Name: estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Vi takker Institut for Plant &Soil Science og Cotton Inc. for deres delvise støtte til denne undersøgelse.

1. Udarbejdelse af planteprøver
<ol><li>Indsamle to måneder gamle bomuldsplanter fra drivhuset (Figur 1A).</li>
	<li>Vend urtepotter forsigtigt for at adskille jord og rødder med intakte laterale rødder ved at løsne jorden omkring planten (Figur 1B).</li>
	<li>Vask de opsamlede planter grundigt i bakker fyldt med vand for at fjerne alt snavs (til rodprøver)(Figur 1C).</li>
	<li>Brug papirhåndklæder til at tørre adskilte r...

<ol>
	<li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).</li><li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+utilization:+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects.">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li><li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization:+Toward+New+Platform+Chemicals.">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li><li>Xu, F., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).</li><li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins:+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants.">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).</li><li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots.">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li><li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants.">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li><li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+engineering.">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin.">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).</li><li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).</li><li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins:+a+comparative+characterisation+study.">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li><li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples.">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li><li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+biomass+through+lignin+modification.">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li><li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+lignin+structure,+pretreatments,+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential.">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li><li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Lignin+Be+Accurately+Measured.">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li><li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations.">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li><li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy.">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li><li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry.">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li><li>Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Determination+of+Lignin.">The Determination of Lignin.</a> Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry-past,+present+and+future.">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins.">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+Depolymerization+and+Conversion:+A+Review+of+Thermochemical+Methods.">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering &amp; Technology. 34, 29-41 (2011).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acetyl+bromide+method+is+faster,+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods.">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants:+Some+Cautionary+Notes.">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice.">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li><li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+:+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products.">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li><li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin.">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li><li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin:+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component.">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).</li><li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Industrial+Applications+of+Lignin:+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials.">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li><li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids.">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).</li><li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts.">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue.">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins.">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster,+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods.">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems.">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li><li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice,+Sorghum,+and+Sugar+Vane.">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).</li></ol>

Lignin spiller en væsentlig rolle i plantevækst og -udvikling og er for nylig blevet grundigt undersøgt for anvendelse af biobrændstof, bioenergi og bioprodukter. Lignin er rig på aromatiske forbindelser, der opbevares i alle vaskulære plante sekundære cellevægge. Det har flere industrielle anvendelser såsom træpanel produkter, bio dispergeringsmidler, flocculants, polyurethan skum og i harpikser af kredsløb29,30,31. ...

Lignin er en af de vitale bærende komponenter i plantecellevægge og den næstmest rigelige polymer på Jorden1. Kemisk er lignin en krydskædet heteropolymer bestående af høj molekylvægt komplekse phenolforbindelser, der danner en naturlig vedvarende kilde til aromatiske polymerer og syntese af biomaterialer2,3. Denne naturlige polymer spiller en betydelig rolle i plantevækst, udvikling, overlevelse, mekanisk støtte, cellevæg stivhed, vandtransport, mineraltransport, logiresistens, vævs- og organudvikling, aflejring af energi og beskyttelse mod biotiske og abiotiske belastninger4,5,6,7. Lignin består primært af tre forskellige monolignoler: coniferyl, sinapyl og p-coumaryl alkoholer, der er afledt af phenyl propanoid vej8,9. Mængden af lignin og sammensætningen af monomerer varierer baseret på plantearterne, vævs-/organtypen og forskellige stadier af planteudvikling10. Lignin er bredt klassificeret i nåletræ, hårdttræ og græs lignin baseret på kilden og monolignol sammensætning. Nåletræ består primært af 95% nåletræsalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hårdttræ har nåletræ og sinapylalkoholer i lige store mængder, mens græs lignin består af forskellige proportioner af nåletræ, sinapyl og p-coumaryl alkoholer11,12. Sammensætningen af monomerer er kritisk, da den bestemmer ligninstyrken, nedbrydningen og nedbrydningen af cellevæggen samt bestemmelse af molekylær struktur, forgrening og krydsning med andre polysaccharider13,14.
Lignin forskning får stadig større betydning i fouragering, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioethanol, biobrændstof, og bio-produkter på grund af sine lave omkostninger og høj overflod15,16. Forskellige kemiske metoder (f.eks acetylbromid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoxidation) sammen med instrumentale metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultraviolet (UV) spektrofotometri) blev anvendt til ligninkvantificering9,17. Brunkulsanalysemetoderne klassificeres generelt på grundlag af elektromagnetisk stråling, gravimetry og opløselighed. Princippet bag lignin skøn ved elektromagnetisk stråling var baseret på den kemiske egenskab af lignin, hvormed det absorberer lys ved specifikke bølgelængder. Disse resultater blev anslået ud fra princippet om, at lignin har en stærkere UV-absorbans end kulhydrater. I 1962 brugte Bolker og Somerville kaliumchloridpiller til at anslå ligninindholdet i træ18. Denne metode har imidlertid ulemper ved estimering af ligninindholdet fra urteagtige prøver på grund af tilstedeværelsen af ikke-lignin phenolforbindelser og fraværet af en passende udryddelseskoefficient. I 1970 fandt Fergus og Goring, at guaiacyl og syringyl sammensatte absorption maxima var på 280 nm og 270 nm, hvilket korrigerede udryddelseskoefficienten udstedelse af Bolker og Somerville metode19. Senere blev infrarød spektroskopi, en meget følsom teknik til karakterisering af phenolics, også brugt til lignin estimering med en lille mængde plantebiomasseprøver. Et eksempel på en sådan teknologi var diffus-reflektion Fourier transform spektrofotometri. Denne metode mangler imidlertid en ordentlig standard svarende til UV-metoden20. Senere blev ligninindholdet anslået af NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (nuklear magnetisk resonansspektroskopi). Selvom der er ulemper ved disse metoder, ændrer de ikke lignins kemiske struktur og bevarer sin renhed20.
Den gravimetriske Klason-metode er en direkte og den mest pålidelige analysemetode til ligninvurdering af træagtige stængler. Grundlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/opløselighed af ikke-ligninforbindelser og indsamling af uopløselig lignin til gravimetry21. I denne metode fjernes kulhydraterne ved hydrolyse af biomassen med koncentreret H2SO4 for at udtrække ligninrester20,22. Ligninindholdet, der anslås ved denne metode, kaldes syreopløselig lignin eller Klason lignin. Anvendelsen af Klason-metoden afhænger af plantearten, vævstypen og cellevægtypen. Tilstedeværelsen af variable mængder ikke-ligninkomponenter såsom tanniner, polysaccharider og proteiner resulterer i proportionale forskelle i skønnet over indholdet af syre uopløseligt/opløseligt ligninindhold. Derfor anbefales Klason-metoden kun til lignin-estimering af biomasse med højt ligninindhold , såsom træagtige stængler17,23. Opløselighedsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreopløselig lignin og thioglykolsyre (TGA) er mest anvendte metoder til vurdering af ligninindholdet fra forskellige kilder til plantebiomasse. Kim et al. etablerede to metoder til ligninudvinding ved opløselighed. Den første metode ekstraherer lignin som en uopløselig rest ved at opløse cellulose og hemicellulose, mens den anden metode adskiller lignin i den opløselige fraktion, hvilket efterlader cellulose og hemicellulose som det uopløselige reststof24.
Lignende metoder, der anvendes i ligninestimering baseret på opløseligheden, er thioglykolsyre (TGA) og acetylsbromidmetoder (AcBr)25. Både TGA- og acetylphidmetoderne anslår ligninindholdet ved at måle absorbansen af den opløselige lignin ved 280 nm; AcBr-metoden nedbryder imidlertid xylans under processen med lignin-opløselighed og viser en falsk stigning i ligninindholdet26. Thioglycolatmetoden (TGA) er den mere pålidelige metode, da den afhænger af specifik binding med de tregående grupper af benzylalkoholgrupper af lignin med TGA. Den TGA-bundne lignin udfældes under sure forhold ved hjælp af HCl, og ligninindholdet anslås ved hjælp af dets absorbans ved 280 nm27. TGA-metoden har yderligere fordele ved mindre strukturelle ændringer, en opløselig form for ligninvurdering, mindre interferens fra ikke-ligninkomponenter og præcis vurdering af lignin på grund af specifik binding med TGA.
Denne TGA-metode ændres på grundlag af den type plantebiomasseprøve, der anvendes til skøn over ligninindholdet. Her ændrede og tilpassede vi den hurtige TGA-metode med risstrå27 til bomuldsvæv for at estimere ligninindholdet. Kort sagt blev de tørrede pulveriserede planteprøver udsat for proteinopløselighedsbuffer og methanolekstraktion for at fjerne proteiner og alkoholopløselig fraktion. Alkoholuopløselige rester blev behandlet med TGA og udfældet lignin under sure forhold. En lignin standardkurve blev genereret ved hjælp af kommerciel bambus lignin og en regressionslinje (y = mx +c) blev opnået. Værdien "x" anvender gennemsnitlige absorbansværdier for lignin ved 280 nm, mens der er indtastet "m" og "c"-værdier fra regressionslinjen for at beregne ukendt ligninkoncentration i prøver af biomasse af bomuldsanlæg. Denne metode er opdelt i fem faser: 1) fremstilling af planteprøver; 2) vask af prøverne med vand og methanol 3) behandling af pellet med TGA og syre til at udfælde lignin; 4) udfældning af lignin; og 5) standardkurveforberedelse og estimering af ligninindholdet af prøven. De to første faser er primært fokuseret på plantematerialepræparatet efterfulgt af vand, PSB (proteinopløselighedsbuffer) og methanolekstraktioner for at opnå alkoholuopløseligt materiale. Derefter blev det behandlet med TGA (thioglycolic syre) og HCl til at danne et kompleks med lignin i tredje fase. I slutningen blev HCl brugt til at udfælde lignin, som blev opløst i natriumhydroxid for at måle dets absorbans ved 280 nm28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioSpectrophotometer kinetic</td>
			<td>Eppendorf kinetic</td>
			<td>6136000010</td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifuging&#160; samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial bamboo lignin</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>1002171289</td>
			<td>Used in the preparation of the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>16690382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>Containers for solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For fine grinding of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ Thermal mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For temperature controlled steps during lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate stirrer</td>
			<td>Walter</td>
			<td>WP1007-HS</td>
			<td>Used for preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221677</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>For thorough drying of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring scale</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (100 %)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Z628034-500EA</td>
			<td>Containers for extraction of lignin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant biomass gerinder</td>
			<td>Hanchen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Used for crushing dried samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AE150</td>
			<td>Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator/oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid (TGA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>68-11-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Used for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3340001</td>
			<td>For proper mixing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)

Lignin er en naturlig polymer, der er den næstmest rigelige polymer på Jorden efter cellulose. Lignin er hovedsageligt deponeret i plante sekundære cellevægge og er en aromatisk heteropolymer primært består af tre monolignoler med betydelig industriel betydning. Lignin spiller en vigtig rolle i plantevækst og -udvikling, beskytter mod biotiske og abiotiske belastninger og i kvaliteten af dyrefoder, træ og industrielle ligninprodukter. Et nøjagtigt skøn over ligninindholdet er afgørende for både den grundlæggende forståelse af ligninbiosyntesen og industriel anvendelse af biomasse. Thioglycolic acid (TGA)-metoden er en yderst pålidelig metode til vurdering af det samlede ligninindhold i plantebiomassen. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne dide med benzylalkoholgrupperne af lignin, som er opløselige under alkaliske forhold og uopløselige under sure forhold. Det samlede ligninindhold anslås ved hjælp af en standardkurve genereret fra kommerciel bambus lignin.

To forskellige bomuldsforsøgslinjer blev sammenlignet for forskelle i deres ligninindhold i forskellige væv. Indholdet af den udvundne lignin i hver prøve blev målt ved 280 nm og registreret dens respektive absorbansværdier. De gennemsnitlige absorbansværdier for hver biologisk replikat blev sammenlignet med regressionslinjen i ligninstandardkurven (tabel 2, figur 3C). Regressionslinjen, y = mx + c, anvendes til at beregne det ukendte ligninindhold i de udvundne forsø...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Her præsenterer vi en modificeret TGA-metode til vurdering af ligninindholdet i urteagtig plantebiomasse. Denne metode anslår ligninindholdet ved at danne specifikke tredistre obligationer med lignin og giver en fordel i forhold til Klason-metoden, da den kræver en relativt lille stikprøve til skøn over ligninindholdet.

Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Lignin er en kompleks heteropolymer bestående af tre monolignoler. Det er den næstmest rigelige polymer på jorden ved siden af cellulose. Her demonstrerer vi thioglykolsyremetoden, som er den mest pålidelige metode til vurdering af ligninindhold.Denne metode er baseret på princippet om, at lignin binder sig til thioglykolsyre gennem didbindinger. Desuden opdelte vi denne protokol i fem faser. I den første fase forbereder vi plantematerialet.I anden fase isolerer vi alkoholopløselige ekstrakt. I tredje fase udfælder vi lignin ved hjælp af thioglycolic syre og sure forhold. I fjerde fase forbereder vi lignin standardkurve ved hjælp af industriel bambus lignin.Endelig anslår vi i femte fase ligninindholdet ved hjælp af den standardkurve, der er udarbejdet i fjerde fase. Plantemateriale indsamles, vendes potterne for at adskille rødderne, vaskes dem grundigt i vand, lufttørres i to dage, overføres dem til mærkede beholdere og inkuberes dem i inkubatoren ved 49 grader celsius i en uge til 10 dage. Ved hjælp af en saks skæres vævet yderligere i 1 mm til 3 mm størrelse stykker.Alternativt anvendes biomassekværn til at knuse plantevævet. Brug rodvævet Tænd biomassekværnen opsamles det knuste pulver i formærkede beholdere. Tilsvarende gentages for stængelvævet og bladvævet.Det knuste pulver læsses i slibevasen, som derefter placeres i frysemøllen og kører frysemøllen med en hastighed på 10 CP-hastighed i tre cyklusser. Veje 20 mg af jorden væv pulver og overføre til en pre lavet 2ml rør. Noter det tomme rør og røret med vævspulver og vævspulver i din laboratorienotesbog.Inkuber rørene med hætte åben ved 60 grader celsius i en time. Efter inkubation tilsættes 1,8 ml vand til hver prøvehvirvelcentrifuge ved 15.000 omdrejninger i 10 minutter. Supernatanten kasseres Tilsættes 1,8 ml methanol.Vortex og inkuber i en forvarmet 60 grader celsius blok i 20 minutter Efter inkubation centrifuge ved 15.000 RPM i 10 minutter. Gentag dette trin endnu en gang. Efter centrifugering kasseres supernatanten og pellets i vakuumtørreren tørres i to til tre timer, eller indtil pallen er helt tør.Mål og registrer vægten af hvert rør i din laboratorienotesbog til vurdering af ligninindhold i slutningen. Også omfatte positiv kontrol industrielle bambus lignin på dette punkt starter fra 0,5 mg til 4 mg i stativer. Der tilsættes 1 ml 3 normal saltsyre sammen med hundrede mikroliter glykolsyre til hver prøve Vortex og inkuberes ved 80 grader celsius i 3 timer.Efter 3 timers inkubation overføres dem til et stativ og lad det køle af i 10 minutter. derefter centrifuge ved 15.000 omdrejninger i 10 minutter. Efter centrifugering ser farven på opløsningen sådan ud.Kassér supernatanten. Tilsæt 1 ml vand. Vortex Centrifuge ved 15.000 omdrejninger i 10 minutter.Kassér supernatanten. Der tilsættes 1 ml 1 normal natriumhydroxid. Vortex og inkubere ved 37 grader celsius shaker natten.Efter natten inkubation centrifuge rørene ved 15.000 RPM i 10 minutter. De supernatant friske formærkede 2 ml rør tilsættes 200 mikroliter koncentreret saltsyre til supernatanten. Bland dem ved blid inversion som vist her.Inkuber dem i køleskabet ved 4 grader celsius natten over. Efter inkubation centrifuge ved 15, 000 RPM i 10 minutter. Kassér supernatanten.Der tilsættes 1 ml natriumhydroxid. Hvirvel og inkuber i shakeren ved stuetemperatur i 10 til 15 minutter. Brug spektrofotometer til at indsamle absorbansaflæsningerne 280 nanometer, Tag 2 mikroliter natriumhydroxid som blank, da den udfældede lignin opløses i natriumhydroxid.Gør feltet tomt til nul. På samme måde gentages for prøverne. Brug to mikroliter af hver prøve til at indsamle absorbansaflæsningerne i din bærbare laboratorienotesbog.Tag tre aflæsninger for hver prøve for tre tekniske replikater. I den første kolonne har vi prøvenummeret. I den anden kolonne har vi biologiske replikater, hvor R1, R2, R3 repræsenterer tre biologiske replikater af en eksperimentel linje.I tredje kolonne har vi i gennemsnit opnået absorbansaflæsningerne ved 280 nanometer. Vi beregnede ligninindholdet i fjerde kolonne ved hjælp af formlen y=mx-c, hvor x er den gennemsnitlige OD.m og c-værdier afbildes fra regressionslinjen i den forberedte standardkurve. Femte kolonne er vægten efter methanol og vand vasker.Så det er den måde, der bruges til vurdering af ligninindholdet i mg. Vi deler således den værdi, der er opnået i fjerde kolonne, med femte kolonne for at opnå værdien pr. mg ligninindhold i sjette kolonne. Og denne værdi ganges med 1000 for at opnå per gram cellevæg vægt.Og procent ligninindholdet beregnes ved at dividere denne værdi med 1000 og gange med 100. Endelig opnår vi den gennemsnitlige lignin ved at beregne gennemsnittet af ligninen af tre biologiske replikater af hver forsøgslinje, som vil blive sammenlignet med gennemsnittet af en anden forsøgslinje i form af en søjlegraf for at forstå forskellene i ligninindholdet. Vi kan også anvende studerende t-test til at teste deres niveau af betydning.I kolonne A har vi kommercielle bambus lignin, og derefter vægten af bambus lignin, der blev taget før TGA og deres respektive absorbans aflæsninger på 280 nanometer. Disse værdier i tabel A blev brugt til at afbilde en spredt graf i kolonne B, hvilket giver os regressionslinjen med m- og c-værdier. I C sammenlignede vi de opnåede værdier ved hjælp af standardkurven, og den industrielle bambus lignin eksperimentelle linje et og to blev sammenlignet i form af en søjlegraf, og resultatet er, at de viser forskel på hinanden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Kombination af Raman Imaging og Multivariate Analysis til Visualisering af Lignin, Cellulose og Hemicellulose i Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høj overførselshastighed, absolut bestemmelse af indholdet af en markeret Protein i væv niveauer ved hjælp af kvantitative Dot duppes analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestemmelse af Phycobiliprotein indhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensning af grønkorn Translocon Protein komplekser ved hjælp af tryk på Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Ved hjælp af højt indhold Imaging for at kvantificere mål Engagement i vedhængende celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identificering af amino syre-over producenter ved hjælp af sjældne-codon-rige markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...