Name: estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Vi takker Institutt for plante- og jordvitenskap og bomull inc. for deres delvise støtte til denne studien.

1. Utarbeidelse av planteprøver
<ol><li>Samle to måneder gamle bomullsplanter fra drivhuset (Figur 1A).</li>
	<li>Vend plantepottene forsiktig for å skille jord og røtter med intakte laterale røtter ved å løsne jorda rundt planten (Figur 1B).</li>
	<li>Vask de oppsamlede plantene grundig i skuffer fylt med vann for å fjerne alt smuss (for rotprøver) (Figur 1C).</li>
	<li>Bruk papirhåndklær til å tørke separert rot-, s...

<ol>
	<li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).</li><li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+utilization:+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects.">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li><li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization:+Toward+New+Platform+Chemicals.">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li><li>Xu, F., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).</li><li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins:+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants.">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).</li><li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots.">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li><li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants.">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li><li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+engineering.">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin.">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).</li><li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).</li><li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins:+a+comparative+characterisation+study.">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li><li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples.">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li><li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+biomass+through+lignin+modification.">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li><li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+lignin+structure,+pretreatments,+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential.">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li><li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Lignin+Be+Accurately+Measured.">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li><li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations.">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li><li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy.">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li><li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry.">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li><li>Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Determination+of+Lignin.">The Determination of Lignin.</a> Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry-past,+present+and+future.">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins.">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+Depolymerization+and+Conversion:+A+Review+of+Thermochemical+Methods.">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering &amp; Technology. 34, 29-41 (2011).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acetyl+bromide+method+is+faster,+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods.">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants:+Some+Cautionary+Notes.">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice.">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li><li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+:+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products.">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li><li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin.">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li><li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin:+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component.">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).</li><li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Industrial+Applications+of+Lignin:+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials.">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li><li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids.">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).</li><li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts.">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue.">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins.">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster,+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods.">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems.">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li><li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice,+Sorghum,+and+Sugar+Vane.">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).</li></ol>

Lignin spiller en betydelig rolle i plantevekst og utvikling og har nylig blitt grundig studert for biodrivstoff, bioenergi og bioproduktapplikasjoner. Lignin er rik på aromatiske forbindelser som er lagret i alle vaskulære plante sekundærcellevegger. Den har flere industrielle applikasjoner som trepanelprodukter, biodispergeringsmidler, flocculants, polyuretanskum og i harpikser av kretskort29,30,31. Det meste av lignin gene...

Lignin er en av de vitale bærende komponentene i plantecellevegger og den nest mest tallrike polymeren på jorden1. Kjemisk er lignin en krysskoblet heteropolymer som består av komplekse fenolforbindelser med høy molekylvekt som danner en naturlig fornybar kilde til aromatiske polymerer og syntese av biomaterialer2,3. Denne naturlige polymeren spiller betydelige roller i plantevekst, utvikling, overlevelse, mekanisk støtte, celleveggstivhet, vanntransport, mineraltransport, losjimotstand, vevs- og organutvikling, avsetning av energi og beskyttelse mot biotiske og abiotiske påkjenninger4,5,6,7. Lignin består hovedsakelig av tre forskjellige monolignoler: nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer som er avledet fra fenylpropanoidveien8,9. Mengden lignin og sammensetningen av monomerer varierer basert på plantearter, vev / organtype og forskjellige stadier av planteutvikling10. Lignin er bredt klassifisert i mykt tre, hardved og gress lignin basert på kilden og monolignolsammensetningen. Mykved består hovedsakelig av 95% nåletylalkohol med 4% p-coumaryl og 1% sinapylalkoholer. Hardved har nåletyl- og sinapylalkoholer i like store mengder, mens gress lignin består av ulike proporsjoner av nåletyl, sinapyl og p-coumarylalkoholer11,12. Sammensetningen av monomerer er kritisk da den bestemmer ligninstyrken, nedbrytningen og nedbrytningen av celleveggen, samt bestemmer molekylær struktur, forgrening og krysskobling med andre polysakkarider13,14.
Lignin forskning får betydning i foraging, tekstilindustrien, papirindustrien, og for bioetanol, biodrivstoff og bio-produkter på grunn av sin lave pris og høye overflod15,16. Ulike kjemiske metoder (f.eks. acetylkymid, syrevaskemidler, Klason og permanganatoksidasjon) sammen med instrumentelle metoder (f.eks. nær infrarød (NIR) spektroskopi, kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og ultrafiolett (UV) spektrofotometri) ble brukt til lignin kvantifisering9,17. Analysemetodene for lignin er generelt klassifisert basert på elektromagnetisk stråling, gravimetri og løselighet. Prinsippet bak ligninestimering ved elektromagnetisk stråling var basert på lignins kjemiske egenskap der den absorberer lys ved spesifikke bølgelengder. Disse resultatene ble estimert basert på prinsippet om at lignin har en sterkere UV-absorbans enn karbohydrater. I 1962 brukte Bolker og Somerville kaliumkloridpellets for å estimere lignininnhold i tre18. Denne metoden har imidlertid ulemper ved estimering av lignininnhold fra urteaktige prøver på grunn av tilstedeværelsen av ikke-lignin fenolforbindelser og fravær av en passende utryddelseskoeffisient. I 1970 fant Fergus og Goring at guaiacyl og syringyl sammensatt absorpsjon maxima var på 280 nm og 270 nm, noe som korrigerte utryddelseskoeffisientproblemet til Bolker- og Somerville-metoden19. Senere ble infrarød spektroskopi, en svært følsom teknikk for karakterisering av fenolics, også brukt til ligninestimering med en liten mengde plantebiomasseprøver. Et eksempel på slik teknologi var diffus refleks Fourier transform spektrofotometri. Denne metoden mangler imidlertid en riktig standard som ligner på UV-metoden20. Senere ble lignininnholdet estimert av NIRS (nær infrarød spektroskopi) og NMR (kjernemagnetisk resonansspektroskopi). Selv om det er ulemper i disse metodene, endrer de ikke lignins kjemiske struktur, beholder renheten20.
Den gravimetriske Klason-metoden er en direkte og den mest pålitelige analytiske metoden for ligninestimering av treaktige stengler. Grunnlaget for gravimetrisk ligninestimering er hydrolyse/solubilisering av ikke-ligninforbindelser og innsamling av uoppløselig lignin for gravimetri21. I denne metoden fjernes karbohydrater ved hydrolyse av biomassen med konsentrert H2SO4 for å trekke ut ligninrester20,22. Lignininnholdet estimert ved denne metoden er kjent som syre uoppløselig lignin eller Klason lignin. Påføring av Klason-metoden avhenger av plantearter, vevstype og celleveggtype. Tilstedeværelsen av variable mengder ikke-ligninkomponenter som tanniner, polysakkarider og proteiner resulterer i proporsjonale forskjeller i estimering av syre uoppløselig / løselig lignininnhold. Derfor anbefales Klason-metoden bare for lignin-estimering av biomasse med høyt lignininnhold som treaktige stengler17,23. Løselighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syreoppløselig lignin og tioglykolsyre (TGA) er mest brukte metoder for estimering av lignininnholdet fra ulike plantebiomassekilder. Kim et al. etablerte to metoder for ligninutvinning ved solubilisering. Den første metoden trekker ut lignin som en uoppløselig rest ved å løse cellulose og hemicellulose, mens den andre metoden skiller lignin i den oppløselige fraksjonen, og etterlater cellulose og hemicellulose som den uoppløselige rester24.
Lignende metoder som brukes i lignin estimering basert på løselighet er tioglykolsyre (TGA) og acetylkymid (AcBr) metoder25. Både TGA og acetylbromidmetoder estimerer lignininnholdet ved å måle absorbansen av den solubiliserte lignin ved 280 nm; AcBr-metoden forringer imidlertid xylans under prosessen med lignin-solubilisering og viser en falsk økning i lignininnholdet26. Thioglycolate (TGA) metoden er den mer pålitelige metoden, da den avhenger av spesifikk binding med thioethergruppene av benzylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA bundet lignin er utfelt under sure forhold ved hjelp av HCl, og lignin innholdet er estimert ved hjelp av sin absorbans ved 280 nm27. TGA-metoden har ytterligere fordeler med mindre strukturelle modifikasjoner, en løselig form for lignin-estimering, mindre forstyrrelser fra ikke-ligninkomponenter og presis estimering av lignin på grunn av spesifikk binding med TGA.
Denne TGA-metoden er modifisert basert på typen plantebiomasseprøve som brukes til lignininnholdsestimering. Her modifiserte og tilpasset vi den raske TGA-metoden for risstrå27 til bomullsvev for å estimere lignininnholdet. Kort sagt ble de tørkede pulveriserte planteprøvene utsatt for proteinløselighetsbuffer og metanolutvinning for å fjerne proteiner og alkoholløselig brøkdel. De alkoholløselige rester ble behandlet med TGA og utfelt lignin under sure forhold. En lignin standardkurve ble generert ved hjelp av kommersiell bambus lignin og en regresjonslinje (y = mx + c) ble oppnådd. X-verdien bruker gjennomsnittlige absorbansverdier på lignin ved 280 nm, mens "m" og "c" ble angitt fra regresjonslinjen for å beregne ukjent ligninkonsentrasjon i biomasseprøver av bomullsanlegg. Denne metoden er delt inn i fem faser: 1) forberedelse av planteprøver; 2) vasking av prøvene med vann og metanol; 3) behandling av pellets med TGA og syre for å utfelle lignin; 4) nedbør av lignin; og 5) standard kurveforberedelse og lignininnholdsestimering av prøven. De to første fasene er primært fokusert på plantematerialepreparatet etterfulgt av vann, PSB (proteinløselighetsbuffer) og metanolutvinning for å oppnå alkoholløselig materiale. Deretter ble det behandlet med TGA (tioglykolsyre) og HCl for å danne et kompleks med lignin i tredje fase. På slutten ble HCl brukt til å utfelle lignin, som ble oppløst i natriumhydroksid for å måle absorbansen ved 280 nm28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioSpectrophotometer kinetic</td>
			<td>Eppendorf kinetic</td>
			<td>6136000010</td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifuging&#160; samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial bamboo lignin</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>1002171289</td>
			<td>Used in the preparation of the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>16690382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>Containers for solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For fine grinding of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ Thermal mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For temperature controlled steps during lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate stirrer</td>
			<td>Walter</td>
			<td>WP1007-HS</td>
			<td>Used for preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221677</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>For thorough drying of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring scale</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (100 %)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Z628034-500EA</td>
			<td>Containers for extraction of lignin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant biomass gerinder</td>
			<td>Hanchen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Used for crushing dried samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AE150</td>
			<td>Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator/oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid (TGA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>68-11-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Used for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3340001</td>
			<td>For proper mixing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)

Lignin er en naturlig polymer som er den nest mest tallrike polymeren på jorden etter cellulose. Lignin er hovedsakelig avsatt i plantens sekundære cellevegger og er en aromatisk heteropolymer som hovedsakelig består av tre monolignoler med betydelig industriell betydning. Lignin spiller en viktig rolle i plantevekst og utvikling, beskytter mot biotiske og abiotiske påkjenninger, og i kvaliteten på dyrefôr, tre og industrielle ligninprodukter. Nøyaktig estimering av lignininnhold er avgjørende for både grunnleggende forståelse av ligninbiosyntese og industrielle anvendelser av biomasse. Thioglykolsyremetoden (TGA) er en svært pålitelig metode for å estimere det totale lignininnholdet i plantebiomassen. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne tioethers med benzylalkoholgruppene av lignin, som er oppløselige i alkaliske forhold og uoppløselige i sure forhold. Det totale lignininnholdet er estimert ved hjelp av en standardkurve generert fra kommersiell bambus lignin.

To forskjellige eksperimentelle bomullslinjer ble sammenlignet for forskjeller i deres lignininnhold i forskjellige vev. Det ekstraherte lignininnholdet i hver prøve ble målt til 280 nm og registrerte sine respektive absorbansverdier. De gjennomsnittlige absorbansverdiene for hver biologiske replikering ble sammenlignet med regresjonslinjen i lignin-standardkurven (Tabell 2, Figur 3C). Regresjonslinjen, y = mx + c, brukes til å beregne det ukjente lignininnholdet i de eks...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Her presenterer vi en modifisert TGA-metode for estimering av lignininnhold i urteaktig plantebiomasse. Denne metoden estimerer lignininnholdet ved å danne spesifikke thioetherbindinger med lignin og gir en fordel i forhold til Klason-metoden, da det krever et relativt lite utvalg for lignininnholdsestimering.

Estimering av plantebiomasse Lignin-innhold ved bruk av thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Lignin er en kompleks heteropolymer som består av tre monolignoler. Det er den nest mest tallrike polymeren på jorden ved siden av cellulose. Her demonstrerer vi thioglykolsyremetode, som er den mest pålitelige metoden for estimering av lignininnhold.Denne metoden er basert på prinsippet om at lignin binder seg til tioglykolsyre gjennom tioetherbindinger. Videre delte vi denne protokollen i fem faser. I den første fasen forbereder vi plantematerialet.I den andre fasen isolerer vi alkoholen uoppløselig ekstrakt. I tredje fase utfeller vi lignin ved hjelp av tioglykolsyre og sure forhold. I fjerde fase forbereder vi lignin standardkurve ved hjelp av industriell bambus lignin.Til slutt, i femte fase, estimerer vi lignininnholdet ved hjelp av standardkurven utarbeidet i fjerde fase. Plantemateriale samles, vender pottene for å skille røttene, vasket dem grundig i vann, lufttørket i to dager, overførte dem til merkede beholdere og inkuberte dem i inkubatoren ved 49 grader celsius i en uke til 10 dager. Ved hjelp av saks blir vevet ytterligere kuttet i 1 mm til 3 mm størrelse stykker.Alternativt brukes biomassekvern til å knuse plantevevet. Bruk rotvevet Slå på biomassekvernen samle det knuste pulveret i forhåndsmerkede beholdere. På samme måte gjentar du for stammevevet og bladvevet.Det knuste pulveret lastes inn i slipevasen som deretter plasseres i frysefabrikken Og kjør frysefabrikken med en hastighet på 10 CP i tre sykluser. Vei 20 mg av malt vevspulver og overfør til et ferdig laget 2 ml rør. Noter det tomme røret og røret med vevspulver og vevspulveret i lab-notatboken.Inkuber rørene med hetten åpen ved 60 grader celsius i en time. Etter inkubasjon, tilsett 1,8 ml vann til hver prøvevirvel sentrifuge ved 15.000 RPM i 10 minutter. Kast den supernatante Tilsett 1,8 ml metanol.Virvel og inkuber i en forvarmet 60 grader celsius blokk i 20 minutter Etter inkubasjon sentrifuge ved 15,000 RPM i 10 minutter. Gjenta dette trinnet én gang til. Etter sentrifugering kast supernatanten og tørk pelletsene i vakuumtørkeren i to til tre timer eller til pallen er helt tørr.Mål og registrer vekten av hvert rør i lab-notatboken for estimering av lignininnhold på slutten. Inkluder også positiv kontroll industriell bambus lignin på dette tidspunktet starter fra 0,5 mg til 4 mg i triplikater. Tilsett 1 ml 3 normal saltsyre, sammen med hundre mikroliter glykolsyre til hver prøve Vortex og inkuber ved 80 grader celsius i 3 timer.Etter 3 timer overføring av inkubasjon dem til et stativ og la det avkjøles i 10 minutter. sentrifugerer deretter ved 15 000 o/min i 10 minutter. Etter sentrifugering ser fargen på løsningen slik ut.Kast supernatanten. Tilsett 1 ml vann. Vortex Sentrifuge ved 15.000 o/min i 10 minutter.Kast supernatanten. Tilsett 1 ml 1 normalt natriumhydroksid. Virvel og inkuber ved 37 grader celsius shaker over natten.Etter natt inkubasjon sentrifugerer rørene ved 15.000 RPM i 10 minutter. Overfør de supernatante friske forhåndsmerkede 2 ml rørene tilsett 200 mikroliter konsentrert saltsyre til supernatanten. Bland dem med mild inversjon som vist her.Inkuber dem i kjøleskapet ved 4 grader celsius over natten. Etter inkubasjon sentrifuge ved 15,000 RPM i 10 minutter. Kast supernatanten.Tilsett 1 ml natriumhydroksid. Virvel og inkuber i shakeren ved romtemperatur i 10 til 15 minutter. Bruk spektrofotometer for å samle absorbansavlesningene 280 nanometer, Ta 2 mikroliter natriumhydroksid som blankt siden ligninutfeltt er oppløst i natriumhydroksid.Gjør feltet tomt til null. På samme måte gjentar du for prøvene. Bruk to mikroliter av hver prøve for å samle absorbansavlesningene i laboratoriets bærbare PC.Ta tre avlesninger for hver prøve for tre tekniske replikeringer. I den første kolonnen har vi utvalgsnummeret. I den andre kolonnen har vi biologiske kopier der R1, R2, R3 representerer tre biologiske replikeringer av en eksperimentell linje.I den tredje kolonnen gjennomsnittet vi absorbansavlesningene oppnådd ved 280 nanometer. Vi beregnet lignininnholdet i den fjerde kolonnen ved hjelp av formelen y=mx-c der x er den gjennomsnittlige OD.m og c-verdiene er tegnet inn fra regresjonslinjen i standardkurven som er utarbeidet. Femte kolonne er vekten etter metanol og vannvask.Så dette er måten som brukes til estimering av lignininnhold i mg. Så vi deler verdien oppnådd i den fjerde kolonnen med femte kolonne for å få verdien per mg lignininnhold i den sjette kolonnen. Og denne verdien multipliseres med 1000 for å oppnå per gram celleveggvekt.Og innholdet i prosent lignin beregnes ved å dele denne verdien med 1000 og multiplisere med 100. Til slutt oppnår vi den gjennomsnittlige lignin ved å beregne gjennomsnittet av lignin av tre biologiske replikeringer av hver eksperimentelle linje som vil bli sammenlignet med gjennomsnittet av en annen eksperimentell linje i form av en stolpegraf for å forstå forskjellene i lignininnholdet. Vi kan også bruke student t-test for å teste deres betydningsnivå.I kolonne A har vi kommersiell bambus lignin, og deretter vekten av bambus lignin som ble tatt før TGA og deres respektive absorbansavlesninger på 280 nanometer. Disse verdiene i tabell A ble brukt til å tegne inn en spredt graf i kolonne B, noe som gir oss regresjonslinjen med m- og c-verdier. I C sammenlignet vi verdiene oppnådd ved hjelp av standardkurven, og den industrielle bambus lignin eksperimentelle linje en og to ble sammenlignet i form av en stolpegraf, og resultatet er at de viser forskjell mellom hverandre.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Høy throughput screening av karbohydrat-nedbrytende enzymer Bruke Novel Uløselig kromogen substratmetode Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Kombinere Raman Imaging og Multivariate Analysis for å visualisere Lignin, Cellulose og Hemicellulose i Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rensing av Chloroplast Translocon Protein komplekser hjelp av trykk-koden

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identifisere amino acid Overproducers bruke rare-Codon-Rich markører

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måle interaksjoner mellom fluorescerende sonder og lignin i Plant seksjoner av sFLIM basert på Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...