Name: defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Bu çalışma NIH R01 GM097165, GM116926 ve Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 tarafından Marco Conti'ye desteklenmiştir. Enrico M. Daldello, Lalor Vakfı'ndan bir burs, Natasja G. J. Costermans ise Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nden (NWO) rubicon bursu ile desteklendi.

Hayvanları içeren deneysel prosedürler, San Francisco'daki Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (an182026 protokolü) tarafından onaylandı.
1. Medyanın hazırlanması
<ol><li>Temel oosit toplama ortamını ve oosit olgunlaşma ortamını yapmak için Tablo 1'deaçıklandığı gibi tüm bileşenleri ekleyin. Temel toplama ortamı için pH'ı 7,4 olarak ayarlayın. Hem toplama hem de olgunlaşma ortamı için, kullanım gününde 3 mg/m...

<ol>
	<li>Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+control+of+gene+expression+during+mouse+oogenesis.">Post-transcriptional control of gene expression during mouse oogenesis.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 55, 1-21 (2012).</li><li>Gosden, R., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portrait+of+an+oocyte:+our+obscure+origin.">Portrait of an oocyte: our obscure origin.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 973-983 (2010).</li><li>Conti, M., Sousa Martins, J. P., Han, S. J., Franciosi, F., Menon, K. M. J., Goldstrohm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+the+germ+line.">Translational control in the germ line.</a> Posttranscriptional Mechanisms in Endocrine Regulation. , 129-156 (2015).</li><li>Dai, X. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinational+code+for+mRNA+3'UTR-mediated+translational+control+in+the+mouse+oocyte.">A combinational code for mRNA 3'UTR-mediated translational control in the mouse oocyte.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 328-340 (2019).</li><li>Luong, X. G., Daldello, E. M., Rajkovic, G., Yang, C. R., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+reveals+a+switch+in+the+translational+program+upon+oocyte+meiotic+resumption.">Genome-wide analysis reveals a switch in the translational program upon oocyte meiotic resumption.</a> Nucleic Acids Research. 48 (6), 3257-3276 (2020).</li><li>Yang, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+DAZL+functions+as+repressor+and+activator+of+mRNA+translation+during+oocyte+maturation.">The RNA-binding protein DAZL functions as repressor and activator of mRNA translation during oocyte maturation.</a> Nature Communications. 11, 1399 (2020).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+(Dazl)+at+the+oocyte-to-zygote+transition.">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes &amp; Development. 25 (7), 755-766 (2011).</li><li>Cakmak, H., Franciosi, F., Musa Zamah, A., Cedars, M. I., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+secretion+during+meiotic+reentry+integrates+the+function+of+the+oocyte+and+cumulus+cells.">Dynamic secretion during meiotic reentry integrates the function of the oocyte and cumulus cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (9), 2424-2429 (2016).</li><li>Daldello, E. M., Luong, X. G., Yang, C. R., Kuhn, J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B2+is+required+for+progression+through+meiosis+in+mouse+oocytes.">Cyclin B2 is required for progression through meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 146 (8), (2019).</li><li>Franciosi, F., Manandhar, S., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FSH+regulates+mRNA+translation+in+mouse+oocytes+and+promotes+developmental+competence.">FSH regulates mRNA translation in mouse oocytes and promotes developmental competence.</a> Endocrinology. 157 (2), 872-882 (2016).</li><li>Peters, H., Byskov, A. G., Himelstein-braw, R., Faber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth:+the+basic+event+in+the+mouse+and+human+ovary.">Follicular growth: the basic event in the mouse and human ovary.</a> Reproduction. 45 (3), 559-566 (1975).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cilostamide+and+forskolin+on+the+meiotic+resumption+and+embryonic+development+of+immature+human+oocytes.">Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes.</a> Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-expressed+Interleukin+7+suppresses+granulosa+cell+apoptosis+and+promotes+oocyte+maturation+in+rats.">Oocyte-expressed Interleukin 7 suppresses granulosa cell apoptosis and promotes oocyte maturation in rats.</a> Biology of Reproduction. 84 (4), 707-714 (2011).</li><li>Ma, J., Fukuda, Y., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobilization+of+dormant+Cnot7+mRNA+promotes+deadenylation+of+maternal+transcripts+during+mouse+oocyte+maturation.">Mobilization of dormant Cnot7 mRNA promotes deadenylation of maternal transcripts during mouse oocyte maturation.</a> Biology of Reproduction. 93 (2), 1-12 (2015).</li><li>Sha, Q. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNOT+6L+couples+the+selective+degradation+of+maternal+transcripts+to+meiotic+cell+cycle+progression+in+mouse+oocyte.">CNOT 6L couples the selective degradation of maternal transcripts to meiotic cell cycle progression in mouse oocyte.</a> The EMBO journal. 37 (24), 99333 (2018).</li><li>Yartseva, V., Giraldez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal-to-zygotic+transition+during+vertebrate+development:+A+model+for+reprogramming.">The maternal-to-zygotic transition during vertebrate development: A model for reprogramming.</a> Current Topics in Developmental Biology. 113, 191-232 (2015).</li><li>Ma&#353;ek, T., Val&#225;&#353;ek, L., Posp&#237;&#353;ek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+analysis+and+RNA+purification+from+sucrose+gradients.">Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients.</a> Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).</li><li>Martins, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAZL+and+CPEB1+regulate+mRNA+translation+synergistically+during+oocyte+maturation.">DAZL and CPEB1 regulate mRNA translation synergistically during oocyte maturation.</a> Journal of Cell Science. 129 (6), 1271-1282 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+mRNAs+with+distinct+3'+UTRs+define+the+temporal+pattern+of+Ccnb1+synthesis+during+mouse+oocyte+meiotic+maturation.">Maternal mRNAs with distinct 3' UTRs define the temporal pattern of Ccnb1 synthesis during mouse oocyte meiotic maturation.</a> Genes &amp; development. 31, 1302-1307 (2017).</li><li>Cheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive,+coordinated+protein-level+changes+driven+by+transcript+isoform+switching+during+meiosis.">Pervasive, coordinated protein-level changes driven by transcript isoform switching during meiosis.</a> Cell. 172 (5), 910-923 (2018).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+3'+uridylation+and+poly(A)+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome.">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li><li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation.">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes.">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li></ol>

Sunulan yöntem, in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde hedef mRNA'nın aktivasyonunu ve çevirisinin baskısını incelemek için bir stratejiyi açıklar. Oosit-kümülüs hücre iletişimi8,13,bu yöntemi tanımlamak amacıyla oosit tarafından salınan bir sitokin olan IL-7 seçildi. IL-7'nin oosit olgunlaşması8 sırasında giderek daha fazla çevrildiğini ve bu yöntemi kullanarak çevirisel ak...

Tamamen büyümüş bir memeli oosit, döllenmeye ve totipotency kazanımı için hazırlıkta hızlı değişikliklere uğrar. Bu değişiklikler döllenme sonrası embriyonik gelişimi sürdürmek için gereklidir. Nükleer olgunlaşma ile ilişkili olaylar nispeten iyi tanımlanmış olsa da, oosit sitoplazmasındaki moleküler süreçler ve yollar hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşmasının son aşamalarında, oositler transkripsiyonel olarak sessizdir ve gen ekspresyonu tamamen mRNA çevirisi ve bozulmasına bağlıdır1,2. Bu nedenle, gelişimsel yeterlilik için kritik proteinlerin sentezi, oosit büyümesi sırasında daha önce sentezlenen uzun ömürlü mRNA'ların zamanlanmış çevirisi programına dayanır1,3. Meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde yürütülen bu maternal mRNA çevirisi programını tanımlamaya odaklanan bu makale, in vitro meiotik olgunlaşma sırasında hedef maternal mRNA'ların tek oositlerde çevirisinin aktivasyonunu ve baskısını incelemek için bir strateji sunun bir parçası olarak sunulmaktadır.
Bu yöntemde, YPet açık okuma çerçevesi, ilgi dökümünün 3' UTR'sının yukarı akışında klonlanır. Daha sonra, bu muhabiri kodlayan mRNA'lar, enjekte edilen hacmi kontrol etmek için poliadenillenmiş mRNA'lar kodlama mCherry ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. İn vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak muhabir birikimi ölçülür. Sarı floresan protein (YFP) ve mCherry birikimi bireysel oositlerde kaydedilir ve YFP sinyalleri birlikte enjekte edilen mCherry'nin platolu seviyesi ile düzeltilir. Veri toplama işleminden sonra eğrinin montajla elde edilen eğrinin eğimi hesaplanarak in vitro oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı zaman aralıkları için çeviri oranları hesaplanır.
Bu yaklaşım, seçilen endojen mRNA'ların çevirislerindeki değişiklikleri deneysel olarak onaylamak için bir araç sağlar. Ek olarak, bu yöntem, hedef mRNAs4,5,6'nın3' UTR'sının cis düzenleyici unsurlarını manipüle ederek oosit meiotik olgunlaşma sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Poli(A) kuyruk uzunluğunun manipülasyonu ayrıca oositlerde adensilaz / deadenylaz aktivitesi hakkında fikir verir5. Cis etkili elementlerin mutajenisi veya RNA immün önksezisi, konyak RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri incelemek için kullanılabilir6,7. Ek olarak, bu yöntem, azaltılmış oosit kalitesi 8,9,10ile ilişkili modellerde hedef 3' UTR çevirisini ölçerek oosit gelişimsel yeterliliği için kritik olan çeviri programının temel bileşenlerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem makalesi, 21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded oositlerinin IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış bir Ypet muhabiri ile mikro enjekte edildiği temsili bir deney sunun. Oosit enjeksiyonu, zaman atlamalı kayıt ve veri analizi için kurulum ve protokol açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Preparation of media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SIAL-A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cilostamide</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>231085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12561-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered</td>
			<td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td>
			<td>25-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>JT-Baker</td>
			<td>3506-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of mRNA encoding YFP/3&#39; UTR and mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-102QD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1389-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choo-Choo Cloning Kit</td>
			<td>McLab</td>
			<td>CCK-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CutSmart Buffer (10x)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA loading dye (6x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Solution</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1 kb DNA ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plates with 100 &#181;g/mL Carbenicillin, Teknova&#160;</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>L1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Medium (Capsules)</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Transcription Clean-Up Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MfeI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(A) Tailing kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S.O.C. medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15544034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer&#160;</td>
			<td>Apex Biomedical&#160;</td>
			<td>20-193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Ethidium Bromide Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrated micro-pipettes</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>2-000-025&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG- 5000</td>
			<td>Mybiosource</td>
			<td>MBS142665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oocyte micro-injection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-20-C</td>
			<td>For time-lapse microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass with filament</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil for Embryo Culture</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>For micro-injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>For oocyte incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VacuTip Holding Capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5195000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of Figure 1S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaMorph, version 7.8.13.0&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>&#160;For time-lapse microscopy, analysis of 3&#39; UTR translation&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defining the program of maternal mrna translation during in vitro maturation using a single oocyte reporter assay

Oosit nükleer olgunlaşması ile ilgili olaylar iyi tanımlanmıştır. Bununla birlikte, döllenmeye ve totipotency kazanımı için sitoplazmada gerçekleşen moleküler yollar ve süreçler hakkında çok daha az şey bilinmektedir. Oosit olgunlaşması sırasında, gen ifadesindeki değişiklikler transkripsiyon yerine sadece anne haberci RNA'ların (mRNA'lar) çevirisine ve bozulmasına bağlıdır. Bu nedenle, çeviri programının yürütülmesi, embriyo gelişimini sürdürmek için oosit gelişimsel yeterliliğinin oluşturulmasında kilit bir rol oynar. Bu makale, meiotik olgunlaşma sırasında ve oosit-zigot geçişinde gerçekleşen maternal mRNA çeviri programını tanımlamaya odaklanılmasının bir parçasıdır. Bu yöntem makalesinde, in vitro oosit olgunlaşması sırasında hedef mRNA'ların çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir strateji sunulmuştur. Burada, bir Ypet muhabiri, ilgi geninin 3' çevrilmemiş bölgesine (UTR) kaynaştırıldı ve daha sonra enjekte edilen hacmi kontrol etmek için mCherry için poliadenillenmiş mRNA kodlaması ile birlikte oositlere mikro enjekte edilir. Muhabir birikimini ölçmek için zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak, oosit meiotik olgunlaşma sırasında farklı geçişlerde çeviri oranları hesaplanır. Burada, Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR muhabiri örnek olarak kullanılarak, oosit izolasyonu ve enjeksiyonu, hızlandırılmış kayıt ve veri analizi protokolleri açıklanmıştır.

21 günlük C57/BL6 farelerinin denuded prophase I-arrested oositlerine, IL-7'nin 3' UTR'sine kaynaşmış Ypet muhabirini kodlayan mRNA ve mRNA kodlama mCherry içeren bir muhabir karışımı enjekte edildi. YFP ve mCherry ifadesi 39 oositte kaydedildi, bunlardan 30'u olgunlaştı ve 9'u prophase I'de negatif kontrol olarak tutuklandı. Üç olgunlaşan oosit, gecikmiş bir GVBD'ye (N=2) sahip oldukları veya kayıt sırasında çanağa taşındıkları için analiz için hariç tutuldu (N=1). Şek...

Watch this Scientific Journal Video about Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay at JoVE.com

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Bu yöntem, oosit olgunlaşması sırasında çeviriyi kontrol eden düzenleyici unsurları tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. In-vitro oosit olgunlaşması boyunca muhabir birikimini değerlendirmek için zaman atlamalı mikroskopi uyguladık. Bu, oosit olgunlaşması sırasında çevirisel aktivasyonun veya baskının gerçekleştiği zamanı doğru bir şekilde tespit eder.Başlamak için, 26 kalibrelik bir iğne ile folikül duvarında küçük bir kesim yaparak antral folikülleri dikkatlice açın. Ağızla çalışan bir cam pipet kullanarak birkaç kat kümülüs hücresi ile bozulmamış COC'leri izole edin. Daha küçük bir pipet kullanın ve tekrarlanan pipetleme ile COC'leri mekanik olarak denude edin.Denuded oositleri epire edin ve bir mikromolar cilostamid ile desteklenmiş olgunlaşma ortamına sahip bir petri kabına yerleştirin. Oositlerin foliküllerden izole edilmesinin neden olduğu stresten kurtulması için yemeği iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için mekanik bir çekme makinesine 10 santimetre uzunluğunda borosilikat cam kılcal boru yerleştirin.En iyi enjeksiyon için ısıtılmış bir filament kullanarak iğne ucunu 45 derecelik bir açıyla bükün. Temel oosit toplama ortamının 20 mikroliter damlacığını bir polistiren kabına yerleştirin ve damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün. Her biri Ypet UTR ve mCherry mikroliteri başına 12,5 mikrogram ekleyerek daha büyük hacimli bir muhabir karışımı hazırlayın.Bunlardan aliquots eksi 80 santigrat derecede saklayın. Çözdükten sonra, aliquot'ı 20.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin, ardından yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Enjeksiyon iğnesini yaklaşık 0,5 mikrolitre muhabir karışımı ile yükleyin.Tutma pipetini ve enjeksiyon iğnesini tutuculara yerleştirin ve oosit toplama ortamının damlacığı içine yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini tutma pipetine hafifçe dokunarak açın. Oositleri temel toplama ortamının bir damlasına yerleştirin ve muhabir karışımının beş ila 10 pişolitresini enjekte edin.mCherry sinyalinin platoya girmesine izin vermek için oositleri ve olgunlaşma ortamını 16 saat boyunca bir mikromoler cilostamid ile kuluçkaya bırakın. Zaman atlamalı mikroskopi için, enjekte edilen her muhabir için iki adet 20 mikroliter olgunlaşma ortamı damlacıklı bir Petri kabı, profaz I-arrested oositleri kontrol etmek için bir mikromolar cilostamidli bir damlacık ve olgunlaşan oositler için cilostamid içermeyen bir damlacık hazırlayın. Damlacıkları hafif mineral yağ ile örtün ve inkübatöre yerleştirin.Ön inkübasyondan sonra, enjekte edilen oositleri inkübatörden çıkarın ve cilostamid olmadan olgunlaşma ortamında dört kez yıkayın. Bazı oositleri olgunlaşma ortamında bir mikromoler cilostamid ile profaz I oosit kontrol grubu olarak tutun. Enjekte edilen oositleri daha önce hazırlanmış zaman atlamalı mikroskop kabındaki ilgili damlacıklarına aktarın.Kayıt sırasında hareketlerini önlemek için oositleri kapalı bir cam pipetle kümeleyin. Metnin el yazmasında belirtilen parametreleri kullanarak, çanağı ışık yayan diyot eliminasyon sistemi ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte tutulan bir çevre odası ile donatılmış motorlu bir sahne ile donatılmış mikroskop altına yerleştirin. Uygulamalar'a ve ardından Çok Boyutlu Edinme'ye tıklayarak zaman atlamalı deneme için uygun ayarları girin.İlk sekme Ana'yı seçin ve zaman atlamalı, birden çok aşama konumu ve birden çok dalga boyu seçin. Denemenin kaydedileceği konumu girmek için Kaydetme sekmesini seçin. Ardından, zaman noktası, süre ve zaman aralığı sayısını girmek için Zaman Atlama sekmesini seçin.Yeni bir pencere açıp Canlı Al, Al ve Göster'i seçerek Sahne Alanı sekmesini seçin, brightfield'ı açın ve oositlerin konumunu bulun. Oositler bulunduktan sonra, çok boyutlu alım penceresine geri dönün ve oositlerin konumunu ayarlamak için artı tuşuna basın. Dalga Boyları sekmesini seçin ve brightfield, YFP ve mCherry için üç farklı dalga boyu ayarlayın.Ypet ve mCherry için pozlamayı ayarlayın, ardından Acquire'e tıklayarak zaman atlamalı denemeyi başlatın. Ypet üç asal UTR çevirisinin analizi için, her oosit için iki bölge ölçümü, elips bölgesine tıklayarak oosit kendisi ve dikdörtgen bölgeye tıklayarak arka plan çıkarma için kullanılacak oosit'i çevreleyen küçük bir bölge gerçekleştirin. Günlüğü Aç'ı ve ardından Verileri Günlüğe Kaydet'i tıklatarak bölge ölçüm verilerini bir elektronik tabloya verin.Her bir oosit ve ölçülen tüm zaman noktaları için, arka plan bölgesi ölçümünü YFP ve mCherry dalga boyları için ayrı ayrı oosit bölgesi ölçümünden çıkarın. Profaz I ve olgunlaşan oositlerde mCherry ve YFP ifadesi 39 oositte kaydedilmiş, bunlardan 30'u olgunlaşmış ve dokuzu profaz I'de negatif kontrol olarak tutuklanmıştır. Profaz I-arrested ve olgunlaşan oositlerin sinyalleri için bireysel YFP ila mCherry oranları, YFP sinyalini profaz I-arrested ve olgunlaşan oositler için son 10 zaman noktasının ortalama mCherry sinyaline bölerek enjekte edilen hacim için düzeltildi.Muhabir YFP'nin çeviri oranları, YFP'yi profaz I'deki mCherry oranlarına uyan eğri ile ve ilk sıfır ila iki saat boyunca veya doğrusal regresyon kullanılarak cilostamid salınımı sonrası sekiz ila 10 saat boyunca olgunlaşan oositlerde ölçüldü. Muhabirin birikimi, cilostamid salınımı sonrası sıfır ila iki saat ile sekiz ila 10 saat arasındaki çeviri oranlarında önemli bir farkla belirtildiği gibi doğrusal bir desen izlemez, bu da oksilat miyotik olgunlaşma sırasında interlökin 7 çevirisinin aktivasyonunu gösterir. Bu protokolü denerken, kaydın başında pozlama süresinin yeterli olduğundan emin olun.Oosit meiotik yeniden başlaması sırasında çeviri etkinleştirilirse sinyalin zaman kursu sırasında doyabileceğini unutmayın. MRMA'nın stabilitesi, YFP için astarlar kullanılarak PCR ile doğrulanabilir. Çevirideki değişiklikleri onaylamak için, Batı şişkinliğini bir V5 teknolojisine karşı bir antikorla kullanabilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Bir kullanılması Fonksiyonel Klonlama<em&gt; Xenopus</em&gt; Oosit ekspresyon sistemi

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Kullanılması Anne Gen Ürünlerinin Fonksiyonel Manipülasyonu<em&gt; İn Vitro</emZebra balığı&gt; Oosit Olgunlaştırma

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Maturation of Human Stem Cell-derived Cardiomyocytes in Biowires Using Electrical Stimulation

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) have been a promising cell source and have thus encouraged the investigation of their ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

MRNA Electroporation kullanarak Avian embriyoları çoklu proteinlerin hızlı ve verimli Ifade

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...