de ARN puede utilizarse para estudiar las interacciones con proteínas de unión a ARN cognado6,7. Además, este método se puede utilizar para identificar los componentes esenciales del programa de traducción que son críticos para la competencia en el desarrollo de los ovocitos mediante la medición de la traducción de utr objetivo 3' en modelos asociados con la disminución de la calidad de los ovocitos 8,9,10. Este papel del método presenta un experimento representativo donde los ovocitos denudados de 21 días de ratones C57/BL6 se han micro-inyectado con un reportero de Ypet fundido al 3' UTR de IL-7. La configuración y el protocolo para la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Los eventos asociados con la maduración nuclear de ovocitos han sido bien descritos. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca de las vías moleculares y procesos que tienen lugar en el citoplasma en preparación para la fertilización y adquisición de totipotency. Durante la maduración de los ovocitos, los cambios en la expresión génica dependen exclusivamente de la traducción y degradación de los ARN mensajeros maternos (ARNm) en lugar de la transcripción. La ejecución del programa traslacional, por lo tanto, juega un papel clave en el establecimiento de la competencia de desarrollo de ovocitos para sostener el desarrollo embrionario. Este papel es parte de un foco en la definición del programa de la traducción maternal del mRNA que ocurre durante la maduración meiótica y en la transición del oocyte-a-cigoto. En este trabajo de método, se presenta una estrategia para estudiar la regulación de la traducción de arns diana durante la maduración in vitro de los ovocitos. Aquí, un reportero de Ypet se fusiona a la región sin traducir 3' (UTR) del gen de interés y luego se microinyecta en ovocitos junto con la codificación de ARNm poliadenilada para que mCherry controle el volumen inyectado. Mediante el uso de microscopía de lapso de tiempo para medir la acumulación de reporteros, las tasas de traducción se calculan en diferentes transiciones durante la maduración meiótica de los ovocitos. Aquí, los protocolos para el aislamiento y la inyección del oocyte, la grabación del lapso de tiempo, y el análisis de datos se han descrito, usando el Ypet/interleukin-7 (IL-7) - 3' UTR reportero como ejemplo.

Los ovocitos I-arrestados de la profase denudada de 21 ratones de un día C57/BL6 fueron inyectados con una mezcla del reportero que contenía el mRNA que codificaba el reportero de Ypet fundido al 3' UTR de IL-7 y del mRNA que codificaba mCherry. La expresión de YFP y de mCherry fue registrada en 39 ovocitos, cuyo 30 fueron madurados, y 9 fueron arrestados en la profase I como control negativo. Tres ovocitos maduros fueron excluidos para el análisis porque tenían un GVBD retrasado (N=2) o movidos en el plato durante ...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Este protocolo describe un análisis del reportero para estudiar la regulación de la traducción del mRNA en solos ovocitos durante la maduración in vitro.

Definición del programa de traducción del ARNm materno durante la maduración in vitro utilizando un solo ensayo de reportero de ovocitos

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Este método se puede utilizar para identificar y caracterizar los elementos reguladores que controlan la traducción durante la maduración del ovocito. Aplicamos microscopia del lapso de tiempo para evaluar la acumulación del reportero a través de la maduración in vitro del oocyte. Esto señala con precisión el momento en que la activación o represión traslacional tiene lugar durante la maduración de los ovocitos.Para comenzar, abra cuidadosamente los folículos antrales haciendo un pequeño corte en la pared del folículo con una aguja calibre 26. Aísle los AOC intactos con varias capas de células cumulus usando una pipeta de vidrio operada por la boca. Utilice una pipeta más pequeña y denude mecánicamente los AOC mediante pipeteo repetido.Aspirar los ovocitos denudados y colocarlos en una placa de Petri con medio de maduración suplementado con un micromolar de cilostamida. Colocar el plato en una incubadora durante dos horas para dejar que los ovocitos se recuperen del estrés inducido por su aislamiento de los folículos. Coloque un tubo capilar de vidrio de borosilicato de 10 centímetros de largo en un tirador mecánico para preparar agujas de inyección.Doble la punta de la aguja en un ángulo de 45 grados usando un filamento calentado para una inyección óptima. Coloque 20 gotitas de microlitro de medio básico de recolección de ovocitos en un plato de poliestireno y cubra las gotitas con aceite mineral ligero. Prepare un mayor volumen de mezcla de reporteros agregando 12.5 microgramos por microlitro de Ypet UTR y mCherry cada uno.Guarde las alícuotas de estos a menos 80 grados Centígrados. Al descongelar, centrífuga la alícuota durante dos minutos a 20, 000 veces G, luego transferirlo a un nuevo tubo de microcentrífuga. Cargue la aguja de inyección con aproximadamente 0,5 microlitros de mezcla de reportero.Coloque la pipeta de sujeción y la aguja de inyección en los soportes y colóquelos en la gota del medio de recolección de ovocitos. Abra la aguja de inyección tocándola suavemente contra la pipeta de sujeción. Coloque los ovocitos en una gota de medio de recolección básico e inyecte de cinco a 10 picolitros de la mezcla del reportero.Incubar los ovocitos y el medio de maduración con una cilostamida micromolar durante 16 horas para permitir que la señal de mCherry se estabilice. Para la microscopía de lapso de tiempo, prepare una placa de Petri con dos gotitas de 20 microlitros de medio de maduración para cada reportero inyectado, una gotita con una cilostamida micromolar para el control de ovocitos detenidos por la fase I, y una gotita sin cilostamida para ovocitos maduros. Cubra las gotitas con aceite mineral ligero y colóquelas en la incubadora.Después de la preincubación, retire los ovocitos inyectados de la incubadora y lávelos cuatro veces en medio de maduración sin cilostamida. Mantenga algunos ovocitos en medio de maduración con una cilostamida micromolar como grupo control de ovocitos de profase I. Transfiera los ovocitos inyectados a sus respectivas gotitas en el plato de microscopio de lapso de tiempo previamente preparado.Agrupe los ovocitos con una pipeta de vidrio cerrada para evitar su movimiento durante la grabación. Coloque el plato bajo el microscopio equipado con un sistema de eliminación de diodos emisores de luz y una etapa motorizada equipada con una cámara ambiental mantenida a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono, utilizando los parámetros mencionados en el manuscrito del texto. Introduzca la configuración adecuada para el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Aplicaciones y, a continuación, en Adquisición multidimensional.Seleccione la primera pestaña Principal y seleccione lapso de tiempo, varias posiciones de escenario y múltiples longitudes de onda. Seleccione la pestaña Guardar para entrar en la ubicación donde se debe guardar el experimento. A continuación, seleccione la pestaña Time-Lapse para introducir el número de puntos de tiempo, la duración y el intervalo de tiempo.Seleccione la pestaña Etapa, active brightfield y localice la posición de los ovocitos abriendo una nueva ventana y seleccionando Adquirir, Adquirir y Mostrar en vivo. Una vez que los ovocitos están ubicados, vuelva a la ventana de adquisición multidimensional y presione plus para establecer la ubicación de los ovocitos. Seleccione la pestaña Longitudes de onda y establezca tres longitudes de onda diferentes para brightfield, YFP y mCherry.Ajuste la exposición para Ypet y mCherry, luego comience el experimento de lapso de tiempo haciendo clic en Adquirir. Para el análisis de la traducción de Ypet tres primos UTR, realice dos mediciones de la región para cada ovocito, el ovocito sí mismo haciendo clic en la región de la elipse, y una pequeña región que rodea el ovocito que se utilizará para la sustracción del fondo haciendo clic en la región rectangular. Exporte los datos de medición de la región a una hoja de cálculo haciendo clic en Abrir registro y, a continuación, en Datos de registro.Para cada ovocito individual y para todos los puntos de tiempo medidos, reste la medición de la región de fondo de la medición de la región del ovocito por separado para las longitudes de onda YFP y mCherry. La expresión de mCherry y de YFP en la profase I y los ovocitos maduros fue registrada en 39 ovocitos, cuyo 30 fueron madurados, y nueve fueron arrestados en la profase I como control negativo. Los cocientes individuales de YFP a mCherry para las señales de los ovocitos I-arrestados y maduros de la profase fueron corregidos para el volumen inyectado dividiendo la señal de YFP por la señal media del mCherry de los 10 puntos pasados del tiempo para la profase I-arrestada y madurando los ovocitos.Las tasas de traducción del reportero YFP se midieron ajustando la curva de la YFP a las relaciones mCherry en la profase I y en la maduración de los ovocitos durante el primer cero a dos horas, o de ocho a 10 horas después de la liberación de cilostamida mediante regresión lineal. La acumulación del reportero no sigue un patrón lineal, como lo indica una diferencia significativa en las tasas de traducción entre cero a dos horas y ocho a 10 horas después de la liberación de cilostamida, lo que indica la activación de la traducción de interleucina 7 durante la maduración miótica de los ovocitos. Al intentar este protocolo, asegúrese de que el tiempo de exposición es adecuado al principio de la grabación.Tenga en cuenta que la señal podría saturarse durante el curso de tiempo si la traducción se activa durante la reanudación meiótica de ovocitos. La estabilidad del MRMA se puede confirmar por la polimerización en cadena, usando los cebadores para YFP. Para confirmar los cambios en la traducción, puede usar Western blotting con un anticuerpo contra una tecnología V5.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Clonación funcional utilizando una<em&gt; Xenopus</em&gt; Sistema de Expresión de ovocitos

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de ovocitos en el pez cebra

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

La maduración de madre humanas cardiomiocitos derivado de células en Biowires uso de la estimulación eléctrica

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expresión rápida y eficiente de múltiples proteínas en embriones aviares utilizando la electroporación de ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...