Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

このプロトコルに使用されるすべてのバフィーコートバッグは、ピーター・ローゼンタール博士、ダーク・ベーマー博士、シャリテ・ベンジャミン・フランクリン放射線科のチーム全体の可用性のおかげで照射されました。奨学金ホルダー/メアリー・ロクサーナ・クリストファー、この作品はドイツ心臓協会(DGK)からの奨学金によって支えられます。

この研究は、良い科学的実践を保証するための慈善団体の法令に従って行われ、プライバシーと倫理に関する法的ガイドラインと規定が尊重されました。倫理委員会は、すべての人間の実験を承認し、患者のプライバシーと匿名性は、倫理フォームに報告された規則に従って維持されました。
注:以下に説明するプロトコルについては、新鮮なヒトステノティックバルブ?...

<ol>
	<li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+valvular+heart+diseases:+a+population-based+study.">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li><li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aortic+valve+calcification,+as+measured+by+MDCT,+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis:+results+of+an+international+registry+study.">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li><li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+outcome+in+severe,+asymptomatic+aortic+stenosis.">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li><li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis:+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement:+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR.">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li><li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+(TAVI)-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development.">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li><li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAVI+for+low-flow,+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction:+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+(GARY).">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li><li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+(TAVI).">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation:+"on-label"+versus+"off-label"+use+of+TAVR+devices.">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+valve-in-valve+implantation+(VinV-TAVR)+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves.">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li><li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+Aortic+Valve+Disease:+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches.">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves.">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li><li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphocyte+infiltration,+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis.">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li><li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells.">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li><li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease.">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li><li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta:+Study+protocol.">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).</li><li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis.">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li><li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes.">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma.">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology &amp; Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer.">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Different+Functional+Distribution+of+"Not+Effector"+T+Cells+(Treg/Tnull)+in+Colorectal+Cancer.">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).</li><li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications.">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li><li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays.">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li><li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property.">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H+,+K++--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity.">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li><li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

ここでは、フローサイトメトリーを用いて、ステノスティック大動脈弁サンプルから分離されたTリンパ球亜集団を特徴付ける方法を提示する。この方法では、PBMCを分離するために照射されたバフィーコートを使用する必要があります。バフィーコートバッグが受け取らなければならない放射線周波数は9000 Rad/ 90 Gray(Gy)であり、フィーダー細胞の増殖を止める重要なステップを表しています?...

カルシフィック大動脈弁疾患(CAVD)は、医療に大きな影響を与える最も一般的な心臓弁障害の1つです。ここ数年の大動脈弁置換の頻度は劇的に増加しており、高齢者人口の増加によりさらに増加すると予想される1。
CAVDの基礎となる病態生理学は部分的にしか知られておらず、現在の治療戦略は外科的または経皮的処置を通じて、保守的な措置または大動脈弁置換に限定されている。現在までに、効果的な治療は、大動脈弁置換(AVR)が行われない限り、CAVD進行を妨げたり逆転させたりすることはなく、早期の症状発症に関連する高い死亡率は2である。重度の症候性大動脈狭窄症の患者では、3年間の症状のない生存率は20%3と報告された。経カテーテル大動脈弁置換術(TAVR)は、特に高齢者の間でリスクの高い患者の治療に革命を起こし、この人口で本質的に高かった死亡率を劇的に減少させた新しい選択肢を表す4,5,6。TAVRの有望な結果にもかかわらず、CAVD病態生理学を理解して新たな早期治療目標を同定するためには、さらなる研究が必要である7,8,9.
以前は受動的で変性プロセスであると考えられていたCAVDは、現在、大動脈弁間質細胞10の骨芽細胞表現型スイッチによって特徴付けられる活性進行性疾患として認識されている。この疾患は、進行性の塩分化、線維性変化および大動脈弁リーフレット(硬化症)の運動性の低下を伴い、最終的には大動脈弁開口部11の狭窄(狭窄)につながる血流を妨げる。
炎症は、血管アテローム性動脈硬化症のプロセスと同様に、CAVD病態生理学における重要なプロセスと考えられている。内皮損傷は、脂質種の沈着および蓄積、特に大動脈弁12における酸化リポタンパク質を可能にする。これらの酸化リポタンパク質は、細胞毒性を持ち、炎症性活性が鉱化につながるため、炎症反応を引き起こす。CAVDの発症および疾患進行における先天性免疫および適応免疫の役割が最近強調されている13.メモリT細胞の特定のサブセットの活性化およびクローン拡張は、CAVDおよびミネラル化大動脈弁リーフレットを有する患者において文書化されており、炎症プロセスは少なくともCAVDの発症およびおそらく同様に疾患進行に関与すると仮定される。実際、抗原提示細胞とマクロファージは健康で病気の弁の両方に存在するが、Tリンパ球の存在は、老化し、病気の大動脈弁を示す。このリンパ球浸潤は、新血管新生および転移の増加とともに、CAVD15の特徴的な組織学的徴候である。
大動脈弁間質細胞と免疫系の活性化との相互作用の存在を仮説し、大動脈弁における慢性炎症プロセスの開始を引き起こす可能性がある。ステノスティック大動脈弁組織からのT細胞のアッシングは、生体内の大動脈弁細胞の密接な表現を提供することができるので、石灰化の発達におけるその役割を明確にする効率的な方法である可能性がある。本研究では、大動脈弁組織を用いて、Tリンパ球を単離し、培養し、それらをクローン化し、その後蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてそれらを特徴付ける。新鮮な大動脈弁サンプルは、重度の大動脈狭窄症の外科的弁置換術を受けたCAVD患者から切除された。外科的切除後、新鮮な弁サンプルを小片で解剖し、T細胞を培養し、その後、フローサイトメトリーを用いて分析した。染色手順は簡単で、染色チューブはパラホルムアルデヒドの0.5%を使用して固定し、15日後まで分析することができます。染色パネルから生成されたデータは、介入に関連して時間の経過とともにTリンパ球分布の変化を追跡するために使用することができ、関心のある特定のT細胞サブセットの活性化状態を評価するために容易に開発することができる。
石灰化組織の抽出、石灰化組織からの白血球の単離、特にこのタイプの組織に対するフローサイトメトリーの使用は、自己蛍光などの問題のために困難であり得る。この特定の目的のためのプロトコルを持つ出版物はほとんど存在しません16,17,18。本明細書では、ヒト大動脈弁試料からのTリンパ球の直接単離および培養のために特別に設計されたプロトコルを提示する。リンパ球のクローン拡張は、適応免疫の特徴である。このプロセスをインビトロで研究することは、リンパ球異遺伝子性19のレベルに関する洞察に満ちた情報を提供する。3週間のインキュベーション期間の後、T細胞クローンは、各クローンから十分な量のT細胞が得られたように、表現型および機能的研究を可能にするように、剥離する準備ができている。続いてTクローンの表現型をサイトフルオロメトリーで研究する。
この免疫学的プロトコルは、ヒト組織からのT細胞の単離および特徴付けのためにAmedeiらによって以前に開発された方法の適応であり、特にCAVD20、21,22のような石灰化ヒト組織のために設計されている。照射されたバフィーコートを用いたPBMC(末梢血単核細胞)の単離のためのプロトコルは、弁間質細胞から分離されたTリンパ球のクローニング段階に特異的に調整されたフィーダー細胞(FC)を得る有効な方法を説明する。フィーダー層は、増殖で構成され、未だに生存可能で生理活性である。フィーダー細胞の役割は、弁間質細胞23から分離されたTリンパ球のインビトロ生存および増殖を支えるために重要である。培養中のフィーダー細胞増殖を避けるために、これらの細胞は増殖停止を受けなければならない。これは、照射などの物理的方法を通じて、または細胞毒性化学物質(例えば、マイトマイシンC(MMC)、培養表面24に直接適用することができる抗腫瘍性抗生物質による治療を通じて、2つの方法で達成することができる。ここでは、細胞照射を通じて達成されたフィーダー細胞増殖停止を示す。
この方法は、大動脈弁組織からT細胞を分離し、特徴付ける効率的で費用対効果の高い方法を提示し、CAVD病態生理学を探索するための免疫学的方法のスペクトルを広げることに寄与する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

カルシフィック大動脈弁疾患(CAVD)は、弁の軽度の肥厚から重度の石灰化に至るまでの活動的な疾患プロセスであり、経カテーテル大動脈弁置換術(TAVR)のような新しい治療オプションにもかかわらず、高い死亡率に関連している。 
バルブ石灰化から始まり、重度の大動脈狭窄につながる完全な経路は、部分的にしか理解されていない。生体内で大動脈弁細胞を密接に表現することで、ステノスティック弁組織からのTリンパ球のアッシングは、石灰化の発展におけるその役割を明確にする効率的な方法となる可能性がある。外科的切除後、新鮮な大動脈弁サンプルを小片で解剖し、Tリンパ球を培養し、クローン化し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて分析する。
染色手順は簡単で、染色チューブも0.5%のパラホルムアルデヒドを使用して固定し、15日後まで分析することができます。染色パネルから生成された結果は、介入に関連して時間の経過とともにT細胞濃度の変化を追跡するために使用することができ、関心のある特定のT細胞サブタイプの活性化状態を評価するために容易に開発することができる。本研究では、新鮮な石灰化大動脈弁サンプルに対して行われるT細胞の単離と、CAVD病態生理学における適応免疫の役割をさらに理解するために、フローサイトメトリーを用いてT細胞クローンを分析するステップを示す。

我々は、重度の大動脈弁狭窄症を有するヒト患者由来の新鮮な大動脈弁サンプルの白血球集団を特徴付けるために、簡便で費用対効果の高い方法を用いた(プロトコル参照)。PBMCsを単離する方法は、実験のあらゆる段階(クローニング、再給餌および分割段階)で使用されるフィーダー細胞を得る上で重要なステップであり、大動脈弁サンプル中の浸潤性白血球の検出と特性評価を可能にします?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

本研究では、石灰化大動脈弁の新鮮なサンプルからのTリンパ球分離のプロセスと、フローサイトメトリー分析を用いた適応性白血球サブセットの特性評価のためのT細胞クローニングの分析ステップについて述べた。

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

このプロトコルは簡単に実行できます。クローニングフェーズでは、より多くのTクローンを新鮮なサンプルから得ることができます。また、T細胞の表現型や機能は容易に解析できる。手順を実証することは、私の研究室の博士課程の学生、メアリー・クリストファーです。T細胞クローニングを誘導するには、針のないバルブでバッグスパイクを使用して、ラミナーフローフードに照射されたバフィーコートバッグを開きます。袋から最大50ミリリットルの血液をT-150フラスコに移し、70ミリリットルのPBSをフラスコに加えます。希釈した血液の30ミリリットルを4つの50ミリリットル円錐形チューブのそれぞれで20ミリリットルの密度勾配に慎重に重ね、密度勾配遠心分離によって細胞を分離する。上清を慎重に吸引し、PBMCを各チューブから単一の新しい50ミリリットルチューブに移します。PBSを使用して最終容積を50ミリリットルにし、遠心分離によってPBMCを収集します。同じ条件で2回目の洗浄を行った後、単離されたフィーダー細胞を計数用の細胞培養培地10ミリリットルにサスペンドし、50単位のIL-2溶液を2本の50ミリリットルチューブのそれぞれに加えて70ミリリットルの細胞培養培地に25ミリリットルを加える。次に、2%10で1つのチューブにフィーダー細胞を加え、IL-2濃度で補った細胞培地の6ミリリットル当たりの細胞に10番目の細胞を添加する。Tリンパ球培養をセットアップするには、ステノティックバルブサンプルフラスコの上清を含むT細胞クローンを1本の50ミリリットルチューブにプールし、遠心分離によって細胞を回収する。ペレットを1回のPBS50ミリリットルで3回洗浄し、細胞を1ミリリットルの細胞培養培地で再懸濁させて計数する。細胞を1ミリリットル当たり3番目の細胞に10個に希釈し、フィーダー細胞なしでIL-2を添加した細胞培養培地のチューブに500マイクロリットルの細胞を加える。フィーダーセル懸濁液をプラスチック100、15ミリリットルのペトリ皿に加え、実験に適当な数のU-底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのフィーダーセルを追加します。その後、ペトリ皿にT細胞を加え、各フィーダー細胞に100マイクロリットルのT細胞を加え、細胞培養インキュベーターで1週間インキュベートを十分に補った。PBMCの単離は、フィーダー細胞を得るために不可欠であり、大動脈弁サンプル中の浸潤性白血球の検出と特性評価を可能にします。2週間のインキュベーションの後、クローンT細胞集団が得られる。ここで、石灰性大動脈弁疾患患者におけるT細胞亜集団を分析するための格子化スキームが示されている。この患者で観察されたように、CD8+T細胞よりも多くのCD4+T細胞があった。未クローンT細胞のフローサイトメトリクス分析は、同じT細胞マーカーがネイティブバルブとクローンサンプルの両方に存在することを確認します。これらのデータをまとめて、これらのデータは、Cd45+白血球を有する石灰化大動脈弁にT細胞が存在することを示し、石灰化大動脈弁疾患が免疫系の活性化および炎症活性と関連していることを示唆している。この方法は非常に汎用性があります。これは、研究者が組織から細胞を分離する必要があるさまざまなプロトコルに適用することができます, 機能的特性評価のために.汚染を避けるために無菌条件下で働き、顕微鏡下で細胞を批判的に観察することが重要であることを覚えておいてください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

マウス生殖管粘膜からのリンパ球の単離

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

腎臓からの二重否定αβT細胞の分離

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

ヒトパラティーノ扁桃腺からBおよびTリンパ球の効率的な単離プロトコール

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...