Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Alle de buffy frakkeposer, der blev brugt til denne protokol, blev bestrålet takket være tilgængeligheden af Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer og hele holdet af Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Scholarship Holder / Mary Roxana Christopher, dette arbejde er støttet af et stipendium fra det tyske hjerteselskab (DGK).

Undersøgelsen blev gennemført i henhold til statutten for Charité for Sikring af god videnskabelig praksis, og de juridiske retningslinjer og bestemmelser om privatlivets fred og etik blev overholdt. Den etiske komité godkendte alle menneskelige eksperimenter, og patienternes privatliv og anonymitet blev opretholdt i overensstemmelse med de regler, der er rapporteret på etikformularen.
BEMÆRK: For den protokol, der er beskrevet nedenfor, blev der anvendt friske humane stenotiske ventilpr...

<ol>
	<li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+valvular+heart+diseases:+a+population-based+study.">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li><li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aortic+valve+calcification,+as+measured+by+MDCT,+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis:+results+of+an+international+registry+study.">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li><li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+outcome+in+severe,+asymptomatic+aortic+stenosis.">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li><li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis:+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement:+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR.">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li><li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+(TAVI)-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development.">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li><li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAVI+for+low-flow,+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction:+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+(GARY).">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li><li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+(TAVI).">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation:+"on-label"+versus+"off-label"+use+of+TAVR+devices.">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+valve-in-valve+implantation+(VinV-TAVR)+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves.">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li><li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+Aortic+Valve+Disease:+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches.">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves.">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li><li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphocyte+infiltration,+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis.">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li><li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells.">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li><li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease.">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li><li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta:+Study+protocol.">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).</li><li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis.">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li><li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes.">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma.">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology &amp; Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer.">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Different+Functional+Distribution+of+"Not+Effector"+T+Cells+(Treg/Tnull)+in+Colorectal+Cancer.">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).</li><li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications.">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li><li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays.">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li><li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property.">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H+,+K++--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity.">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li><li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

Her præsenterer vi en metode til at karakterisere T lymfocyt subpopulationer isoleret fra stenotiske aortaklappen prøver, ved hjælp af flow cytometri. Denne metode kræver brug af bestrålet buffycoat til at isolere PBMCs. Strålingsfrekvensen, som buffy coat poser skal udsættes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det repræsenterer et afgørende skridt til at standse spredningen af feeder celler. Cellernes rolle isoleret fra buffy coat poser er kun at fungere som feeder celler og give næringsstoffer til T-celler isol...

Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD) er en af de mest almindelige hjerteklap lidelser, med en tung indvirkning på sundhedspleje. Hyppigheden af aortaklappen udskiftning i de sidste år er steget dramatisk og forventes at stige yderligere, på grund af den voksende ældre befolkning1.
Den underliggende patofysiologi af CAVD er kun delvist kendt, og de nuværende terapeutiske strategier er begrænset til konservative foranstaltninger eller aortaklappen udskiftning, enten gennem kirurgiske eller perkutane procedurer. Til dato kan ingen effektiv medicinsk behandling hindre eller vende CAVD progression og høj dødelighed er forbundet med tidlig symptom-debut, medmindre aortaklappen udskiftning (AVR) udføres2. Hos patienter med svær symptomatisk aortastenose blev den 3-årige symptomfri overlevelse rapporteret så lavt som 20%3. Transcatheter aortaklappen udskiftning (TAVR) repræsenterer en ny mulighed, revolutionerende behandling for høj-risiko patienter, især blandt ældre og har dramatisk reduceret dødeligheden, som var i sig selv høj i denne population4,5,6. På trods af de lovende resultater af TAVR er yderligere forskning nødvendig for at forstå CAVD-patofysiologi for at identificere nye tidlige terapeutiske mål7,8,9.
Tidligere menes at være en passiv, degenerativ proces, CAVD er nu anerkendt som en aktiv progressiv sygdom, karakteriseret ved en osteoblastisk fænotype switch af aortaklappen interstitielle celler10. Denne sygdom indebærer progressiv mineralisering, fibrocalcific ændringer og reduceret motilitet af aortaklappen foldere (sklerose), som i sidste ende hindrer blodgennemstrømningen fører til indsnævring (stenose) af aortaklappen åbning11.
Inflammation betragtes som en nøgleproces i CAVD patofysiologi, svarende til processen med vaskulær åreforkalkning. Endotelskade muliggør aflejring og akkumulering af lipidarter, især oxiderede lipoproteiner i aortaklappen12. Disse oxiderede lipoproteiner fremkalder en inflammatorisk reaktion, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktivitet, der fører til mineralisering. Den rolle, som medfødte og adaptive immunitet i CAVD udvikling og sygdom progression er for nylig blevet fremhævet13. Aktivering og klonisk udvidelse af specifikke delmængder af hukommelse T-celler er dokumenteret hos patienter med CAVD og mineraliserede aortaklappens foldere, således at inflammatoriske processer antages at være involveret i det mindste i udviklingen af CAVD og formodentlig også i sygdomsprogression14. Faktisk, selv om antigen-præsentere celler og makrofager er til stede i både den sunde og syge ventil, tilstedeværelsen af T-lymfocytter er tegn på en alderen og syge aortaklappen. Denne lymfocytiske infiltrere sammen med en stigning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på CAVD15.
Vi hypoteser eksistensen af en interaktion mellem aortaklappen interstitielle celler og aktivering af immunsystemet, som potentielt udløser indledningen af en kronisk inflammatorisk proces i aortaklappen. Analysen af T-celler fra stenotisk aortaklappen væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i forkalkning udvikling, da det kan give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo. I det nuværende arbejde, ved hjælp af aortaklappen væv, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem og karakteriserer dem efterfølgende ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Friske aortaklappen prøver blev fjernet fra CAVD patienter, der fik kirurgisk ventil udskiftning for svær aorta stenose. Efter den kirurgiske excision blev den friske ventilprøve dissekeret i små stykker, og T-cellerne blev kultiveret, klonet derefter analyseret ved hjælp af flowcytometri. Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. De data, der genereres fra farvningspanelet, kan bruges til at spore ændringer i T-lymfocytfordelingen over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande for specifikke T-celleundersæt af interesse.
Udvinding af forkalket væv, isolering af leukocytter fra forkalket væv og især brugen af flowcytometri på denne type væv kan være udfordrende på grund af problemer som autofluorescence. Der findes kun få publikationer med protokoller til dette specifikke formål16,17,18. Heri præsenterer vi en protokol designet specielt til direkte isolation og kultur af T lymfocyt fra humane aortaklappen prøver. Kloniske udvidelse af lymfocytter er et kendetegn for adaptiv immunitet. Undersøgelse af denne proces in vitro giver indsigtsfulde oplysninger om niveauet af lymfocyt heterogenitet19. Efter en tre-ugers inkubationsperiode er T-celleklo klonerne klar til at blive forplantet, da der blev opnået en passende mængde T-celler fra hver klon, så den fænotypiske og funktionelle undersøgelse blev tilladt. Efterfølgende studeres fænotypen af T-kloner af cytofluorometri.
Denne immunologiske protokol er en tilpasning af en metode, der tidligere er udviklet af Amedei et al. til T-celleisolation og karakterisering fra humant væv, specielt designet til forkalket humant væv, såsom i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering af PBMCs (perifere blod mononukleare celler) ved hjælp af bestrålet buffy pels beskriver en effektiv måde at opnå feeder celler (FC), specielt justeret for kloning fase af T lymfocytter isoleret fra ventil interstitielle celler. Fødelaget består af vækstarresterede celler, som stadig er levedygtige og bioaktive. Fødecellernes rolle er vigtig for at understøtte in vitro-overlevelse og vækst af T-lymfocytter isoleret fra ventilinterstitielle celler23. For at undgå spredning af fødeceller i kulturen skal disse celler gennemgå en vækstarrest. Dette kan opnås på to måder: gennem fysiske metoder såsom bestråling eller gennem behandling med cytotoksiske kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotikum, der kan anvendes direkte på kulturoverfladen24. Her viser vi feeder cellevækst anholdelse opnået gennem celle bestråling.
Denne metode præsenterer en effektiv, omkostningseffektiv måde at isolere og karakterisere T-celler fra aortaklappen væv, der bidrager til at udvide spektret af immunologiske metoder til at udforske CAVD patofysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

Brændværdi aortaklappen sygdom (CAVD), en aktiv sygdom proces lige fra mild fortykkelse af ventilen til svær forkalkning, er forbundet med høj dødelighed, på trods af nye terapeutiske muligheder såsom transkateter aortaklappen udskiftning (TAVR). 
De komplette veje, der starter med ventil forkalkning og føre til svær aorta stenose forbliver kun delvist forstået. Ved at give en tæt repræsentation af aortaklappen celler in vivo, assaying af T lymfocytter fra stenotisk ventil væv kunne være en effektiv måde at afklare deres rolle i udviklingen af forkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeres den friske aortaklappen i små stykker, og T-lymfocytterne dyrkes, klones derefter analyseres ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS).
Farvningsproceduren er enkel, og de farvede rør kan også fastgøres ved hjælp af 0,5% af paraformaldehyd og analyseres op til 15 dage senere. Resultaterne fra farvningspanelet kan bruges til at spore ændringer i T-cellekoncentrationer over tid i forhold til intervention og kan let videreudvikles for at vurdere aktiveringstilstande af specifikke T-celleundertyper af interesse. I denne undersøgelse viser vi isoleringen af T-celler, udført på friske forkalkede aortaklappen prøver og trinene til at analysere T-celle kloner ved hjælp af flowcytometri til yderligere at forstå den rolle, adaptive immunitet i CAVD patofysiologi.

Vi brugte en enkel og omkostningseffektiv metode til at karakterisere leukocytpopulationen af friske aortaklappenprøver fra humane patienter med svær aortaklappen stenose (se protokollen). Metoden til isolering af PBMCs er et vigtigt skridt i at opnå feederceller, som bruges i hvert trin i eksperimentet (kloning, genfeeding og opdelingsfaser) og muliggør påvisning og karakterisering af infiltrerende leukocytter i aortaklappenprøver. De vigtigste trin i denne metode er vist i figur 1.</...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

I denne undersøgelse beskriver vi processen med T-lymfocytisolation fra friske prøver af forkalkede aortaventiler og de analytiske trin i T-cellekloning til karakterisering af de adaptive leukocytundersæt ved hjælp af flowcytometrianalyse.

Undersøgelse af aortaklappen Forkalkning via isolation og kultur af T-lymfocytter ved hjælp af feederceller fra bestrålet Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Denne protokol er nem at udføre. Kloningsfasen gør det muligt at få et større antal T-kloner fra friske prøver. Desuden kan fænotypen og funktionen af T-celler nemt analyseres.Viser proceduren vil være Mary Christopher, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium. For at fremkalde kloning af T-celler skal du bruge posespidsen med den nålefri ventil til at åbne en bestrålet buffy frakkepose i en laminar flow hætte. Overfør op til 50 milliliter blod fra posen til en T-150 kolbe, og tilsæt 70 milliliter PBS til kolben.Lag forsigtigt 30 milliliter af det fortyndede blod på 20 milliliter densitetsgradient i hver af fire 50 milliliter koniske rør, og adskil cellerne ved densitetsgradientcentrifugering. Stør forsigtigt supernatanten, og overfør PBMC fra hvert rør til et enkelt nyt 50 milliliterrør. Brug PBS til at bringe det endelige volumen til 50 milliliter og indsamle PBMC ved centrifugering.Efter en anden vask under de samme forhold suspenderes de isolerede fødeceller i 10 milliliter cellekulturmedie til tælling og tilsæt 25 milliliter af et 70 milliliter cellekulturmedie suppleret med 50 enheder IL-2 opløsning i hvert af to 50 milliliterrør. Derefter tilsættes feederceller til et rør ved en 2 af 10 til 6. celler pr. milliliter cellekulturmedie suppleret med IL-2 koncentration. For at oprette en T-lymfocytkultur skal T-celleklonen, der indeholder supernatanter fra stenotisk ventilprøvekolbe, samles i et enkelt 50 milliliterrør og opsamle cellerne ved centrifugering.Vask pellet tre gange i 50 milliliter PBS pr vask, før genoplive cellerne i 1 milliliter cellekultur medium til optælling. Fortynd cellerne til en 1 med 10 til 3. celler pr. milliliterkoncentration, og tilsæt 500 mikroliter celler til røret af cellekulturmedie suppleret med IL-2 uden feederceller. Tilsæt feeder celle suspension til en plastik 100 af 15 milliliter Petriskål, og tilsæt 100 mikroliter af feeder celler til hver brønd af det passende antal U-bund 96-brønd plader til eksperimentet.Tilsæt derefter T-cellerne til en petriskål, og tilsæt 100 mikroliter af T-celler til hver fødecelle suppleret godt i en uges inkubation i cellekulturinkubatoren. PBMC-isolationen er afgørende for at opnå feederceller og muliggøre påvisning og karakterisering af infiltrerende leukocytter i aortaklappenprøver. Efter to ugers inkubation kan en klon T-cellepopulation opnås.Her er gating ordningen for at analysere T-celle delpopulationer hos patienter med brændværdi aortaklappen sygdom vises. Som observeret hos denne patient var der flere CD4+T-celler end CD8+T-celler. Flow cytometrisk analyse af uncloned T-celler bekræfter, at de samme T-celle markører er til stede i både indfødte ventil og klon prøver.Samlet set indikerer disse data, at T-celler er til stede i forkalkede aortaventiler med CD45 +leukocytter, hvilket tyder på, at brændværdi aortaklappen sygdom er forbundet med aktivering af immunsystemet og inflammatorisk aktivitet. Denne metode er meget alsidig. Det kan anvendes på forskellige protokoller, som forsker skal være i stand til at isolere celler fra et væv, for den funktionelle karakterisering.Husk, at det er vigtigt at arbejde under sterile forhold for at undgå forurening og kritisk observere cellerne under mikroskopet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering af inducerede regulatoriske T-celler fra primære humane naive og memory T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering af lymfocytter fra Mouse Genital Tract mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolering og immunfarvning Lymfocytter og dendritiske celler fra murine Peyerske plaks

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering og Th17 Differentiering af Naïve CD4 T-lymfocytter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering af Double Negative αβ T-celler fra nyren

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In vitro Generation af murint Plasmacytoide dendritiske celler fra fælles Lymfoid progenitorer ved hjælp af AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokol for B og T lymfocytter fra Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...