Name: whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), dalla Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), dall'SFB 914 (progetto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e progetto A10 a C. Schulz), dall'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e dalla Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.

La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). I topi C57BL6/J sono stati acquistati dal Jackson Laboratory.
NOTA: la Figura 1 mostra gli s...

<ol>
	<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure.">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).</li><li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation.">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks.">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Espa&#241;ola de Cardiolog&#237;a (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li><li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4.">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li><li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution.">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li><li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node:+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice.">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li><li>Sillitoe, R. 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R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node:+structure+and+expression+of+HCN+channels.">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li><li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies.">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li><li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).</li><li>Shaw, P. J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations.">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal.">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li><li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node.">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li><li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+'funny'+(f)+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation.">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664 (2014).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+diversity+in+the+heart:+insights+from+transgenic+mouse+models.">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).</li><li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gap+junctions+and+connexins:+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets.">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li></ol>

L'anatomia cardiaca è stata tradizionalmente studiata utilizzando sezioni istologiche sottili11. Tuttavia, questi metodi non preservano la struttura tridimensionale del sistema di conduzione e, quindi, forniscono solo informazioni 2D. Il protocollo di colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero qui descritto consente di superare queste limitazioni e può essere utilizzato di routine per l'imaging SAN e AVN.
Rispetto ai metodi standard come l'immunoistochimica...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Le aritmie sono malattie comuni che colpiscono milioni di persone e sono la causa di una significativa morbilità e mortalità in tutto il mondo. Nonostante gli enormi progressi nel trattamento e nella prevenzione, come lo sviluppo di pacemaker cardiaci, il trattamento delle aritmie rimane impegnativo, principalmente a causa delle conoscenze molto limitate sui meccanismi della malattia sottostante 1,2,3. Una migliore comprensione sia dell'elettrofisiologia normale che della fisiopatologia delle aritmie può aiutare a sviluppare strategie di trattamento nuove, innovative e causali in futuro. Inoltre, per studiare in modo completo l'aritmogenesi, è importante localizzare e visualizzare il sistema di conduzione cardiaca specifico in modelli animali come il topo, poiché i topi sono ampiamente utilizzati nella ricerca elettrofisiologica.
Le parti principali del sistema di conduzione cardiaca sono il nodo senoatriale (SAN), dove l'impulso elettrico viene generato in cellule pacemaker specializzate, e il nodo atrioventricolare (AVN), che è l'unica connessione elettrica tra gli atri e i ventricoli4. Ogni volta che le proprietà elettrofisiologiche di SAN e AVN sono alterate, possono verificarsi aritmie come la sindrome del seno malato o il blocco atrioventricolare che possono portare al deterioramento emodinamico, alla sincope e persino alla morte, sottolineando così il ruolo essenziale di SAN e AVN nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi5.
Studi completi su SAN o AVN richiedono una localizzazione e una visualizzazione precise di entrambe le strutture, idealmente all'interno del loro ambiente fisiologico. Tuttavia, a causa delle loro piccole dimensioni e della loro posizione all'interno del miocardio funzionante, senza stabilire una chiara struttura macroscopicamente visibile, studiare l'anatomia e l'elettrofisiologia di SAN e AVN è impegnativo. I punti di riferimento anatomici possono essere utilizzati per identificare approssimativamente la regione che contiene SAN e AVN 6,7,8. In breve, la SAN si trova nella regione inter-cavale dell'atrio destro adiacente alla crista terminale muscolare (TC), l'AVN si trova all'interno del triangolo di Koch stabilito dalla valvola tricuspide, dall'ostio del seno coronarico e dal tendine di Todaro. Finora, questi punti di riferimento anatomici sono stati utilizzati principalmente per localizzare, rimuovere e quindi studiare SAN e AVN come strutture individuali (ad esempio, mediante istologia convenzionale). Per comprendere meglio la complessa elettrofisiologia di SAN e AVN (ad esempio, gli effetti regolatori delle cellule adiacenti del miocardio funzionante), tuttavia, è necessario studiare i sistemi di conduzione all'interno dell'ambiente fisiologico 3D.
La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è un metodo utilizzato per studiare le strutture anatomiche in situ preservando l'integrità del tessuto circostante9. Sfruttando la microscopia confocale e il software di analisi delle immagini, SAN e AVN possono essere visualizzati con anticorpi marcati con fluorescenza che prendono di mira i canali ionici specificamente espressi in queste regioni.
Questo protocollo seguente spiega i passaggi necessari per eseguire un metodo di colorazione a montaggio intero consolidato per la localizzazione e la visualizzazione del microscopio SAN e AVN. In particolare, questo protocollo descrive come (1) localizzare SAN e AVN in base a punti di riferimento anatomici per preparare questi campioni per la colorazione e l'analisi al microscopio (2) eseguire la colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero dei marcatori di riferimento HCN4 e Cx43 (3) preparare campioni SAN e AVN per la microscopia confocale (4) eseguire l'imaging confocale di SAN e AVN. Descriviamo anche come questo protocollo può essere modificato per includere un'ulteriore colorazione delle cellule miocardiche o non miocitarie circostanti come le fibre nervose autonome che consentono un'indagine approfondita del sistema di conduzione cardiaca all'interno del cuore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system&#160;</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA&#160;</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10 &#181;L, 100 &#181;L, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.2</td>
			<td>Oxford instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 black</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>28908</td>
			<td>use as a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td>Diluted to 1% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;mL</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 mL/mL</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5 L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor&#160;488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4412</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A-21247</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Connexin-43</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6219</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-903</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-designed and 3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>Cernit</td>
			<td>49655005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikonpasten, Baysilone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse

Il segnale elettrico fisiologicamente generato dalle cellule pacemaker nel nodo senoatriale (SAN) viene condotto attraverso il sistema di conduzione, che include il nodo atrioventricolare (AVN), per consentire l'eccitazione e la contrazione di tutto il cuore. Qualsiasi disfunzione di SAN o AVN provoca aritmie, indicando il loro ruolo fondamentale nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi. I modelli murini sono ampiamente utilizzati nella ricerca sull'aritmia, ma l'indagine specifica su SAN e AVN rimane impegnativa.
Il SAN si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore e l'AVN si trova all'apice del triangolo di Koch, formato dall'orifizio del seno coronarico, dall'anulus tricuspide e dal tendine di Todaro. Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte, la visualizzazione mediante istologia convenzionale rimane impegnativa e non consente lo studio di SAN e AVN all'interno del loro ambiente 3D.
Qui descriviamo un approccio di immunofluorescenza a montaggio intero che consente la visualizzazione locale di SAN e AVN di topo marcati. La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è destinata a sezioni più piccole di tessuto senza la necessità di sezionamento manuale. A tale scopo, il cuore del topo viene sezionato, con tessuto indesiderato rimosso, seguito da fissazione, permeabilizzazione e blocco. Le cellule del sistema di conduzione all'interno di SAN e AVN vengono quindi colorate con un anticorpo anti-HCN4. La microscopia a scansione laser confocale e l'elaborazione delle immagini consentono la differenziazione tra cellule linfonodali e cardiomiociti funzionanti e di localizzare chiaramente SAN e AVN. Inoltre, ulteriori anticorpi possono essere combinati per marcare anche altri tipi di cellule, come le fibre nervose.
Rispetto all'immunoistologia convenzionale, la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero preserva l'integrità anatomica del sistema di conduzione cardiaca, consentendo così l'indagine dell'AVN; soprattutto nella loro anatomia e nelle interazioni con le cellule del miocardio e non miociti circostanti.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile eseguire in modo affidabile l'imaging al microscopio confocale di SAN e AVN. La colorazione specifica del sistema di conduzione utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a HCN4 e la colorazione del miocardio funzionante utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a Cx43 consente la chiara identificazione di SAN (Figura 5, Video 1) e AVN (Figura 6, Video 2) all...

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Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori murini.

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

Multispettrali in tempo reale immagini a fluorescenza per il rilevamento intraoperatoria del linfonodo sentinella in Oncologia Ginecologica

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Ricerca

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Aspetti tecnici della fistola aorto-cavale mouse

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa Bengala Photothrombosis da confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di singolo vaso Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Analisi basata su Citometria Imaging- e di flusso della posizione cellulare e ciclo cellulare in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Una linea guida di valutazione postoperatoria per la ricostruzione assistita dal computer della mandibola

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

Ricostruzione del circuito sanguigno in un modello di trapianto di cuore di topo addominale

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Raffinata compensazione dei tessuti basata su CLARITY per l'organizzazione tridimensionale dei fibroblasti nei cuori di topo sani e feriti

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...