Name: estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

אנו מודים למחלקה למדעי הקרקע והכותנה בע"מ על תמיכתם החלקית במחקר זה.

1. הכנת דגימות צמחים
<ol><li>אספו מהחממה צמחי כותנה בני חודשיים (איור 1A).</li>
	<li>הופכים את עציצי הצמח בעדינות כדי להפריד בין אדמה לשורשים עם שורשים לרוחב שלמים על ידי שחרור האדמה סביב הצמח(איור 1B).</li>
	<li>שטפו את הצמחים שנאספו ביסודיות במגשים מלאים במים כדי להסיר א?...

<ol>
	<li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).</li><li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+utilization:+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects.">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li><li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization:+Toward+New+Platform+Chemicals.">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li><li>Xu, F., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).</li><li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins:+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants.">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).</li><li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots.">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li><li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants.">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li><li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+engineering.">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin.">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).</li><li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).</li><li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins:+a+comparative+characterisation+study.">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li><li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples.">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li><li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+biomass+through+lignin+modification.">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li><li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+lignin+structure,+pretreatments,+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential.">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li><li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Lignin+Be+Accurately+Measured.">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li><li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations.">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li><li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy.">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li><li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry.">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li><li>Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Determination+of+Lignin.">The Determination of Lignin.</a> Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry-past,+present+and+future.">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins.">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+Depolymerization+and+Conversion:+A+Review+of+Thermochemical+Methods.">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering &amp; Technology. 34, 29-41 (2011).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acetyl+bromide+method+is+faster,+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods.">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants:+Some+Cautionary+Notes.">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice.">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li><li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+:+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products.">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li><li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin.">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li><li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin:+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component.">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).</li><li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Industrial+Applications+of+Lignin:+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials.">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li><li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids.">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).</li><li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts.">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue.">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins.">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster,+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods.">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems.">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li><li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice,+Sorghum,+and+Sugar+Vane.">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).</li></ol>

ליגנין ממלא תפקיד משמעותי בצמיחה ופיתוח של צמחים ולאחרונה נחקר בהרחבה עבור יישומי דלק ביולוגי, ביו-אלרגיה וביו-פרוצרציה. ליגנין עשיר בתרכובות ארומטיות המאוחסנות בכל קירות התא המשני של צמח כלי הדם. יש לו מספר יישומים תעשייתיים כגון מוצרי לוח עץ, פיזור ביו, flocculants, קצף פוליאוריתן בשרפים של ל?...

ליגנין הוא אחד המרכיבים החיוניים לשאת עומס של קירות תא הצמח ואת הפולימר השני הנפוץ ביותר על פני כדור הארץ1. מבחינה כימית, ליגנין הוא הטרופולימר מקושר המורכב מתרכובות פנוליות מורכבות משקל מולקולרי גבוה היוצרות מקור מתחדש טבעי של פולימרים ארומטיים וסינתזה של ביו-חומרים2,3. פולימר טבעי זה ממלא תפקידים משמעותיים בצמיחת הצמח, פיתוח, הישרדות, תמיכה מכנית, קשיחות דופן התא, הובלת מים, הובלת מינרלים, עמידות ללינה, פיתוח רקמות ואיברים, תצהיר אנרגיה והגנה מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים4,5,6,7. ליגנין מורכב בעיקר משלושה מונוליגנולים שונים: מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl הנגזרים ממסלול פניל פרופנואיד8,9. כמות ליגנין ואת הרכב של מונומרים להשתנות בהתאם למין הצמח, סוג הרקמה / איבר, ושלבים שונים של התפתחות הצמח10. ליגנין מסווג באופן נרחב לעץ רך, עץ קשה, ודשא ליגנין מבוסס על הרכב המקור מונוליניול. עץ רך מורכב בעיקר מ-95% אלכוהול מחטני עם 4% p-coumaryl ו-1% אלכוהול סינפיל. בעץ יש אלכוהול מחט וסינפיל בפרופורציות שוות, ואילו ליגנין דשא מורכב מממדים שונים של מחט, סינפיל ואלכוהול p-coumaryl11,12. ההרכב של מונומרים הוא קריטי כפי שהוא קובע את כוח ליגנין, פירוק, השפלה של דופן התא, כמו גם קביעת מבנה מולקולרי, הסתעפות, הצלבה עם פוליסכרידים אחרים13,14.
מחקר ליגנין הוא צובר חשיבות ליקוט, תעשיות טקסטיל, תעשיות נייר, עבור bioethanol, דלק ביולוגי, ביו מוצרים בשל עלות נמוכה שלה שפע גבוה15,16. שיטות כימיות שונות (למשל, אצטיל ברומיד, חומרי ניקוי חומצה, קלסון, חמצון פרמנגנט) יחד עם שיטות אינסטרומנטליות (למשל, ליד אינפרא אדום (NIR) ספקטרוסקופיה, תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, ו ספקטרופוטומיה אולטרה סגולה (UV) שימשו לכימות ליגנין9,17. שיטות הניתוח של ליגנין מסווגות בדרך כלל בהתבסס על קרינה אלקטרומגנטית, כבידה, ומסיסות. העיקרון מאחורי הערכת ליגנין על ידי קרינה אלקטרומגנטית התבסס על המאפיין הכימי של ליגנין שבאמצעותו הוא סופג אור באורכי גל ספציפיים. תוצאות אלו הוערכו בהתבסס על העיקרון כי ליגנין יש ספיגת UV חזקה יותר מאשר פחמימות. בשנת 1962, בולקר וסומרוויל השתמשו כדורי אשלגן כלורי כדי להעריך את תכולת ליגנין בעץ18. עם זאת, שיטה זו יש חסרונות בהערכת תוכן ליגנין מדגימות עשבוניות בשל נוכחותם של תרכובות פנוליות שאינן ליגנין והיעדר מקדם הכחדה מתאים. בשנת 1970, פרגוס וגרינג מצאו כי גואיאצ'יל ומתחם סירינגיל ספיגת מקסימום היו ב 280 ננומטר ו 270 ננומטר, אשר תיקן את נושא מקדם ההכחדה של שיטת בולקר וסומרוויל19. מאוחר יותר, ספקטרוסקופיית אינפרא אדום, טכניקה רגישה מאוד לאפיון פנולים, שימש גם להערכת ליגנין עם כמות קטנה של דגימות ביומסה צמחית. דוגמה אחת לטכנולוגיה כזו הייתה ספקטרופוטומיית שינוי פורייה מפוזרת. שיטה זו, לעומת זאת, חסר תקן מתאים דומה לשיטת UV20. מאוחר יותר, התוכן ליגנין הוערך על ידי NIRS (ליד ספקטרוסקופיה אינפרא אדום) ו NMR (ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית). אמנם, ישנם חסרונות בשיטות אלה, הם לא משנים את המבנה הכימי של ליגנין, שמירה עלטוהר שלה 20.
שיטת קלאסון הכבידתית היא שיטה אנליטית ישירה ואמינה ביותר להערכת ליגנין של גבעולים עציים. הבסיס להערכת ליגנין כבידתי הוא הידרוליזה / solubilization של תרכובות שאינן ליגנין ואוסף של ליגנין מסיסים עבור gravimetry21. בשיטה זו, הפחמימות מוסרות על ידי הידרוליזה של ביומסה עם מרוכז H2SO4 כדי לחלץ שאריות ליגנין20,22. תכולת הינין המוערכת בשיטה זו ידועה בשם ליגנין בלתי מסיס חומצי או ליגנין קלסון. היישום של שיטת קלסון תלוי במיני הצמחים, בסוג הרקמה ובסוג דופן התא. נוכחות של כמויות משתנות של רכיבים שאינם ליגנין כגון טאנינים, פוליסכרידים וחלבונים, גורמת להבדלים פרופורציונליים בהערכת תכולת ליגנין מסיס/מסיס בחומצה. לפיכך, שיטת קלסון מומלץ רק להערכת ליגנין של ביומסה תוכן ליגנין גבוהה כגון גבעולים וודי17,23. שיטות מסיסות כגון אצטיל ברומיד (AcBr), ליגנין מסיס בחומצה, וחומצה תיוגליקולית (TGA) הן השיטות הנפוצות ביותר להערכת תכולת הליגנין ממקורות ביומסה צמחיים שונים. קים ואח ' הקימו שתי שיטות להפקת ליגנין על ידי solubilization. השיטה הראשונה מחלצת ליגנין כשאריות בלתי מסיסות על ידי תאית solubilizing ו hemicellulose, בעוד השיטה השנייה מפרידה ליגנין בשבר מסיס, משאיר תאית hemicellulose כמו שאריותמסיסים 24.
שיטות דומות המשמשות להערכת ליגנין המבוססות על המסיסות הן חומצה תיוגליקולית (TGA) ושיטות אצטיל ברומיד (AcBr)25. שתי שיטות TGA ואצטיל ברומיד להעריך את התוכן ליגנין על ידי מדידת הספיגה של ליגנין solubilized ב 280 ננומטר; עם זאת, שיטת AcBr משפילה xylans במהלך תהליך של ליגנין solubilization ומראה עלייה כוזבת בתוכן ליגנין26. שיטת thioglycolate (TGA) היא השיטה האמינה יותר, שכן היא תלויה מליטה ספציפית עם קבוצות thioether של קבוצות אלכוהול בנזיל של ליגנין עם TGA. ליגנין TGA מאוגד הוא זירז בתנאים חומציים באמצעות HCl, ואת התוכן ליגנין מוערך באמצעות ספיגה שלה ב 280 ננומטר27. לשיטת TGA יתרונות נוספים של פחות שינויים מבניים, צורה מסיסת של הערכת ליגנין, פחות הפרעות מרכיבים שאינם ליגנין, והערכת ליגנין מדויקת עקב מליטה ספציפית עם TGA.
שיטת TGA זו משתנה בהתבסס על סוג של מדגם ביומסה צמח המשמש להערכת תוכן ליגנין. כאן, שינינו והתאמנו את שיטת TGA המהירה של קשיות אורז27 לרקמות כותנה כדי להעריך את תכולת הליגינין. בקצרה, דגימות הצמח אבקת מיובשים היו נתונים מאגר solubilization חלבון מיצוי מתנול כדי להסיר חלבונים ואת החלק מסיס אלכוהול. שאריות אלכוהול מסיסות טופלו עם TGA ו lignin מזורז בתנאים חומציים. עקומת תקן ליגנין נוצרה באמצעות ליגנין במבוק מסחרי וקו רגרסיה (y = mx +c) הושג. הערך "x" משתמש בערכי ספיגה ממוצעים של ליגנין ב- 280 ננומטר, בעוד שערכי "m" ו- "c" הוזנו מקו הרגרסיה כדי לחשב ריכוז ליגנין לא ידוע בדגימות ביומסה של צמח כותנה. שיטה זו מחולקת לחמישה שלבים: 1) הכנת דגימות צמחים; 2) לשטוף את הדגימות עם מים ומתנול; 3) טיפול של גלולה עם TGA וחומצה כדי לזרז ליגנין; 4) משקעים של ליגנין; ו -5) הכנת העקומה הסטנדרטית והערכת תוכן ליגנין של המדגם. שני השלבים הראשונים מתמקדים בעיקר בהכנת חומר צמחי ואחריו מים, PSB (חיץ סולוביליזציה של חלבונים) ועקירות מתנול כדי להשיג את החומר מסיס באלכוהול. לאחר מכן, הוא טופל עם TGA (חומצה תיוגליקולית) ו HCl כדי ליצור קומפלקס עם ליגנין בשלב השלישי. בסוף, HCl שימש לזרז ליגנין, אשר מומס נתרן הידרוקסיד כדי למדוד את ספיגתו ב 280 ננומטר28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioSpectrophotometer kinetic</td>
			<td>Eppendorf kinetic</td>
			<td>6136000010</td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifuging&#160; samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial bamboo lignin</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>1002171289</td>
			<td>Used in the preparation of the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>16690382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>Containers for solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For fine grinding of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ Thermal mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For temperature controlled steps during lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate stirrer</td>
			<td>Walter</td>
			<td>WP1007-HS</td>
			<td>Used for preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221677</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>For thorough drying of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring scale</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (100 %)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Z628034-500EA</td>
			<td>Containers for extraction of lignin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant biomass gerinder</td>
			<td>Hanchen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Used for crushing dried samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AE150</td>
			<td>Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator/oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid (TGA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>68-11-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Used for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3340001</td>
			<td>For proper mixing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)

ליגנין הוא פולימר טבעי שהוא הפולימר השני בשכיחותו על פני כדור הארץ לאחר תאית. ליגנין מופקד בעיקר בקירות תאים משניים צמחיים והוא הטרופולימר ארומטי המורכב בעיקר משלושה מונוליגנולים בעלי חשיבות תעשייתית משמעותית. ליגנין ממלא תפקיד חשוב בצמיחה והתפתחות של צמחים, מגן מפני לחצים ביוטיים ואביוטיים, ובאיכות מספוא לבעלי חיים, עץ ומוצרי ליגנין תעשייתיים. הערכה מדויקת של תוכן ליגנין חיונית הן להבנה בסיסית של הביוסינתזה של ליגנין והן ליישומים תעשייתיים של ביומסה. שיטת החומצה התיוגליקולית (TGA) היא שיטה אמינה ביותר להערכת תכולת הליגנין הכוללת בביומסה הצמחית. שיטה זו מעריכה את התוכן ליגנין על ידי יצירת thioethers עם קבוצות אלכוהול בנזיל של ליגנין, אשר מסיסים בתנאים אלקליין בלתי מסיס בתנאים חומציים. תוכן ליגנין הכולל מוערך באמצעות עקומה סטנדרטית שנוצרה מלינין במבוק מסחרי.

שני קווים ניסיוניים שונים כותנה הושוו להבדלים בתכולת הינין שלהם ברקמות שונות. תכולת הליגינין שחולצה מכל מדגם נמדדה ב-280 ננומטר ורשמה את ערכי הספיגה המתאימים לה. ערכי הספיגה הממוצעים של כל משכפל ביולוגי הושוו לקו הרגרסיה של עקומת תקן ליגנין(טבלה 2, איור 3C). קו הרגרסי...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

כאן, אנו מציגים שיטת TGA שונה להערכת תוכן ליגנין בביומסה צמחית עשבוני. שיטה זו מעריכה את תוכן ה-lignin על ידי יצירת קשרים תיותרים ספציפיים עם ליגנין ומציגה יתרון על פני שיטת קלסון, שכן היא דורשת מדגם קטן יחסית להערכת תוכן ליגנין.

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

ליגנין הוא הטרופולימר מורכב המורכב משלושה מונוליגנולים. זהו הפולימר השני בשכיחותו על פני כדור הארץ ליד תאית. כאן, אנו מדגימים שיטת חומצה תיוגליקולית, שהיא השיטה האמינה ביותר להערכת תוכן ליגנין.שיטה זו מבוססת על העיקרון כי ליגנין נקשר חומצה תיוגליקולית באמצעות קשרים thioether. יתר על כן, חילקנו את הפרוטוקול הזה לחמישה שלבים. בשלב הראשון, אנו מכינים את החומר הצמחי.בשלב השני, אנו מבודדים את תמצית אלכוהול בלתי מסיס. בשלב השלישי, אנו לזרז ליגנין באמצעות חומצה תיוגליקולית ומצבים חומציים. בשלב הרביעי, אנו מכינים עקומה סטנדרטית ליגנין באמצעות ליגנין במבוק תעשייתי.לבסוף, בשלב החמישי, אנו מעריכים את תוכן ליגינין באמצעות העקומה הסטנדרטית שהוכנה בשלב הרביעי. החומר הצמחי נאסף, הפך את הסירים כדי להפריד את השורשים, שטף אותם ביסודיות במים, האוויר התייבש במשך יומיים, העביר אותם למיכלים מסומנים והדגיר אותם באינקובטור ב 49 מעלות צלזיוס במשך שבוע עד 10 ימים. באמצעות מספריים, הרקמה נחתכת עוד יותר לחתיכות בגודל 1 מ"מ עד 3 מ"מ.לחלופין, מטחנת ביומסה משמשת לריסוק רקמות הצמח. השתמש ברקמת השורש הפעל את מטחנת ביומסה לאסוף את האבקה כתוש לתוך מיכלים שכותרתו מראש. באופן דומה, חזור על רקמת הגזע ורקמת העלה.האבקה המרוסקת נטענת לתוך אגרטל השחיקה אשר ממוקמים לאחר מכן בטחנת המקפיא ולהפעיל את טחנת המקפיא בקצב של 10 CP מהירות במשך שלושה מחזורים. שוקלים 20 מ"ג של אבקת רקמת הקרקע ומעבירים לצינור 2 מ"ל עשוי מראש. רשום לעצמך את הצינור הריק ואת הצינור עם אבקת הרקמות ואבקת הרקמות במחברת המעבדה שלך.דגירה הצינורות עם כובע פתוח ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, מוסיפים 1.8 מ"ל מים לכל צנטריפוגת מערבולת מדגם ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. השלך את supernatant הוסף 1.8 מ"ל של מתנול.וורטקס ודגרת בבלוק 60 מעלות צנטריגרד שחומם מראש למשך 20 דקות לאחר דגירה צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. חזור על שלב זה פעם נוספת. לאחר צנטריפוגה להשליך את supernatant ולייבש את כדורי במייבש ואקום במשך שעתיים עד שלוש שעות או עד המשטח יבש לחלוטין.למדוד ולתעד את המשקל של כל צינור במחברת המעבדה שלך להערכת תוכן ליגנין בסוף. כוללים גם שליטה חיובית תעשייתי במבוק ליגנין בשלב זה החל מ 0.5 מ"ג ל 4 מ"ג טריפליקטים. הוסף 1 מ"ל של 3 חומצה הידרוכלורית נורמלית, יחד עם מאה מיקרוליטרים של חומצה גליקולית לכל מדגם וורטקס ודגירה ב 80 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.לאחר 3 שעות הדגירה להעביר אותם למתלה ולאפשר לו להתקרר במשך 10 דקות. ואז צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, צבע הפתרון נראה כך.השלך את הסופרנט. מוסיפים 1 מ"ל מים. מערבולת צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות.השלך את הסופרנט. יש להוסיף 1 מ"ל של נתרן הידרוקסידי רגיל אחד. וורטקס ודגרת ב 37 מעלות צלזיוס שייקר לילה.לאחר דגירה לילה צנטריפוגה הצינורות ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. מעבירים את צינורות ה-2 מ"ל הטריים והטריים מוסיפים 200 מיקרוליטרים של חומצה הידרוכלורית מרוכזת לסופרנאטנט. מערבבים אותם על ידי היפוך עדין כפי שמוצג כאן.דגירה אותם במקרר ב 4 מעלות צלזיוס לילה. לאחר דגירה צנטריפוגה ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות. השלך את הסופרנט.מוסיפים 1 מ"ל נתרן הידרוקסידי. וורטקס ודגרת בשייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 15 דקות. השתמש ספקטרופוטומטר כדי לאסוף את קריאות הספיגה 280 ננומטר, לקחת 2 מיקרוליטרים של נתרן הידרוקסיד כמו ריק מאז lignin זירז מומס נתרן הידרוקסיד.הפוך את הריק לאפס. באופן דומה, חזור על הדגימות. השתמש בשני מיקרוליטרים של כל דגימה כדי לאסוף את קריאות הספיגה במחברת המעבדה שלך.קח שלוש קריאות עבור כל מדגם עבור שלושה משכפלים טכניים. בעמודה הראשונה, יש לנו את מספר הדגימה. בעמודה השנייה, יש לנו משכפלים ביולוגיים שבהם R1, R2, R3 מייצגים שלושה משכפלים ביולוגיים של קו ניסיוני אחד.בעמודה השלישית, ממוצע קריאות הספיגה שהושגו ב 280 ננומטר. חישבנו את תוכן ה- lignin בעמודה הרביעית באמצעות הנוסחה y=mx-c כאשר x הוא ערך ה- OD.m ו- c הממוצע מותווים מקו הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית שהוכנה. הגיס החמישי הוא המשקל לאחר שהמתנול והמים שוטפים.אז זו הדרך המשמשת להערכת תוכן ליגנין ב- mg. אז אנחנו מחלקים את הערך שהושג בעמודה הרביעית על ידי העמודה החמישית כדי לקבל את הערך לכל מ"ג של תוכן ליגינין בעמודה השישית. וערך זה מוכפל ב- 1000 כדי להשיג לכל גרם משקל קיר תא.ואחוז התוכן lignin מחושב על ידי חלוקת ערך זה על ידי 1000 והכפלה על ידי 100. לבסוף, אנו משיגים את הלינגינין הממוצע על ידי ממוצע ליגנין של שלושה משכפלים ביולוגיים של כל קו ניסיוני אשר יושוו לממוצע של קו ניסיוני אחר בצורה של גרף בר כדי להבין את ההבדלים בתוכן הignin. אנחנו יכולים גם ליישם מבחן t של תלמידים כדי לבחון את רמת המשמעות שלהם.בטור א', יש לנו ליגנין במבוק מסחרי, ואז המשקל של ליגנין הבמבוק שנלקח לפני TGA וקריאות הספיגה שלהם בהתאמה ב 280 ננומטר. ערכים אלה בטבלה א' שימשו להתווית גרף מפוזר בעמודה B, המעניק לנו את קו הרגרסיה בערכי m ו- c. ב- C, השווינו את הערכים שהושגו באמצעות העקומה הסטנדרטית ואת קו הניסוי התעשייתי במבוק ליגנין אחד ושתיים הושוו בצורה של גרף עמודות והתוצאה היא שהם מראים הבדל בין אחד לשני.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

זיקה טיהור של מתחמי חלבון Translocon כלורופלסט בעזרת התג ברז

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

זיהוי חומצת אמינו מפיקי יתר באמצעות נדירים-Codon-מסמנים עשירים

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...