Name: estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Vi tackar Institutionen för växt- och markvetenskap och bomull Inc. för deras partiella stöd för denna studie.

1. Beredning av växtprover
<ol><li>Samla två månader gamla bomullsplantor från växthuset (Figur 1A).</li>
	<li>Vänd växtkrukorna försiktigt för att separera jord och rötter med intakta sidorötter genom att lossa jorden runt växten (Figur 1B).</li>
	<li>Tvätta de uppsamlade växterna noggrant i brickor fyllda med vatten för att avlägsna all smuts (för rotprover) (Figur 1C).</li>
	<li>Använd pappershanddukar för at...

<ol>
	<li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Constitutionand Biosynthesis of Lignin. , 129 (1968).</li><li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+utilization:+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects.">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li><li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization:+Toward+New+Platform+Chemicals.">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li><li>Xu, F., Sun, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels. , 9-47 (2010).</li><li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins:+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants.">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335 (2018).</li><li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots.">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li><li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants.">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li><li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+engineering.">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li><li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin.">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production.">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43 (2011).</li><li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A., Song, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Catalysis. 60, 59-123 (2017).</li><li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions. 2, 151-163 (2008).</li><li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins:+a+comparative+characterisation+study.">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li><li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples.">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li><li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+biomass+through+lignin+modification.">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li><li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+on+lignin+structure,+pretreatments,+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential.">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li><li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Lignin+Be+Accurately+Measured.">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li><li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations.">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li><li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy.">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li><li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry.">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li><li>Dence, C. W., Lin, S. Y., Dence, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Determination+of+Lignin.">The Determination of Lignin.</a> Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry-past,+present+and+future.">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins.">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+Depolymerization+and+Conversion:+A+Review+of+Thermochemical+Methods.">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering &amp; Technology. 34, 29-41 (2011).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acetyl+bromide+method+is+faster,+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods.">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants:+Some+Cautionary+Notes.">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li><li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice.">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li><li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+:+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products.">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li><li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin.">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li><li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin:+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component.">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517 (2013).</li><li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Industrial+Applications+of+Lignin:+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials.">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li><li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids.">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745 (2019).</li><li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts.">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li><li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue.">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li><li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins.">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li><li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster,+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods.">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000 (2014).</li><li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems.">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li><li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice,+Sorghum,+and+Sugar+Vane.">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478 (2011).</li></ol>

Lignin spelar en viktig roll i växttillväxt och utveckling och har nyligen studerats i stor utsträckning för biobränsle-, bioenergi- och bioproduktapplikationer. Lignin är rikt på aromatiska föreningar som lagras i alla vaskulär växt sekundära cellväggar. Den har flera industriella applikationer som träpanelprodukter, biodispersiva medel, flocculants, polyuretanskum och i hartser av kretskort29,30,31. Det mesta av d...

Lignin är en av de vitala bärande komponenterna i växtcellsväggar och den näst mest rikliga polymeren på jorden1. Kemiskt är lignin en korslänkad heteropolymer som består av komplexa fenolföreningar med hög molekylvikt som utgör en naturlig förnybar källa till aromatiska polymerer och syntes av biomaterial2,3. Denna naturliga polymer spelar betydande roller i växttillväxt, utveckling, överlevnad, mekaniskt stöd, cellväggsstelhet, vattentransport, mineraltransport, logibeständighet, vävnads- och organutveckling, nedfall av energi och skydd mot biotiska och abiotiskapåfrestningar 4,5,6,7. Lignin består huvudsakligen av tre olika monolignoler: barrträd, sinapyl och p-coumarylalkoholer som härrör från fenylpropanoidervägen8,9. Mängden lignin och monomerernas sammansättning varierar beroende på växtart, vävnad/organtyp och olika stadier av växtutveckling10. Lignin klassificeras i stor utsträckning i barrved, lövträ och gräs lignin baserat på källan och monolignol sammansättning. Barrved består främst av 95% barrträalkohol med 4% p-coumaryl och 1% sinapylalkoholer. Lövträ har barrträd och sinapylalkoholer i lika stora proportioner, medan gräs lignin består av olika proportioner av barrträd, sinapyl och p-coumarylalkoholer11,12. Sammansättningen av monomerer är kritisk eftersom den bestämmer ligninstyrkan, nedbrytningen och nedbrytningen av cellväggen samt bestämmer molekylär struktur, förgrening och korslänkning med andra polysackarider13,14.
Ligninforskningen blir allt viktigare inom mädosök, textilindustri, pappersindustrier och för bioetanol, biobränsle och bioprodukter på grund av dess låga kostnad och högaöverflöd 15,16. Olika kemiska metoder (t.ex. acetylbromid, sura rengöringsmedel, Klason och permanganatoxidation) tillsammans med instrumentella metoder (t.ex. nära infraröd (NIR) spektroskopi, kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi och ultraviolett (UV) spektroskopi) användes för lignin kvantifiering9,17. Analysmetoderna för lignin klassificeras i allmänhet baserat på elektromagnetisk strålning, gravimetri och löslighet. Principen bakom ligninuppskattning genom elektromagnetisk strålning baserades på den kemiska egenskapen hos lignin genom vilken den absorberar ljus vid specifika våglängder. Dessa resultat uppskattades baserat på principen att lignin har en starkare UV-absorbans än kolhydrater. År 1962 använde Bolker och Somerville kaliumkloridpellets för att uppskatta ligninhalten i trä18. Denna metod har dock nackdelar med uppskattningen av ligninhalten från örtprover på grund av förekomsten av fenolföreningar som inte är lignin och avsaknaden av en lämplig utrotningskoefficient. År 1970 fann Fergus och Goring att guaiacyl- och syringylföreningens absorptionsmaximering var på 280 nm och 270 nm, vilket korrigerade utrotningskoefficientfrågan för Bolker och Somerville-metoden19. Senare användes infraröd spektroskopi, en mycket känslig teknik för karakterisering av fenolik, också för ligninuppskattning med en liten mängd växtbiomassaprover. Ett exempel på sådan teknik var diffus reflektans Fourier transform spektrofotometri. Denna metod saknar dock en korrekt standard som liknar UV-metoden20. Senare uppskattades ligninhalten av NIRS (nära infraröd spektroskopi) och NMR (kärnmagnetisk resonansspektroskopi). Även om det finns nackdelar med dessa metoder, ändrar de inte den kemiska strukturen hos lignin, behåller sin renhet20.
Den gravimetriska Klasonmetoden är en direkt och pålitlig analysmetod för ligninuppskattning av träiga stjälkar. Grunden för gravimetric lignin uppskattning är hydrolys/löslighet av icke-lignin föreningar och insamling av olösligt lignin för gravimetri21. I denna metod avlägsnas kolhydraterna genom hydrolys av biomassan med koncentrerad H2SO4 för att extrahera ligninrester20,22. Den ligninhalt som uppskattas med denna metod kallas syralöslignin eller Klason lignin. Tillämpningen av Klason-metoden beror på växtarterna, vävnadstypen och cellväggstypen. Förekomsten av varierande mängder icke-ligninkomponenter såsom tanniner, polysackarider och proteiner leder till proportionella skillnader i uppskattningen av syralösligt/lösligt lignininnehåll. Därför rekommenderas Klason-metoden endast för ligninuppskattning av biomassa med hög ligninhalt som träigastjälkar 17,23. Löslighetsmetoder som acetylbromid (AcBr), syraolösligt lignin och tioglykolsyra (TGA) är de vanligaste metoderna för uppskattning av ligninhalten från olika växtbiomassakällor. Kim et al. etablerade två metoder för lignin utvinning genom löslighet. Den första metoden extraherar lignin som en olöslig rest genom att löslig cellulosa och hemicellulosa, medan den andra metoden separerar lignin i lösliga fraktioner, vilket lämnar cellulosa och hemicellulosa som olösliga rester24.
Liknande metoder som används vid ligninuppskattning baserad på löslighet är tioglykolicsyra (TGA) och acetylbromid (AcBr)metoder 25. Både TGA- och acetylbromidmetoder uppskattar ligninhalten genom att mäta absorbansen av det lösliga ligninet vid 280 nm. AcBr-metoden försämrar dock xylans under processen med ligninlöslighet och visar en felaktig ökning av lignininnehållet26. Thioglycolate (TGA) metoden är den mer tillförlitliga metoden, eftersom den beror på specifik bindning med thioethergrupperna av bensylalkoholgrupper av lignin med TGA. TGA-bundet lignin fälls ut under sura förhållanden med HCl, och ligninhalten uppskattas med hjälp av dess absorbans vid 280 nm27. TGA-metoden har ytterligare fördelar med mindre strukturella modifieringar, en löslig form av ligninuppskattning, mindre interferens från icke-ligninkomponenter och exakt uppskattning av lignin på grund av specifik bindning med TGA.
Denna TGA-metod modifieras baserat på den typ av växtbiomassaprov som används för uppskattning av ligninhalten. Här modifierade och anpassade vi den snabba TGA-metoden för rissugrör27 till bomullsvävnader för att uppskatta ligninhalten. Kortfattat utsattes de torkade pulveriserade växtproverna för proteinlöslighetsbuffert och metanolextraktion för att avlägsna proteiner och den alkohollösliga fraktionen. Alkohol olösliga rester behandlades med TGA och fälls ut lignin under sura förhållanden. En lignin standardkurva genererades med kommersiell bambu lignin och en regressionslinje (y = mx +c) erhölls. Värdet "x" använder genomsnittliga absorbansvärden för lignin vid 280 nm, medan värdena "m" och "c" angavs från regressionslinjen för att beräkna okänd ligninkoncentration i biomassaprover för bomullsväxter. Denna metod är indelad i fem faser: 1) beredning av växtprover; 2) tvättning av proverna med vatten och metanol, 3) Behandling av pelleten med TGA och syra för att fälla ut lignin. 4) Utfällning av lignin. och 5) standardkurvberedningen och uppskattningen av ligninhalten i provet. De två första faserna är främst inriktade på växtmaterialberedningen följt av vatten, PSB (proteinlöslighetsbuffert) och metanolextraktioner för att erhålla alkohololösligt material. Sedan behandlades det med TGA (tioglykolic syra) och HCl att bilda ett komplex med lignin i den tredje fasen. I slutet användes HCl för att fälla ut lignin, som löstes upp i natriumhydroxid för att mäta dess absorbans vid 280 nm28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioSpectrophotometer kinetic</td>
			<td>Eppendorf kinetic</td>
			<td>6136000010</td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>For centrifuging&#160; samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial bamboo lignin</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>1002171289</td>
			<td>Used in the preparation of the standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>16690382</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0448</td>
			<td>Containers for solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer mill</td>
			<td>Spex Sample Prep</td>
			<td>68-701-15</td>
			<td>For fine grinding of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block/ Thermal mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13527550</td>
			<td>For temperature controlled steps during lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate stirrer</td>
			<td>Walter</td>
			<td>WP1007-HS</td>
			<td>Used for preparation of solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221677</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>150152633</td>
			<td>For thorough drying of plant tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring scale</td>
			<td>Mettler toledo</td>
			<td>30243386</td>
			<td>For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (100 %)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Z628034-500EA</td>
			<td>Containers for extraction of lignin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant biomass gerinder</td>
			<td>Hanchen</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Used for crushing dried samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AE150</td>
			<td>Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled incubator/oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioglycolic acid (TGA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>68-11-1</td>
			<td>Used in the protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum dryer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td>Used for drying samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3340001</td>
			<td>For proper mixing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

estimation of plant biomass lignin content using thioglycolic acid (tga)

Lignin är en naturlig polymer som är den näst mest rikliga polymeren på jorden efter cellulosa. Lignin deponeras huvudsakligen i växtens sekundära cellväggar och är en aromatisk heteropolymer som främst består av tre monolignolen med betydande industriell betydelse. Lignin spelar en viktig roll i växttillväxt och utveckling, skyddar mot biotiska och abiotiska påfrestningar och i kvaliteten på djurfoder, trä och industriella ligninprodukter. En korrekt uppskattning av ligninhalten är avgörande för både grundläggande förståelse av ligninbiosyntesen och industriella tillämpningar av biomassa. TGA-metoden (Thioglycolic Acid) är en mycket tillförlitlig metod för att uppskatta den totala ligninhalten i växtbiomassan. Denna metod uppskattar ligninhalten genom att bilda tioeter med bensylalkoholgrupperna av lignin, som är lösliga under alkaliska förhållanden och olösliga under sura förhållanden. Det totala lignininnehållet uppskattas med hjälp av en standardkurva som genereras från kommersiellt bambu lignin.

Två olika experimentella linjer i bomull jämfördes för skillnader i deras lignininnehåll i olika vävnader. Den extraherade ligninhalten i varje prov uppmättes till 280 nm och registrerade dess respektive absorbansvärden. De genomsnittliga absorbansvärdena för varje biologisk replikat jämfördes med regressionslinjen i ligninstandardkurvan(tabell 2, figur 3C). Regressionslinjen, y = mx + c, används för att beräkna den okända ligninhalten i de extraherade experi...

Watch this Scientific Journal Video about Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA at JoVE.com

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Här presenterar vi en modifierad TGA-metod för uppskattning av ligninhalten i örtartad växtbiomassa. Denna metod uppskattar ligninhalten genom att bilda specifika tiodelsbindningar med lignin och utgör en fördel jämfört med Klasonmetoden, eftersom det kräver ett relativt litet urval för uppskattning av lignininnehåll.

Uppskattning av växtbiomassa Ligninhalt med tioglykolsyra (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

Lignin är en komplex heteropolymer som består av tre monolignolen. Det är den näst mest rikliga polymeren på jorden bredvid cellulosa. Här demonstrerar vi tioglykolic syrametod, som är den mest tillförlitliga metoden för uppskattning av ligninhalt.Denna metod är baserad på principen att lignin binder till tioglykoliksyra genom tioetherbindningar. Dessutom delade vi in protokollet i fem faser. I den första fasen förbereder vi växtmaterialet.I den andra fasen isolerar vi alkoholen olösligt extrakt. I den tredje fasen fäller vi ut lignin med tioglykolsyra och sura förhållanden. I den fjärde fasen förbereder vi lignin standardkurva med industriell bambu lignin.Slutligen, i den femte fasen, uppskattar vi ligninhalten med hjälp av standardkurvan som utarbetats i den fjärde fasen. Växtmaterial samlas in, vänd krukorna för att separera rötterna, tvätta dem noggrant i vatten, lufttorkad i två dagar, överförde dem till märkta behållare och inkuberade dem i inkubatorn vid 49 grader celsius i en vecka till 10 dagar. Med hjälp av sax skärs vävnaden ytterligare i 1 mm till 3 mm stora bitar.Alternativt används biomassakvarn för att krossa växtvävnaderna. Använd rotvävnaden Slå på biomassakvarnen samla det krossade pulvret i förmärkta behållare. Upprepa också för stamvävnaden och bladvävnaden.Det krossade pulvret lastas i slipvasen som sedan placeras i fryskvarnen Och kör fryskvarnen med en hastighet av 10 CP-hastighet under tre cykler. Väg 20 mg av markvävnadspulvret och överför till ett för tillverkat 2 ml-rör. Anteckna det tomma röret och röret med vävnadspulver och vävnadspulvret i din bärbara labbdator.Inkubera rören med locket öppet vid 60 grader celsius i en timme. Efter inkubation tillsätt 1,8 ml vatten till varje provvirvelcentrifug vid 15 000 varv/min i 10 minuter. Kassera supernatanten Tillsätt 1,8 ml metanol.Virvel och inkubera i ett förvärmt 60 graders centigradeblock i 20 minuter Efter inkubationscentrifug vid 15 000 varv/min i 10 minuter. Upprepa det här steget en gång till. Efter centrifugation kassera supernatanten och torka pelletsen i vakuumtorken i två till tre timmar eller tills pallen är helt torr.Mät och registrera vikten på varje rör i din labbanteckningsbok för uppskattning av lignininnehåll i slutet. Inkludera också positiv kontroll industriell bambu lignin vid denna tidpunkt från 0,5 mg till 4 mg i triplicates. Tillsätt 1 ml 3 normal saltsyra, tillsammans med hundra mikroliter glykolsyra till varje provvirvel och inkubera vid 80 grader celsius i 3 timmar.Efter 3 timmars inkubation överför dem till ett rack och låt det svalna i 10 minuter. sedan centrifug vid 15 000 varv/min i 10 minuter. Efter centrifugation ser lösningens färg ut så här.Kassera supernaten. Tillsätt 1 ml vatten. Vortex Centrifuge vid 15 000 varv/min i 10 minuter.Kassera supernaten. Tillsätt 1 ml 1 normalt natriumhydroxid. Virvel och inkubera vid 37 grader celsius shaker över natten.Efter inkubation över natten centrifugera rören vid 15 000 varv/min i 10 minuter. Överför de övernaturliga färska förmärkta 2 ml-rören tillsätt 200 mikroliter koncentrerad saltsyra till supernatanten. Blanda dem genom mild inversion som visas här.Inkubera dem i kylskåpet vid 4 grader celsius över natten. Efter inkubation centrifugera vid 15 000 RPM i 10 minuter. Kassera supernaten.Tillsätt 1 ml natriumhydroxid. Virvel och inkubera i skakapparaten vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter. Använd spektrofotometer för att samla in absorbansavläsningarna 280 nanometer, Ta 2 mikroliter natriumhydroxid som blind eftersom ligninutfälld löses upp i natriumhydroxid.Gör det tomma till noll. Upprepa också för proverna. Använd två mikroliter i varje prov för att samla in absorbansavläsningarna i din bärbara labbdator.Ta tre avläsningar för varje prov för tre tekniska replikat. I den första kolumnen har vi provnumret. I den andra kolumnen har vi biologiska replikat där R1, R2, R3 representerar tre biologiska replikat av en experimentell linje.I den tredje kolumnen snittade vi de absorbansavläsningar som erhållits vid 280 nanometer. Vi beräknade ligninhalten i den fjärde kolumnen med formeln y=mx-c där x är det genomsnittliga OD.m- och c-värdena ritas från regressionslinjen i standardkurvan som förberetts. Femte kolonnen är vikten efter metanol och vattentvättar.Så det är så som används för uppskattning av ligninhalt i mg. Så vi delar upp värdet som erhålls i den fjärde kolumnen efter femte kolumnen för att erhålla värdet per mg lignininnehåll i den sjätte kolumnen. Och detta värde multipliceras med 1000 för att erhålla per gram cellväggsvikt.Och lignininnehållet i procent beräknas genom att dividera detta värde med 1000 och multiplicera med 100. Slutligen erhåller vi det genomsnittliga ligninet genom att i genomsnitt lignin av tre biologiska replikat av varje experimentell linje som kommer att jämföras med genomsnittet av en annan experimentell linje i form av en stapelgraf för att förstå skillnaderna i ligninhalten. Vi kan också tillämpa student t-test för att testa deras betydelsenivå.I kolumn A har vi kommersiellt bambu lignin, och sedan vikten av bambu lignin som togs före TGA och deras respektive absorbansavläsningar på 280 nanometer. Dessa värden i tabell A användes för att rita ett spridda diagram i kolumn B, vilket ger oss regressionslinjen med m- och c-värden. I C jämförde vi de värden som erhållits med hjälp av standardkurvan och den industriella bambu lignin experimentella linje ett och två jämfördes i form av en stapelgraf och resultatet är att de visar skillnad mellan varandra.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

High-throughput screening av kolhydratnedbrytande enzymer Använda Novel Olöslig kromogena substratmetod Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Kombinera Raman Imaging och Multivariate Analysis för att visualisera Lignin, Cellulosa och Hemicellulosa i växtcellsväggen

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Affinitet rening av kloroplast Translocon proteinkomplex med taggen TAP

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Identifiera aminosyran Överproducenter med hjälp av sällsynta-Codon-rika markörer

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Mätning av interaktioner mellan fluorescerande sonder och lignin i Plant sektioner av sFLIM baserat på ursprunglig Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...