Name: estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Мы благодарим Департамент растениеводства и почвоведения и Cotton Inc. за их частичную поддержку этого исследования.

1. Подготовка образцов растений
<ol><li>Соберите двухмесячные растения хлопчатника из теплицы(Рисунок 1А).</li>
	<li>Аккуратно переверните горшки для растений, чтобы разделить почву и корни с неповрежденными боковыми корнями, рыхляя почву вокруг растения(рисунок 1B)...

<ol>
	<li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).</li><li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+utilization:+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects.">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li><li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization:+Toward+New+Platform+Chemicals.">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li><li>Xu, F., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).</li><li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins:+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants.">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).</li><li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots.">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li><li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants.">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li><li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+engineering.">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin.">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).</li><li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).</li><li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins:+a+comparative+characterisation+study.">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li><li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples.">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li><li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+biomass+through+lignin+modification.">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li><li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+lignin+structure,+pretreatments,+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential.">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li><li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Lignin+Be+Accurately+Measured.">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li><li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations.">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li><li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy.">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li><li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry.">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li><li>Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Determination+of+Lignin.">The Determination of Lignin.</a> Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry-past,+present+and+future.">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins.">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+Depolymerization+and+Conversion:+A+Review+of+Thermochemical+Methods.">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering &amp; Technology. 34, 29-41 (2011).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acetyl+bromide+method+is+faster,+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods.">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants:+Some+Cautionary+Notes.">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice.">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li><li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+:+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products.">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li><li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin.">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li><li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin:+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component.">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).</li><li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Industrial+Applications+of+Lignin:+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials.">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li><li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids.">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).</li><li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts.">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue.">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins.">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster,+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods.">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems.">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li><li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice,+Sorghum,+and+Sugar+Vane.">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).</li></ol>

Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений и в последнее время широко изучается для применения в биотопливе, биоэнергетике и биопродуктах. Лигнин богат ароматическими соединениями, которые хранятся во всех сосудистых вторичных клеточных стенках растений. Он имеет нескольк?...

Лигнин является одним из жизненно важных несущих компонентов клеточных стенок растений и вторым наиболее распространенным полимером на Земле1. Химически лигнин представляет собой сшитый гетерополимер, состоящий из высокомолекулярных комплексных фенольных соединений, которые образуют естественный возобновляемый источник ароматических полимеров и синтеза биоматериалов2,3. Этот природный полимер играет значительную роль в росте, развитии, выживании, механической поддержке, жесткости клеточных стенок, водном транспорте, минеральном транспорте, устойчивости к жилью, развитии тканей и органов, отложении энергии и защите от биотических и абиотических стрессов4,5,6,7. Лигнин в основном состоит из трех различных монолигнолов: хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов, которые получены из фенилпропаноидного пути8,9. Количество лигнина и состав мономеров варьируются в зависимости от вида растения, типа ткани/органа и различных стадий развития растений10. Лигнин широко классифицируется на хвойный, лиственный и травяной лигнин на основе источника и монолигнольного состава. Древесина хвойных пород в основном состоит из 95% хвойного спирта с 4% п-кумарилового и 1% синапилового спиртов. Древесина лиственных пород имеет хвойный и синапиловый спирты в равных пропорциях, в то время как травяной лигнин состоит из различных пропорций хвойных, синапильных и п-кумариловых спиртов11,12. Состав мономеров имеет решающее значение, поскольку он определяет силу лигнина, разложение и деградацию клеточной стенки, а также определяет молекулярную структуру, ветвление и сшивание с другими полисахаридами13,14.
Исследования лигнина приобретают все большее значение в кормовой, текстильной промышленности, бумажной промышленности, а также для биоэтанола, биотоплива и биопродуктов из-за его низкой стоимости и высокой численности15,16. Различные химические методы (например, ацетилбромид, кислотные детергенты, клазон и перманганатное окисление) наряду с инструментальными методами (например, спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (NIR), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и ультрафиолетовая (УФ) спектрофотометрия) были использованы для количественного определения лигнина9,17. Методы анализа лигнина обычно классифицируются на основе электромагнитного излучения, гравиметрии и растворимости. Принцип, лежащий в основе оценки лигнина электромагнитным излучением, был основан на химическом свойстве лигнина, с помощью которого он поглощает свет на определенных длинах волн. Эти результаты были оценены на основе принципа, что лигнин обладает более сильным поглощением ультрафиолета, чем углеводы. В 1962 году Болкер и Сомервилл использовали гранулы хлорида калия для оценки содержания лигнина в древесине18. Однако этот метод имеет недостатки в оценке содержания лигнина из травянистых образцов из-за наличия нелигниновых фенольных соединений и отсутствия соответствующего коэффициента вымирания. В 1970 году Фергус и Геринг обнаружили, что максимумы поглощения соединения гуаяцила и сирингила были на уровне 280 нм и 270 нм, что скорректировало проблему коэффициента вымирания метода Болкера и Сомервилля19. Позже инфракрасная спектроскопия, высокочувствительный метод характеристики фенолов, также использовалась для оценки лигнина с небольшим количеством образцов биомассы растений. Одним из примеров такой технологии является диффузная рефлектная спектрофотометрия с преобразованием Фурье. Этот метод, однако, не имеет надлежащего стандарта, аналогичного УФ-методу20. Позже содержание лигнина оценивали с помощью NIRS (ближняя инфракрасная спектроскопия) и ЯМР (ядерно-магнитно-резонансная спектроскопия). Хотя у этих способов есть недостатки, они не изменяют химическую структуру лигнина, сохраняя его чистоту20.
Гравиметрический метод Класона является прямым и наиболее надежным аналитическим методом для лигниновой оценки древесных стеблей. Основой для гравиметрической оценки лигнина является гидролиз/солюбилизация нелигниновых соединений и сбор нерастворимого лигнина для гравиметрии21. В этом способе углеводы удаляют гидролизом биомассы с концентрированнымН2SO4 для извлечения остатка лигнина20,22. Содержание лигнина, оцененное этим методом, известно как кислотный нерастворимый лигнин или лигнин Клазона. Применение метода Класона зависит от вида растения, типа ткани и типа клеточной стенки. Наличие переменных количеств нелигниновых компонентов, таких как дубильные вещества, полисахариды и белки, приводит к пропорциональным различиям в оценке содержания кислотного нерастворимого/растворимого лигнина. Следовательно, метод Класона рекомендуется только для оценки лигнина биомассы с высоким содержанием лигнина, такой как древесные стебли17,23. Методы растворимости, такие как ацетилбромид (AcBr), нерастворимый в кислоте лигнин и тиогликолевая кислота (TGA), являются наиболее часто используемыми методами для оценки содержания лигнина из различных источников биомассы растений. Kim et al. установили два метода экстракции лигнина методом солюбилизации. Первый способ экстрагирует лигнин в виде нерастворимого остатка путем солюбилизации целлюлозы и гемицеллюлозы, в то время как второй способ разделяет лигнин в растворимой фракции, оставляя целлюлозу и гемицеллюлозу в качестве нерастворимого остатка24.
Аналогичными методами, используемыми при оценке лигнина на основе растворимости, являются методы тиогликолевой кислоты (TGA) и ацетилбромида (AcBr)25. Как методы TGA, так и методы ацетилбромида оценивают содержание лигнина путем измерения абсорбации солюбилизированного лигнина при 280 нм; однако метод AcBr разлагает ксиланы в процессе солюбилизации лигнина и показывает ложное увеличение содержания лигнина26. Метод тиогликолата (TGA) является более надежным методом, так как он зависит от специфической связи с тиоэтерными группами бензилового спирта групп лигнина с TGA. Связанный с TGA лигнин осаждается в кислых условиях с использованием HCl, а содержание лигнина оценивается с использованием его абсорбции при 280 нм27. Метод TGA имеет дополнительные преимущества: меньшую структурную модификацию, растворимую форму оценки лигнина, меньшую интерференцию от нелигниновых компонентов и точную оценку лигнина из-за специфической связи с TGA.
Этот метод TGA модифицирован на основе типа образца биомассы растений, используемого для оценки содержания лигнина. Здесь мы модифицировали и адаптировали быстрый метод TGA рисовых соломинок27 к тканям хлопка для оценки содержания лигнина. Вкратце, высушенные порошкообразные образцы растений подвергали буферу солюбилизации белка и экстракции метанола для удаления белков и спирторастворимой фракции. Нерастворимый в спирте остаток обрабатывали TGA и осажденным лигнином в кислых условиях. Стандартная кривая лигнина была сгенерирована с использованием коммерческого бамбукового лигнина и получена линия регрессии (y = mx+c). Значение "x" использует средние значения поглощения лигнина при 280 нм, в то время как значения "m" и "c" были введены из линии регрессии для расчета неизвестной концентрации лигнина в образцах биомассы хлопковых растений. Этот метод делится на пять этапов: 1) подготовка образцов растений; 2) промывка проб водой и метанолом; 3) обработка гранул ТГА и кислотой с осаждением лигнина; 4) осаждение лигнина; и 5) подготовка стандартной кривой и оценка содержания лигнина в образце. Первые две фазы в основном сосредоточены на подготовке растительного материала, за которым следуют вода, PSB (буфер солюбилизации белка) и экстракция метанола для получения нерастворимого в спирте материала. Затем его обрабатывали TGA (тиогликолевой кислотой) и HCl с образованием комплекса с лигнином в третьей фазе. В конце HCl использовали для осаждения лигнина, который растворяли в гидроксиде натрия для измерения его абсорбции при 280 нм28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioSpectrophotometer kinetic</td>
			<td>Eppendorf kinetic</td>
			<td>6136000010</td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifuging&#160; samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial bamboo lignin</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>1002171289</td>
			<td>Used in the preparation of the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>16690382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>Containers for solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For fine grinding of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ Thermal mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For temperature controlled steps during lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate stirrer</td>
			<td>Walter</td>
			<td>WP1007-HS</td>
			<td>Used for preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221677</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>For thorough drying of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring scale</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (100 %)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Z628034-500EA</td>
			<td>Containers for extraction of lignin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant biomass gerinder</td>
			<td>Hanchen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Used for crushing dried samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AE150</td>
			<td>Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator/oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid (TGA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>68-11-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Used for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3340001</td>
			<td>For proper mixing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)

Лигнин является природным полимером, который является вторым наиболее распространенным полимером на Земле после целлюлозы. Лигнин в основном осаждается во вторичных клеточных стенках растений и представляет собой ароматический гетерополимер, в основном состоящий из трех монолигнолов со значительным промышленным значением. Лигнин играет важную роль в росте и развитии растений, защищает от биотических и абиотических стрессов, а также в качестве кормов для животных, древесины и промышленных лигниновых продуктов. Точная оценка содержания лигнина имеет важное значение как для фундаментального понимания биосинтеза лигнина, так и для промышленного применения биомассы. Метод тиогликолевой кислоты (TGA) является высоконадежным методом оценки общего содержания лигнина в биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования тиоэфиров с бензиловым спиртом групп лигнина, которые растворимы в щелочных условиях и нерастворимы в кислых условиях. Общее содержание лигнина оценивается с использованием стандартной кривой, полученной из коммерческого бамбукового лигнина.

Две различные экспериментальные линии хлопка сравнивались на наличие различий в содержании лигнина в разных тканях. Содержание экстрагированного лигнина в каждом образце измеряли при 280 нм и регистрировали его соответствующие значения поглощения. Средние значения абсорбции каждого ...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Здесь представлен модифицированный метод TGA для оценки содержания лигнина в травянистой растительной биомассе растений. Этот метод оценивает содержание лигнина путем образования специфических тиоэфирных связей с лигнином и представляет собой преимущество перед методом Класона, поскольку он требует относительно небольшой выборки для оценки содержания лигнина.

Оценка содержания лигнина в растительной биомассе с использованием тиогликолиновой кислоты (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Лигнин представляет собой сложный гетерополимер, состоящий из трех монолигнолов. Это второй по распространенности полимер на земле после целлюлозы. Здесь мы демонстрируем метод тиогликолевой кислоты, который является наиболее надежным методом оценки содержания лигнина.Этот метод основан на принципе, что лигнин связывается с тиогликолевой кислотой через тиоэфирные связи. Далее мы разделили этот протокол на пять этапов. На первом этапе мы готовим растительный материал.Во второй фазе мы выделим спирт нерастворимый экстракт. На третьей фазе мы выпадаем в осадок лигнин, используя тиогликолевую кислоту и кислые условия. На четвертом этапе мы готовим стандартную кривую лигнина с использованием промышленного бамбукового лигнина.Наконец, на пятом этапе мы оцениваем содержание лигнина, используя стандартную кривую, подготовленную на четвертой фазе. Растительный материал собирают, переворачивают горшки, чтобы отделить корни, тщательно промывают их в воде, сушат на воздухе в течение двух дней, переносят в маркированные емкости и инкубируют в инкубаторе при 49 градусах по Цельсию в течение одной недели до 10 дней. С помощью ножниц ткань далее разрезается на кусочки размером от 1 мм до 3 мм.В качестве альтернативы измельчитель биомассы используется для измельчения растительных тканей. Используйте корневую ткань Включите измельчитель биомассы, соберите измельченный порошок в предварительно маркированные контейнеры. Аналогично повторите для ткани стебля и ткани листа.Измельченный порошок загружается в шлифовальную вазу, которая затем помещается в морозильную мельницу и запускает морозильную мельницу со скоростью 10 CP в течение трех циклов. Взвесите 20 мг измельченного тканевого порошка и переложите в предварительно изготовленную трубку объемом 2 мл. Запишите пустую трубку и трубку с тканевым порошком и тканевым порошком в лабораторном блокноте.Высиживать трубки с крышкой, открытой при 60 градусах по Цельсию, в течение одного часа. После инкубации добавляют 1,8 мл воды в каждую вихревую центрифугу образца при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Откажитесь от супернатанта Добавьте 1,8 мл метанола.Вихрь и инкубация в предварительно нагретом 60-градусном по цельсию блоке в течение 20 минут После инкубации центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Повторите этот шаг еще раз. После центрифугирования откажитесь от супернатанта и высушите гранулы в вакуумной сушилке в течение двух-трех часов или до полного высыхания поддона.Измерьте и запишите вес каждой трубки в лабораторной записной книжке для оценки содержания лигнина в конце. Также включают положительный контроль промышленного бамбукового лигнина в этот момент начиная с 0,5 мг до 4 мг в трипликатах. Добавьте 1 мл 3 обычных соляных кислот вместе с сотней микролитров гликолевой кислоты в каждый образец Vortex и инкубировать при 80 градусах цельсия в течение 3 часов.Через 3 часа инкубации переложите их в стойку и дайте остыть в течение 10 минут. затем центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования цвет раствора выглядит так.Выбросьте супернатант. Добавить 1 мл воды. Вихревая центрифуга при 15 000 об/мин в течение 10 минут.Выбросьте супернатант. Добавить 1 мл 1 нормального гидроксида натрия. Вихрь и инкубируют при 37 градусах по Цельсию шейкер в течение ночи.После ночной инкубации центрифугируют трубки при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Перенесите супернатант в свежие предварительно меченые пробирки объемом 2 мл, добавьте к супернатанту 200 микролитров концентрированной соляной кислоты. Смешайте их путем мягкой инверсии, как показано здесь.Высиживать их в холодильнике при 4 градусах по Цельсию на ночь. После инкубации центрифугу при 15 000 об/мин в течение 10 минут. Выбросьте супернатант.Добавить 1 мл гидроксида натрия. Вихрь и инкубировать в шейкере при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Используйте спектрофотометр для сбора показаний поглощения 280 нанометров, возьмите 2 микролитра гидроксида натрия в качестве пустой, так как осажденный лигнин растворен в гидроксиде натрия.Сделайте пустое до нуля. Аналогично повторите для образцов. Используйте два микролитра каждого образца для сбора показаний поглощения в лабораторной записной книжке.Возьмите три показания для каждого образца для трех технических реплик. В первом столбце у нас есть номер образца. Во втором столбце мы имеем биологические реплики, где R1, R2, R3 представляют собой три биологические реплики одной экспериментальной линии.В третьем столбце мы усредняли показания поглощения, полученные на уровне 280 нанометров. Мы рассчитали содержание лигнина в четвертом столбце по формуле y=mx-c, где x — средний OD.m а значения c строятся из линии регрессии подготовленной стандартной кривой. Пятая колонка - это вес после промывки метанола и воды.Таким образом, это способ, который используется для оценки содержания лигнина в мг. Таким образом, мы делим значение, полученное в четвертом столбце, на пятое столбец, чтобы получить значение на мг содержания лигнина в шестом столбце. И это значение умножается на 1000 для того, чтобы получить на грамм вес клеточной стенки.А процентное содержание лигнина вычисляется путем деления этого значения на 1000 и умножения на 100. Наконец, мы получаем средний лигнин путем усреднения лигнина трех биологических реплик каждой экспериментальной линии, который будет сравниваться со средним значением другой экспериментальной линии в виде гистограммы, чтобы понять различия в содержании лигнина. Мы также можем применить студенческий t-тест для проверки их уровня значимости.В колонке А у нас есть коммерческий бамбуковый лигнин, а затем вес бамбукового лигнина, который был взят до TGA, и их соответствующие показания поглощения на уровне 280 нанометров. Эти значения в таблице A использовались для построения рассеянного графика в столбце B, который дает нам линию регрессии со значениями m и c. В C мы сравнили значения, полученные с помощью стандартной кривой, а экспериментальные линии промышленного бамбукового лигнина один и два сравнивались в виде гистограммы, и в результате они показывают разницу между собой.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Объединение рамановских изображений и многофакторного анализа для визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в стенке клетки растения

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Высокая пропускная способность, абсолютное определение содержания выбранной белка на уровнях тканей, с использованием количественных Dot блот анализ (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Очищение сродства хлоропласта Translocon белковых комплексов с помощью тега крана

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Выявление аминокислотных перепроизводителей с использованием редких Кодон-богатых маркеров

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...