Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Alle für dieses Protokoll verwendeten Mantelbeutel wurden dank der Verfügbarkeit von Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer und dem gesamten Team der Radiologie der Charité Benjamin Franklin bestrahlt. Stipendiatin/Mary Roxana Christopher, diese Arbeit wird durch ein Stipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie (DGK) unterstützt.

Die Studie wurde gemäß der Satzung der Charité zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis durchgeführt und die gesetzlichen Richtlinien und Bestimmungen zu Datenschutz und Ethik wurden eingehalten. Die Ethikkommission genehmigte alle Menschenversuche und die Privatsphäre und Anonymität der Patienten wurden in Übereinstimmung mit den auf dem Ethikformular angegebenen Regeln gewahrt.
HINWEIS: Für das unten beschriebene Protokoll wurden frische humanstenotische Klappenproben verwendet....

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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

Hier stellen wir eine Methode zur Charakterisierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen vor, die aus stenotischen Aortenklappenproben isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode erfordert die Verwendung von bestrahltem Buffy Coat, um die PBMCs zu isolieren. Die Strahlungsfrequenz, der die Buffy-Coat-Beutel ausgesetzt werden müssen, beträgt 9000 Rad/90 Gray (Gy) und stellt einen entscheidenden Schritt dar, um die Proliferation der Feederzellen zu stoppen. Die Rolle der aus den Buffy-Coat-Beuteln isolierte...

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine der häufigsten Herzklappenerkrankungen mit starken Auswirkungen auf das Gesundheitswesen. Die Häufigkeit des Aortenklappenersatzes hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und wird aufgrund der wachsenden älteren Bevölkerung voraussichtlich weiter zunehmen1.
Die zugrunde liegende Pathophysiologie der CAVD ist nur teilweise bekannt und die aktuellen therapeutischen Strategien beschränken sich auf konservative Maßnahmen oder Aortenklappenersatz, entweder durch chirurgische oder perkutane Verfahren. Bis heute kann keine wirksame medizinische Behandlung das Fortschreiten der CAVD behindern oder umkehren, und eine hohe Mortalität ist mit einem frühen Symptombeginn verbunden, es sei denn, es wird ein Aortenklappenersatz (AVR) durchgeführt2. Bei Patienten mit schwerer symptomatischer Aortenstenose wurde das symptomfreie 3-Jahres-Überleben von nur 20%3 berichtet. Der Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) stellt eine neue Option dar, die die Behandlung von Hochrisikopatienten, insbesondere bei älteren Menschen, revolutioniert und die Mortalität, die in dieser Population an sich hoch war, dramatisch gesenkt hat4,5,6. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse von TAVR ist weitere Forschung notwendig, um die CAVD-Pathophysiologie zu verstehen, um neue frühe therapeutische Ziele zu identifizieren7,8,9.
CAVD, das früher als passiver, degenerativer Prozess angesehen wurde, wird heute als aktive progressive Erkrankung anerkannt, die durch einen osteoblastischen Phänotypschalter der Aortenklappen-Interstitialzellen gekennzeichnet ist10. Diese Krankheit beinhaltet eine fortschreitende Mineralisierung, fibrokalzische Veränderungen und eine verminderte Motilität der Aortenklappenblättchen (Sklerose), die letztendlich den Blutfluss behindern, was zu einer Verengung (Stenose) der Aortenklappenöffnung führt11.
Entzündung gilt als ein Schlüsselprozess in der CAVD-Pathophysiologie, ähnlich dem Prozess der vaskulären Atherosklerose. Endothelschäden ermöglichen die Ablagerung und Akkumulation von Lipidspezies, insbesondere von oxidierten Lipoproteinen in der Aortenklappe12. Diese oxidierten Lipoproteine provozieren eine Entzündungsreaktion, da sie zytotoxisch sind, wobei die entzündliche Aktivität zu einer Mineralisierung führt. Die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunität bei der CAVD-Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit wurde kürzlich hervorgehoben13. Die Aktivierung und klonale Expansion spezifischer Untergruppen von Gedächtnis-T-Zellen wurde bei Patienten mit CAVD und mineralisierten Aortenklappenblättchen dokumentiert, so dass angenommen wird, dass entzündliche Prozesse zumindest an der Entstehung von CAVD und vermutlich auch am Krankheitsverlauf beteiligt sind14. Obwohl Antigen-präsentierende Zellen und Makrophagen sowohl in der gesunden als auch in der erkrankten Klappe vorhanden sind, deutet das Vorhandensein von T-Lymphozyten auf eine gealterte und erkrankte Aortenklappe hin. Dieses lymphozytäre Infiltrat zusammen mit einer Zunahme der Neovaskularisation und Metaplasie sind charakteristische histologische Anzeichen von CAVD15.
Wir stellen die Hypothese auf, dass es eine Wechselwirkung zwischen den Aortenklappen-Interstitialzellen und der Aktivierung des Immunsystems gibt, die möglicherweise die Initiierung eines chronischen Entzündungsprozesses in der Aortenklappe auslöst. Das Assaying von T-Zellen aus stenotischem Aortenklappengewebe könnte ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Verkalkungsentwicklung zu klären, da es eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo liefern kann. In der vorliegenden Arbeit isolieren wir unter Verwendung von Aortenklappengewebe T-Lymphozyten, kultivieren und klonen sie und charakterisieren sie anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Frische Aortenklappenproben wurden von CAVD-Patienten entnommen, die einen chirurgischen Klappenersatz für schwere Aortenstenose erhielten. Nach der chirurgischen Exzision wurde die frische Klappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Zellen wurden kultiviert, kloniert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Daten können verwendet werden, um Veränderungen in der T-Lymphozytenverteilung im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Untergruppen von Interesse zu bewerten.
Die Extraktion von verkalktem Gewebe, die Isolierung von Leukozyten aus verkalktem Gewebe und insbesondere die Verwendung von Durchflusszytometrie an dieser Art von Gewebe kann aufgrund von Problemen wie Autofluoreszenz eine Herausforderung darstellen. Es gibt nur wenige Publikationen mit Protokollen für diesen speziellen Zweck16,17,18. Hierin stellen wir ein Protokoll vor, das speziell für die direkte Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten aus menschlichen Aortenklappenproben entwickelt wurde. Klonale Expansion von Lymphozyten ist ein Kennzeichen der adaptiven Immunität. Die Untersuchung dieses Prozesses in vitro liefert aufschlussreiche Informationen über die Heterogenität der Lymphozyten19. Nach einer dreiwöchigen Inkubationszeit sind die T-Zell-Klone bereit für die Explantation, da aus jedem Klon eine ausreichende Menge an T-Zellen gewonnen wurde, um die phänotypische und funktionelle Untersuchung zu ermöglichen. Anschließend wird der Phänotyp von T-Klonen mittels Zytofluorometrie untersucht.
Dieses immunologische Protokoll ist eine Adaption einer Methode, die zuvor von Amedei et al. zur Isolierung und Charakterisierung von T-Zellen aus menschlichem Gewebe entwickelt wurde und speziell für verkalktes menschliches Gewebe entwickelt wurde, wie in CAVD20,21,22. Das Protokoll hier für die Isolierung von PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) unter Verwendung von bestrahltem Buffy Coat beschreibt einen effektiven Weg, um Feederzellen (FC) zu erhalten, die speziell auf die Klonphase von T-Lymphozyten eingestellt sind, die aus ventilinterstitiellen Zellen isoliert wurden. Die Feederschicht besteht aus im Wachstum gestoppten Zellen, die noch lebensfähig und bioaktiv sind. Die Rolle von Feederzellen ist wichtig, um das In-vitro-Überleben und das Wachstum von T-Lymphozyten zu unterstützen, die aus Ventil-Interstitialzellen isoliert wurden23. Um die Proliferation von Feederzellen in Kultur zu vermeiden, müssen diese Zellen einen Wachstumsstillstand durchlaufen. Dies kann auf zwei Arten erreicht werden: durch physikalische Methoden wie Bestrahlung oder durch die Behandlung mit zytotoxischen Chemikalien wie Mitomycin C (MMC), einem antitumoralen Antibiotikum, das direkt auf die Kulturoberfläche aufgetragen werden kann24. Hier zeigen wir den Stopp des Feederzellwachstums, der durch Zellbestrahlung erreicht wird.
Diese Methode stellt eine effiziente, kostengünstige Möglichkeit dar, T-Zellen aus Aortenklappengewebe zu isolieren und zu charakterisieren, was dazu beiträgt, das Spektrum immunologischer Methoden zur Erforschung der CAVD-Pathophysiologie zu erweitern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD), ein aktiver Krankheitsprozess, der von einer leichten Verdickung der Klappe bis hin zu schwerer Verkalkung reicht, ist trotz neuer Therapieoptionen wie dem Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) mit einer hohen Mortalität verbunden. 
Die kompletten Wege, die mit der Klappenverkalkung beginnen und zu einer schweren Aortenstenose führen, bleiben nur teilweise verstanden. Durch eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo könnte die Untersuchung von T-Lymphozyten aus stenotischem Klappengewebe ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Entwicklung der Verkalkung zu klären. Nach der chirurgischen Exzision wird die frische Aortenklappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Lymphozyten werden kultiviert, kloniert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.
Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können auch mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Ergebnisse können verwendet werden, um Änderungen der T-Zell-Konzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Subtypen von Interesse zu bewerten. In dieser Studie zeigen wir die Isolierung von T-Zellen, die an frisch verkalkten Aortenklappenproben durchgeführt wurden, und die Schritte der Analyse von T-Zell-Klonen mittels Durchflusszytometrie, um die Rolle der adaptiven Immunität in der CAVD-Pathophysiologie besser zu verstehen.

Wir verwendeten eine einfache und kostengünstige Methode, um die Leukozytenpopulation von frischen Aortenklappenproben von menschlichen Patienten mit schwerer Aortenklappenstenose zu charakterisieren (siehe Protokoll). Die Methode zur Isolierung von PBMCs ist ein wichtiger Schritt bei der Gewinnung von Feederzellen, die in jedem Schritt des Experiments (Klonierungs-, Nachfütterungs- und Spaltungsphasen) verwendet werden und den Nachweis und die Charakterisierung infiltrierender Leukozyten in Aortenklappenproben ermögl...

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Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen. Die Klonphase ermöglicht es, eine größere Anzahl von T-Klonen aus frischen Proben zu gewinnen. Darüber hinaus können der Phänotyp und die Funktion von T-Zellen leicht analysiert werden.Das Verfahren wird Mary Christopher, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren. Um das Klonen von T-Zellen zu induzieren, verwenden Sie den Beutelspike mit dem nadelfreien Ventil, um einen bestrahlten Buffy-Coat-Beutel in einer Laminar-Flow-Haube zu öffnen. Bis zu 50 Milliliter Blut aus dem Beutel in einen T-150-Kolben geben und 70 Milliliter PBS in den Kolben geben.Schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter des verdünnten Blutes auf 20 Milliliter Dichtegradient in jedem der vier 50 Milliliter konischen Röhrchen und trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und übertragen Sie das PBMC von jedem Rohr in ein einziges neues 50-Milliliter-Rohr. Verwenden Sie PBS, um das Endvolumen auf 50 Milliliter zu bringen und das PBMC durch Zentrifugation zu sammeln.Nach einer zweiten Wäsche unter den gleichen Bedingungen werden die isolierten Feederzellen zur Zählung in 10 Milliliter Zellkulturmedium suspendiert und 25 Milliliter eines 70 Milliliter Zellkulturmediums, ergänzt mit 50 Einheiten IL-2-Lösung, in jeweils zwei 50-Milliliter-Röhrchen gegeben. Dann fügen Sie Feederzellen zu einem Röhrchen mit einer 2 x 10 bis 6. Zelle pro Milliliter Zellkulturmedium hinzu, ergänzt mit IL-2-Konzentration. Um eine T-Lymphozytenkultur einzurichten, poolen Sie den T-Zell-Klon, der Überstände aus dem stenotischen Klappenprobenkolben enthält, in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Waschen Sie das Pellet dreimal in 50 Milliliter PBS pro Wäsche, bevor Sie die Zellen in 1 Milliliter Zellkulturmedium zur Zählung wiederverwenden. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 10 bis 3. Zellen pro Milliliter und geben Sie 500 Mikroliter Zellen in das Röhrchen aus Zellkulturmedium, das mit IL-2 ohne Feederzellen ergänzt wird. Geben Sie die Feederzellensuspension in eine 100 x 15 Milliliter große Petrischale aus Kunststoff und geben Sie 100 Mikroliter Feederzellen zu jeder Vertiefung der entsprechenden Anzahl von U-Bottom-96-Well-Platten für das Experiment hinzu.Dann geben Sie die T-Zellen in eine Petrischale und fügen Sie 100 Mikroliter T-Zellen zu jeder Feederzelle hinzu, die für eine einwöchige Inkubation im Zellkultur-Inkubator gut ergänzt wird. Die PBMC-Isolierung ist entscheidend für die Gewinnung von Feederzellen und ermöglicht den Nachweis und die Charakterisierung von infiltrierenden Leukozyten in Aortenklappenproben. Nach zwei Wochen Inkubation kann eine Klon-T-Zell-Population erhalten werden.Hier wird das Gating-Schema zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit kalzifischer Aortenklappenerkrankung gezeigt. Wie bei diesem Patienten beobachtet, gab es mehr CD4+T-Zellen als CD8+T-Zellen. Die durchflusszytometrische Analyse von nicht geklonten T-Zellen bestätigt, dass die gleichen T-Zell-Marker sowohl in nativen Klappen- als auch in Klonproben vorhanden sind.Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass T-Zellen in verkalkten Aortenklappen mit CD45 + Leukozyten vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass eine kalzitive Aortenklappenerkrankung mit der Aktivierung des Immunsystems und der Entzündungsaktivität verbunden ist. Diese Methode ist sehr vielseitig. Es kann auf verschiedene Protokolle angewendet werden, für die Forscher in der Lage sein müssen, Zellen aus einem Gewebe für die funktionelle Charakterisierung zu isolieren.Denken Sie daran, dass es wichtig ist, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um eine Kontamination zu vermeiden und die Zellen unter dem Mikroskop kritisch zu beobachten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Gerichtete Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen in Richtung T-Lymphozyten

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effiziente Isolation Protokoll für die B- und T-Lymphozyten von Menschengaumenmandeln

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...