Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R01 GM097165, GM116926 och Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 till Marco Conti. Enrico M. Daldello stöddes av ett stipendium från Lalor Foundation och Natasja G. J. Costermans fick stöd av ett Rubicon-stipendium från Nederländernas organisation för vetenskaplig forskning (NWO).

Försöksförfarandena med djur godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of California i San Francisco (protokoll AN182026).
1. Förberedelse av medier
<ol><li>Tillsätt alla komponenter, enligt beskrivningen i tabell 1, föratt göra det grundläggande oocytsamlingsmediet och oocytemognadsmediet. För det grundläggande insamlingsmediet ställer du in pH-7.4. För både insamlings- och mognadsmedium, tillsätt 3 mg/ml bovint serumalbumin (BSA...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Den presenterade metoden beskriver en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål mRNA vid olika övergångar under in vitro oocyte meiotic mognad. IL-7, en cytokin som frigörs av äggcellen som kan vara involverad i oocyt-cumulus cell kommunikation8,13, valdes för att beskriva denna metod. IL-7 är känt för att alltmer översättas under oocyte mognad8 och möjliggör god visualisering av tran...

En fullvuxen däggdjur oocyte genomgår snabba förändringar i förberedelse för befruktning och förvärv av totipotency. Dessa förändringar är nödvändiga för att upprätthålla embryonal utveckling efter befruktning. Även om händelserna i samband med nukleära mognad är relativt väl beskrivna, är mycket mindre känt om de molekylära processerna och vägarna i oocyt cytoplasma. Under de sista stadierna av oocyte mognad, oocyter är transkriptionellt tyst, och genuttryck är helt beroende av mRNA översättning och nedbrytning1,2. Syntesen av proteiner som är kritiska för utvecklingskompetens förlitar sig därför på ett program för tidsbeställning av långlivade mRNAs som har syntetiserats tidigare under oocyttillväxt1,3. Som en del av ett fokus på att definiera detta program av moderns mRNA översättning utförs under meiotic mognad och vid oocyte-till-zygote övergången, presenterar detta dokument en strategi för att studera aktivering och förtryck av översättning av mål moderns mRNAs i enstaka äggceller under in vitro meiotic mognad.
I den här metoden klonas YPet:s öppna läsram uppströms 3' UTR av den avskrift av intresse. Därefter injiceras mRNAs kodning denna reporter i oocyter tillsammans med polyadenylerade mRNAs kodning mCherry för att kontrollera för injicerad volym. Reporter ackumulering mäts under in vitro oocyte meiotic mognad med tid-förfall mikroskopi. Ackumulering av gult fluorescerande protein (YFP) och mCherry registreras i enskilda oocyter, och YFP-signaler korrigeras av den platåerade nivån hos den samin injicerade mCherry. Efter datainsamling beräknas omräkningshastigheterna för olika tidsintervall under in vitro-oocyte meiotisk mognad genom beräkning av lutningen på kurvan som erhålls genom kurvpassning.
Den här metoden ger ett verktyg för att experimentellt bekräfta ändringar i översättningen av utvalda endogena mRNAs. Dessutom underlättar denna metod karakteriseringen av regleringselement som styr översättning under oocyte meiotisk mognad genom att manipulera cis-reglerande element i 3' UTR av mål mRNAs4,5,6. Manipulering av poly(A) svanslängd ger också insikt i adenylas/ deadenylase aktivitet i oocyter5. Mutagenes av cis-verkande element eller RNA immunprecipitation kan användas för att studera interaktioner med cognate RNA bindandeproteiner 6,7. Dessutom kan denna metod användas för att identifiera väsentliga komponenter i översättningsprogrammet som är avgörande för oocyteutvecklingskompetens genom att mäta mål 3' UTR-översättning i modeller associerade med minskad oocytkvalitet 8,9,10. Detta metodpapper presenterar ett representativt experiment där denuded oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss har mikro-injicerats med en Ypet reporter smält till 3' UTR il-7. Inställning och protokoll för oocyte injektion, time-lapse inspelning och data analys har beskrivits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Händelser i samband med oocyte nukleära mognad har beskrivits väl. Men mycket mindre är känt om de molekylära vägar och processer som äger rum i cytoplasman som förberedelse för befruktning och förvärv av totipotens. Under oocyte mognad beror förändringar i genuttryck uteslutande på översättning och nedbrytning av moderns budbärar-RNAs (mRNAs) snarare än på transkription. Genomförandet av översättningsprogrammet spelar därför en nyckelroll för att etablera oocyteutvecklingskompetens för att upprätthålla embryoutvecklingen. Detta dokument är en del av ett fokus på att definiera programmet för moderns mRNA översättning som äger rum under meiotisk mognad och vid oocyte-till-zygote övergången. I detta metoddokument presenteras en strategi för att studera regleringen av översättning av mål mRNAs under in vitro oocyte mognad. Här smälts en Ypet-reporter till 3' oöversatta regionen (UTR) av genen av intresse och sedan mikroin injiceras i oocyter tillsammans med polyadenylerad mRNA kodning för mCherry att kontrollera för injicerad volym. Genom att använda tidsfördröjningsmikroskopi för att mäta reporterackumulering beräknas översättningshastigheterna vid olika övergångar under oocyte meiotisk mognad. Här har protokollen för oocytisolering och injektion, timelapse-inspelning och dataanalys beskrivits, med hjälp av Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR-reportern som exempel.

Denuded prophase I-arresterade oocyter av 21-dagars gamla C57/BL6 möss injicerades med en reporter blandning som innehåller mRNA kodning Ypet reporter smält till 3' UTR il-7 och mRNA kodning mCherry. YFP och mCherry uttryck registrerades i 39 äggceller, varav 30 mognades, och 9 arresterades i prophase I som en negativ kontroll. Tre mognande äggceller uteslöts för analys eftersom de antingen hade en fördröjd GVBD (N=2) eller flyttades i skålen under inspelningen (N=1). Figur 3 visar...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Detta protokoll beskriver en reporter analys att studera regleringen av mRNA översättning i enstaka äggceller under in vitro mognad.

Definiera programmet för moderns mRNA-översättning under in vitro-mognad med hjälp av en enda Oocyte Reporter-analys

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Denna metod kan användas för att identifiera och karakterisera regleringselement som styr översättningen under oocytemognad. Vi tillämpade time-lapse mikroskopi för att bedöma reporter ackumulering under in vitro oocyte mognad. Detta pekar exakt på den tid då translationell aktivering eller förtryck sker under oocyte mognad.För att börja, öppna försiktigt antralsäckarna genom att göra ett litet snitt i follikelväggen med en 26 gauge nål. Isolera intakta COCs med flera lager av cumulusceller med hjälp av en munopererad glaspipett. Använd en mindre pipett och densera coc:erna mekaniskt genom upprepad pipettering.Aspirera de denuderade äggcellerna och placera dem i en petriskål med mognadsmedium kompletterat med en mikromolar cilostamide. Placera skålen i en inkubator i två timmar för att låta äggcellerna återhämta sig från stressen som induceras av deras isolering från folliklarna. Placera ett 10 centimeter långt borosilikatglas kapillärrör i en mekanisk puller för att förbereda injektionsnålar.Böj nålspetsen i 45 graders vinkel med en uppvärmd glödtråd för optimal injektion. Placera 20 mikroliterdroppar av grundläggande oocytuppsamlingsmedium i en polystyrenform och täck dropparna med lätt mineralolja. Förbered en större volym reportermix genom att lägga till 12,5 mikrogram per mikroliter Ypet UTR och mCherry vardera.Lagra alikvoter av dessa vid minus 80 grader Celsius. Vid upptining, centrifugera alikvoten i två minuter vid 20 000 gånger G och överför den sedan till ett nytt mikrocentrifugrör. Ladda injektionsnålen med cirka 0,5 mikroliter reporterblandning.Placera håll pipetten och injektionsnålen i hållarna och placera dem i droppen av oocytuppsamlingsmediet. Öppna injektionsnålen genom att försiktigt knacka den mot den hållande pipetten. Placera äggceller i en droppe av grundläggande samlingsmedium och injicera fem till tio picoliter av reporterblandningen.Inkubera äggcellerna och mognadsmediet med en mikromolär cilostamid i 16 timmar för att låta mCherry-signalen platå. För time-lapse mikroskopi, förbered en Petri skål med två 20 mikroliter droppar mognad medium för varje injicerad reporter, en droppe med en mikromolar cilostamide för kontroll prophasE I-arresterade äggceller och en droppe utan cilostamide för mogna oocyter. Täck dropparna med lätt mineralolja och placera dem i inkubatorn.Efter förinkubation, ta bort de injicerade äggcellerna från inkubatorn och tvätta dem fyra gånger i mognadsmedium utan cilostamid. Håll några oocyter i mognadsmedium med en mikromolär cilostamide som profas I oocyte kontrollgrupp. Överför de injicerade äggcellerna till sina respektive droppar på den tidigare beredda tidsfördröjningsmikroskopformen.Gruppera äggcellerna med en sluten glaspipett för att förhindra deras rörelse under inspelningen. Placera skålen under mikroskopet utrustad med ett ljusavgivande diodelimineringssystem och ett motoriserat stadium utrustat med en miljökammare som hålls vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, med hjälp av parametrarna som nämns i textmanuskriptet. Ange lämpliga inställningar för tidsfördröjningsexperimentet genom att klicka på Appar och sedan på Flerdimensionellt förvärv.Välj den första fliken Huvud och välj tidsfördröjning, flerstegspositioner och flera våglängder. Välj fliken Spara för att ange den plats där experimentet ska sparas. Välj sedan fliken Time-Lapse för att ange antalet tidspunkter, varaktighet och tidsintervall.Välj fliken Scen, slå på brightfield och leta reda på oocyternas position genom att öppna ett nytt fönster och välja Hämta, hämta och Visa live. När äggcellerna är placerade, växla tillbaka till det flerdimensionella förvärvsfönstret och tryck plus för att ställa in oocyternas placering. Välj fliken Våglängder och ställ in tre olika våglängder för brightfield, YFP och mCherry.Justera exponeringen för Ypet och mCherry och starta sedan timelapsexperimentet genom att klicka på Förvärva. För analys av Ypet tre främsta UTR översättning, utför två region mätningar för varje oocyt, oocyte själv genom att klicka på ellipse regionen och en liten region som omger äggcellen som ska användas för bakgrund subtraktion genom att klicka på rektangulära regionen. Exportera regionmätningsdata till ett kalkylblad genom att klicka på Öppna logg och sedan logga data.För varje enskild oocyt och för alla uppmätta tidpunkter subtraherar du bakgrundsregionmätningen från oocyteregionens mätning separat för YFP- och mCherry-våglängder. Uttrycket av mCherry och YFP i prophase I och mogna oocyter registrerades i 39 äggceller, varav 30 mognades, och nio arresterades i prophase I som en negativ kontroll. Enskilda YFP till mCherry förhållanden för signaler av prophase I-arresterade och mogna oocyter korrigerades för injicerad volym genom att dividera YFP signalen med den genomsnittliga mCherry signalen av de senaste 10 tidpunkterna för prophase I-arresterade och mogna oocyter.Översättningshastigheter för reportern YFP mättes genom kurva som passade förhållandet YFP till mCherry i profas I och i mognande äggceller under de första noll till två timmarna, eller åtta till tio timmar efter cilostamide release med linjär regression. Ackumuleringen av reportern följer inte ett linjärt mönster, vilket indikeras av en betydande skillnad i översättningshastigheter mellan noll till två timmar och åtta till tio timmar efter cilostamide release, vilket indikerar aktivering av interleukin 7 översättning under oocyte myotic mognad. När du försöker med det här protokollet kontrollerar du att exponeringstiden är tillräcklig i början av inspelningen.Tänk på att signalen kan mättas under tidskursen om översättning aktiveras under oocyte meiotic återupptagande. Mrmas stabilitet kan bekräftas av PCR med hjälp av primers för YFP. För att bekräfta ändringar i översättningen kan du använda western blotting med en antikropp mot en V5-teknik.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metod för Lineage spårning av hornhinnan celler Använda Multi-färg Fluorescerande Reporter Möss

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funktionell kloning med hjälp av en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Bedömning av Maternal kärlremodellering under graviditeten i musen livmoder

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Funktionell Manipulering av Maternal Gene produkter Använda<em&gt; In Vitro</em&gt; Oocytmognad i Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Mognad av mänskliga stamceller som härrör Cardiomyocytes i Biowires Använda elektrisk stimulering

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...