Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Tutti i sacchetti di buffy coat utilizzati per questo protocollo sono stati irradiati grazie alla disponibilità del Dr. Peter Rosenthal, del Dr. Dirk Böhmer e di tutto il team del Dipartimento di Radiologia di Charité Benjamin Franklin. Borsista / Mary Roxana Christopher, questo lavoro è supportato da una borsa di studio della German Cardiac Society (DGK).

Lo studio è stato condotto secondo lo Statuto della Charité for Ensuring Good Scientific Practice e sono state rispettate le linee guida e le disposizioni legali in materia di privacy ed etica. Il Comitato Etico ha approvato tutti gli esperimenti umani e la privacy e l'anonimato dei pazienti sono stati mantenuti in conformità con le regole riportate sul Modulo Etico.
NOTA: Per il protocollo descritto di seguito sono stati utilizzati campioni di valvola stenotica umana fresca.
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<ol>
	<li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+valvular+heart+diseases:+a+population-based+study.">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li><li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aortic+valve+calcification,+as+measured+by+MDCT,+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis:+results+of+an+international+registry+study.">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li><li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+outcome+in+severe,+asymptomatic+aortic+stenosis.">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li><li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis:+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement:+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR.">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li><li>Figulla, H. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications.">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li><li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays.">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li><li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property.">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H+,+K++--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity.">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li><li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

Qui presentiamo un metodo per caratterizzare le sottopopolazioni di linfociti T isolate da campioni di valvola aortica stenotica, utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo richiede l'uso di buffy coat irradiato per isolare i PBMC. La frequenza di radiazione a cui devono essere sottoposte le borse buffy coat è di 9000 Rad/90 Gray (Gy) e rappresenta un passo cruciale per arrestare la proliferazione delle cellule di alimentazione. Il ruolo delle cellule isolate dai sacchetti di buffy coat è quello di agire solo co...

La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è uno dei disturbi valvolari cardiaci più comuni, con un forte impatto sull'assistenza sanitaria. La frequenza di sostituzione della valvola aortica negli ultimi anni è aumentata drasticamente e si prevede che aumenterà ulteriormente, a causa della crescente popolazione anziana1.
La fisiopatologia sottostante della CAVD è solo parzialmente nota e le attuali strategie terapeutiche sono limitate a misure conservative o alla sostituzione della valvola aortica, sia attraverso procedure chirurgiche che percutanee. Ad oggi, nessun trattamento medico efficace può ostacolare o invertire la progressione della CAVD e un'elevata mortalità è associata all'insorgenza precoce dei sintomi, a meno che non venga eseguita la sostituzione della valvola aortica (AVR)2. Nei pazienti con stenosi aortica sintomatica grave, la sopravvivenza libera da sintomi a 3 anni è stata riportata a partire dal 20%3. La sostituzione transcatetere della valvola aortica (TAVR) rappresenta una nuova opzione, rivoluzionando il trattamento per i pazienti ad alto rischio, specialmente tra gli anziani e ha ridotto drasticamente la mortalità, che era intrinsecamente alta in questa popolazione4,5,6. Nonostante i risultati promettenti della TAVR, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere la fisiopatologia della CAVD per identificare nuovi bersagli terapeutici precoci7,8,9.
Precedentemente pensato per essere un processo passivo e degenerativo, la CAVD è ora riconosciuta come una malattia progressiva attiva, caratterizzata da un interruttore fenotipico osteoblastico delle cellule interstiziali della valvola aortica10. Questa malattia comporta una progressiva mineralizzazione, cambiamenti fibrocalcifici e una ridotta motilità dei foglietti della valvola aortica (sclerosi), che alla fine ostruiscono il flusso sanguigno portando al restringimento (stenosi) dell'apertura della valvola aortica11.
L'infiammazione è considerata un processo chiave nella fisiopatologia CAVD, simile al processo di aterosclerosi vascolare. La lesione endoteliale consente la deposizione e l'accumulo di specie lipidiche, in particolare lipoproteine ossidate nella valvola aortica12. Queste lipoproteine ossidate provocano una risposta infiammatoria, in quanto citotossiche, con l'attività infiammatoria che porta alla mineralizzazione. Il ruolo dell'immunità innata e adattativa nello sviluppo della CAVD e nella progressione della malattia è stato recentemente evidenziato13. L'attivazione e l'espansione clonale di specifici sottoinsiemi di cellule T di memoria sono state documentate in pazienti con CAVD e lembi valvolari aortici mineralizzati, in modo che si presume che i processi infiammatori siano coinvolti almeno nello sviluppo di CAVD e presumibilmente anche nella progressione della malattia14. Infatti, sebbene le cellule e i macrofagi che presentano l'antigene siano presenti sia nella valvola sana che in quella malata, la presenza di linfociti T è indicativa di una valvola aortica invecchiata e malata. Questo infiltrato linfocitico insieme ad un aumento della neovascolarizzazione e della metaplasia sono segni istologici caratteristici di CAVD15.
Ipotizziamo l'esistenza di un'interazione tra le cellule interstiziali della valvola aortica e l'attivazione del sistema immunitario, che potenzialmente innesca l'avvio di un processo infiammatorio cronico nella valvola aortica. Il dosaggio delle cellule T dal tessuto della valvola aortica stenotica potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione, in quanto può fornire una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo. Nel presente lavoro, utilizzando il tessuto valvolare aortico, isoliamo i linfociti T, li colturamo e li cloniamo e successivamente li caratterizziamo utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Campioni freschi di valvola aortica sono stati asportati da pazienti con CAVD che hanno ricevuto la sostituzione chirurgica della valvola per stenosi aortica grave. Dopo l'escissione chirurgica, il campione di valvola fresco è stato sezionato in piccoli pezzi e le cellule T sono state coltivate, clonate e poi analizzate utilizzando la citometria a flusso. La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono essere fissati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I dati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nella distribuzione dei linfociti T nel tempo in relazione all'intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottoinsiemi di cellule T di interesse.
L'estrazione del tessuto calcificato, l'isolamento dei leucociti dal tessuto calcificato e in particolare l'uso della citometria a flusso su questo tipo di tessuto possono essere impegnativi, a causa di problemi come l'autofluorescenza. Esistono poche pubblicazioni con protocolli per questo scopo specifico16,17,18. Qui presentiamo un protocollo progettato specificamente per l'isolamento diretto e la coltura di linfociti T da campioni di valvola aortica umana. L'espansione clonale dei linfociti è un segno distintivo dell'immunità adattativa. Lo studio di questo processo in vitro fornisce informazioni approfondite sul livello di eterogeneità dei linfociti19. Dopo un periodo di incubazione di tre settimane, i cloni di cellule T sono pronti per essere espiantati, in quanto è stata ottenuta una quantità adeguata di cellule T da ciascun clone, in modo da consentire lo studio fenotipico e funzionale. Successivamente il fenotipo dei cloni T viene studiato mediante citofluorometria.
Questo protocollo immunologico è un adattamento di un metodo precedentemente sviluppato da Amedei et al. per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule T da tessuto umano, appositamente progettato per il tessuto umano calcificato, come in CAVD20,21,22. Il protocollo qui per l'isolamento delle PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) utilizzando il buffy coat irradiato descrive un modo efficace per ottenere cellule feeder (FC), specificamente regolate per la fase di clonazione dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari. Lo strato di alimentazione è costituito da cellule arrestate dalla crescita, che sono ancora vitali e bioattive. Il ruolo delle cellule feeder è importante per supportare la sopravvivenza in vitro e la crescita dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari23. Al fine di evitare la proliferazione delle cellule di alimentazione in coltura, queste cellule devono subire un arresto della crescita. Ciò può essere ottenuto in due modi: attraverso metodi fisici come l'irradiazione o attraverso il trattamento con sostanze chimiche citotossiche, come la mitomicina C (MMC), un antibiotico antitumorale che può essere applicato direttamente sulla superficie di coltura24. Qui mostriamo l'arresto della crescita delle cellule di alimentazione ottenuto attraverso l'irradiazione cellulare.
Questo metodo presenta un modo efficiente ed economico per isolare e caratterizzare le cellule T dal tessuto valvolare aortico, contribuendo ad ampliare lo spettro dei metodi immunologici per esplorare la fisiopatologia CAVD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD), un processo di malattia attivo che va dal lieve ispessimento della valvola alla calcificazione grave, è associata a un'elevata mortalità, nonostante le nuove opzioni terapeutiche come la sostituzione della valvola aortica transcatetere (TAVR). 
I percorsi completi che iniziano con la calcificazione valvolare e portano a una grave stenosi aortica rimangono solo parzialmente compresi. Fornendo una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo, il dosaggio dei linfociti T dal tessuto valvolare stenotico potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione. Dopo l'escissione chirurgica, il campione di valvola aortica fresca viene sezionato in piccoli pezzi e i linfociti T vengono coltivati, clonati e quindi analizzati utilizzando la selezione cellulare attivata a fluorescenza (FACS).
La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono anche essere riparati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I risultati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nelle concentrazioni delle cellule T nel tempo in relazione all'intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottotipi di cellule T di interesse. In questo studio, mostriamo l'isolamento delle cellule T, eseguito su campioni di valvola aortica calcificata fresca e le fasi di analisi dei cloni di cellule T utilizzando la citometria a flusso per comprendere ulteriormente il ruolo dell'immunità adattativa nella fisiopatologia CAVD.

Abbiamo utilizzato un metodo semplice ed economico per caratterizzare la popolazione leucocitaria di campioni di valvole aortiche fresche derivate da pazienti umani con stenosi della valvola aortica grave (fare riferimento al protocollo). Il metodo per isolare le PBMC è un passo fondamentale per ottenere cellule feeder, che vengono utilizzate in ogni fase dell'esperimento (fasi di clonazione, rialimentazione e scissione) e consentono il rilevamento e la caratterizzazione dei leucociti infiltrati nei campioni di valvola ...

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Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

In questo studio, descriviamo il processo di isolamento dei linfociti T da campioni freschi di valvole aortiche calcificate e le fasi analitiche della clonazione delle cellule T per la caratterizzazione dei sottoinsiemi di leucociti adattivi utilizzando l'analisi citometrica a flusso.

Studio della calcificazione della valvola aortica tramite isolamento e coltura di linfociti T utilizzando cellule feeder da Buffy Coat irradiato

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Questo protocollo è facile da eseguire. La fase di clonazione consente di ottenere un numero maggiore di cloni T da campioni freschi. Inoltre, il fenotipo e la funzione delle cellule T possono essere facilmente analizzati.A dimostrare la procedura sarà Mary Christopher, una dottoranda del mio laboratorio. Per indurre la clonazione delle cellule T, utilizzare la punta del sacchetto con la valvola priva di ago per aprire una sacca di buffy coat irradiata in una cappa a flusso laminare. Trasferire fino a 50 millilitri di sangue dalla sacca in un pallone T-150 e aggiungere 70 millilitri di PBS al pallone.Stratificare con cura 30 millilitri di sangue diluito su 20 millilitri di gradiente di densità in ciascuno dei quattro tubi conici da 50 millilitri e separare le cellule mediante centrifugazione a gradiente di densità. Aspirare accuratamente il surnatante e trasferire il PBMC da ciascun tubo in un unico nuovo tubo da 50 millilitri. Utilizzare PBS per portare il volume finale a 50 millilitri e raccogliere il PBMC mediante centrifugazione.Dopo un secondo lavaggio nelle stesse condizioni, sospendere le celle di alimentazione isolate in 10 millilitri di terreno di coltura cellulare per il conteggio e aggiungere 25 millilitri di un terreno di coltura cellulare da 70 millilitri integrato con 50 unità di soluzione di IL-2 in ciascuno dei due tubi da 50 millilitri. Quindi aggiungere le cellule di alimentazione a un tubo a 2 per 10 alla 6a cella per millilitro di terreno di coltura cellulare integrato con concentrazione di IL-2. Per impostare una coltura di linfociti T, raggruppare il clone di cellule T contenente supernatanti dal pallone campione della valvola stenotica in un singolo tubo da 50 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Lavare il pellet tre volte in 50 millilitri di PBS per lavaggio, prima di risospendere le celle in 1 millilitro di terreno di coltura cellulare per il conteggio. Diluire le cellule a una concentrazione di 1 per 10 a 3 cellule per millilitro e aggiungere 500 microlitri di cellule al tubo del terreno di coltura cellulare integrato con IL-2 senza cellule di alimentazione. Aggiungere la sospensione della cella di alimentazione a una capsula di Petri di plastica da 100 per 15 millilitri e aggiungere 100 microlitri di celle di alimentazione a ciascun pozzetto del numero appropriato di piastre a 96 pozzetti con fondo a U per l'esperimento.Quindi aggiungere le cellule T a una capsula di Petri e aggiungere 100 microlitri di cellule T a ciascuna cellula di alimentazione integrata bene per un'incubazione di una settimana nell'incubatore di colture cellulari. L'isolamento PBMC è vitale per ottenere cellule di alimentazione e consentire il rilevamento e la caratterizzazione di leucociti infiltrati in campioni di valvola aortica. Dopo due settimane di incubazione, è possibile ottenere una popolazione di cellule T clone.Qui, viene mostrato lo schema di gating per l'analisi delle sottopopolazioni di cellule T in pazienti con malattia della valvola aortica calcifica. Come osservato in questo paziente, c'erano più cellule CD4 + T rispetto alle cellule CD8 + T. L'analisi citometrica a flusso di cellule T non clonate conferma che gli stessi marcatori di cellule T sono presenti sia in campioni di valvole native che di cloni.Presi insieme, questi dati indicano che le cellule T sono presenti nelle valvole aortiche calcificate con leucociti CD45 +, suggerendo che la malattia della valvola aortica calcifica è legata all'attivazione del sistema immunitario e all'attività infiammatoria. Questo metodo è molto versatile. Può essere applicato a diversi protocolli per i quali il ricercatore deve essere in grado di isolare le cellule da un tessuto, per la caratterizzazione funzionale.Tieni presente che è importante lavorare in condizioni sterili per evitare la contaminazione e osservare criticamente le cellule al microscopio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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