Name: whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich, y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Los ratones C57BL6/J fueron comprados en el Laboratorio Jackson.
NOTA: La figura 1 mue...

<ol>
	<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure.">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).</li><li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation.">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks.">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Espa&#241;ola de Cardiolog&#237;a (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li><li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4.">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li><li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution.">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li><li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node:+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice.">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li><li>Sillitoe, R. 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R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node:+structure+and+expression+of+HCN+channels.">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li><li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies.">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li><li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).</li><li>Shaw, P. J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations.">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal.">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li><li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node.">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li><li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+'funny'+(f)+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation.">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664 (2014).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+diversity+in+the+heart:+insights+from+transgenic+mouse+models.">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).</li><li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gap+junctions+and+connexins:+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets.">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li></ol>

La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.
En comparación con los métodos estánda...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento novedosas, innovadoras y causales en el futuro. Además, para estudiar exhaustivamente la arritmogénesis, es importante localizar y visualizar el sistema de conducción cardíaca específico en modelos animales como el ratón, ya que los ratones son ampliamente utilizados en la investigación electrofisiológica.
Las partes principales del sistema de conducción cardíaca son el nódulo sinoauricular (SAN), donde el impulso eléctrico se genera en células marcapasos especializadas, y el nódulo auriculoventricular (AVN), que es la única conexión eléctrica entre las aurículas y los ventrículos4. Siempre que se alteran las propiedades electrofisiológicas de la RAS y la AVN, pueden ocurrir arritmias como el síndrome del seno enfermo o el bloqueo auriculoventricular que pueden conducir a deterioro hemodinámico, síncope e incluso la muerte, y así subrayar el papel esencial de la RAS y la NVA en electrofisiología y arritmogénesis5.
Los estudios exhaustivos sobre SAN o AVN requieren una localización y visualización precisas de ambas estructuras, idealmente dentro de su entorno fisiológico. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación dentro del miocardio de trabajo, sin establecer una estructura macroscópicamente visible clara, estudiar la anatomía y electrofisiología de SAN y AVN es un desafío. Los puntos de referencia anatómicos se pueden usar para identificar aproximadamente la región que contiene SAN y AVN 6,7,8. En resumen, la RAS se encuentra en la región intercava de la aurícula derecha adyacente a la crista terminal muscular (TC), la AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch establecido por la válvula tricúspide, el ostium del seno coronario y el tendón de Todaro. Hasta ahora, estos puntos de referencia anatómicos se utilizaron principalmente para localizar, eliminar y luego estudiar SAN y AVN como estructuras individuales (por ejemplo, por histología convencional). Sin embargo, para comprender mejor la compleja electrofisiología de SAN y AVN (por ejemplo, los efectos reguladores de las células adyacentes del miocardio de trabajo), es necesario estudiar los sistemas de conducción dentro del entorno fisiológico 3D.
La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo es un método que se utiliza para estudiar las estructuras anatómicas in situ , preservando la integridad del tejido circundante9. Aprovechando el software de microscopía confocal y análisis de imágenes, SAN y AVN se pueden visualizar con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a canales iónicos expresados específicamente en estas regiones.
El siguiente protocolo explica los pasos necesarios para realizar un método de tinción de montaje completo bien establecido para la localización y visualización de microscopios SAN y AVN. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) localizar SAN y AVN por puntos de referencia anatómicos para preparar estas muestras para tinción y análisis de microscopía (2) realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de los marcadores de referencia HCN4 y Cx43 (3) para preparar muestras SAN y AVN para microscopía confocal (4) para realizar imágenes confocales de SAN y AVN. También describimos cómo se puede modificar este protocolo para incluir tinción adicional de miocardio circundante o células no miocitos que funcionan, como fibras nerviosas autónomas, lo que permite una investigación exhaustiva del sistema de conducción cardíaca dentro del corazón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system&#160;</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA&#160;</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10 &#181;L, 100 &#181;L, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.2</td>
			<td>Oxford instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 black</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>28908</td>
			<td>use as a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td>Diluted to 1% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;mL</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 mL/mL</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5 L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor&#160;488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4412</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A-21247</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Connexin-43</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6219</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-903</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-designed and 3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>Cernit</td>
			<td>49655005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikonpasten, Baysilone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse

La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.
La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.
Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.
En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.

Mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, se pueden realizar imágenes de microscopía confocal de SAN y AVN de manera confiable. La tinción específica del sistema de conducción utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a HCN4 y la tinción del miocardio de trabajo utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a Cx43 permite la identificación clara de SAN (Figura 5, Video 1) y AVN (Figura 6, Video 2<...

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Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

Multiespectrales en tiempo real imágenes de fluorescencia para la detección intraoperatoria del ganglio centinela en Oncología Ginecológica

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Investigación

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Ultrasonido Diagnóstico por la Imagen de la función del ratón del diafragma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Una Guía de Evaluación Postoperatoria para la Reconstrucción Asistida por Computadora de la Mandíbula

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

Reconstrucción Del Circuito Sanguíneo En Un Modelo De Trasplante De Corazón De Ratón Abdominal

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...