Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Todos os sacos de casacos polidos usados para este protocolo foram irradiados graças à disponibilidade do Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer e toda a equipe do Departamento de Radiologia de Charité Benjamin Franklin. Bolsista/Mary Roxana Christopher, este trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos da Sociedade Cardíaca Alemã (DGK).

O estudo foi realizado de acordo com o Estatuto do Charité para Assegurar boas Práticas Científicas e respeitadas as diretrizes legais e disposições sobre privacidade e ética. O Comitê de Ética aprovou todos os experimentos humanos e a privacidade e o anonimato dos pacientes foram mantidos de acordo com as regras relatadas no Formulário de Ética.
NOTA: Para o protocolo descrito abaixo foram utilizadas amostras frescas de válvulas estenóticas humanas.
1. Pr...

<ol>
	<li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+valvular+heart+diseases:+a+population-based+study.">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li><li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aortic+valve+calcification,+as+measured+by+MDCT,+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis:+results+of+an+international+registry+study.">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li><li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+outcome+in+severe,+asymptomatic+aortic+stenosis.">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li><li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis:+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement:+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR.">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li><li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+(TAVI)-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development.">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li><li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAVI+for+low-flow,+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction:+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+(GARY).">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li><li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+(TAVI).">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation:+"on-label"+versus+"off-label"+use+of+TAVR+devices.">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+valve-in-valve+implantation+(VinV-TAVR)+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves.">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li><li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes.">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma.">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology &amp; Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications.">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li><li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays.">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li><li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property.">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H+,+K++--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity.">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li><li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células ...

A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população idosa1.
A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão do CAVD e a alta mortalidade está associada ao início precoce dos sintomas, a menos que seja realizada a substituição da válvula aórtica (AVR). Em pacientes com estenose aórtica aórtica sintomática grave, a sobrevida sem sintomas de 3 anos foi relatada como baixa de 20%3. A substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR) representa uma nova opção, revolucionando o tratamento para pacientes de alto risco, especialmente entre os idosos e reduziu drasticamente a mortalidade, que era intrinsecamente alta nessa população4,5,6. Apesar dos resultados promissores do TAVR, novas pesquisas são necessárias para entender a fisiopatologia CAVD para identificar novos alvos terapêuticos precoces7,8,9.
Antes considerado um processo passivo e degenerativo, o CAVD é agora reconhecido como uma doença progressiva ativa, caracterizada por um interruptor de fenótipo osteoblástico das células intersticiais da válvula aórtica10. Esta doença envolve mineralização progressiva, alterações fibrocalcísicas e redução da motilidade dos folhetos da válvula aórtica (esclerose), que acabam por obstruir o fluxo sanguíneo levando ao estreitamento (estenose) da abertura da válvula aórtica11.
A inflamação é considerada um processo-chave na fisiopatologia CAVD, semelhante ao processo de aterosclerose vascular. A lesão endotelial permite a deposição e o acúmulo de espécies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas na válvula aórtica12. Essas lipoproteínas oxidadas provocam uma resposta inflamatória, por serem citotóxica, com a atividade inflamatória levando à mineralização. O papel da imunidade inata e adaptativa no desenvolvimento da CAVD e na progressão da doença foi recentemente destacado13. A ativação e a expansão clonal de subconjuntos específicos de células T de memória foram documentados em pacientes com CAVD e folhetos de válvulas aórticas mineralizados, de modo que os processos inflamatórios são assumidos como envolvidos pelo menos no desenvolvimento do CAVD e, presumivelmente, na progressão da doença também14. De fato, embora as células e macrófagos que apresentem antígenos estejam presentes tanto na válvula saudável quanto na doença, a presença de linfócitos T é indicativa de uma válvula aórtica envelhecida e doente. Este infiltrado linfocítico junto com um aumento na neovascularização e metaplasia são sinais histológicos característicos do CAVD15.
Nós hipótesemos a existência de uma interação entre as células interstices da válvula aórtica e a ativação do sistema imunológico, o que potencialmente desencadeia o início de um processo inflamatório crônico na válvula aórtica. O ensaio das células T a partir do tecido da válvula aórtica estótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação, pois pode fornecer uma representação próxima das células válvulas aórticas in vivo. No presente trabalho, utilizando tecido da válvula aórtica, isolamos linfócitos T, cultura e cloná-los, e posteriormente os caracterizamos usando a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS). Amostras frescas de válvulas aórticas foram excisadas de pacientes cavd que receberam substituição da válvula cirúrgica para estenose aórtica grave. Após a excisão cirúrgica, a amostra de válvula fresca foi dissecada em pequenos pedaços e as células T foram cultivadas, clonadas e então analisadas por citometria de fluxo. O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os dados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações na distribuição de linfócitos T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subconjuntos específicos de células T de interesse.
A extração de tecido calcificado, o isolamento de leucócitos do tecido calcificado e, particularmente, o uso de citometria de fluxo neste tipo de tecido podem ser desafiadores, devido a questões como a autofluorescência. Poucas publicações existem com protocolos para este propósito específico16,17,18. Aqui apresentamos um protocolo projetado especificamente para o isolamento direto e cultura do linfócito T a partir de amostras de válvulas aórticas humanas. A expansão clonal de linfócitos é uma marca registrada da imunidade adaptativa. Estudar esse processo in vitro fornece informações perspicazes sobre o nível de heterogeneidade linfócito19. Após um período de incubação de três semanas, os clones de células T estão prontos para serem explantados, pois uma quantidade adequada de células T de cada clone foi obtida, de modo a permitir o estudo fenotípico e funcional. Posteriormente, o fenótipo dos clones T é estudado por citofluorometria.
Este protocolo imunológico é uma adaptação de um método anteriormente desenvolvido pela Amedei et al. para isolamento celular T e caracterização do tecido humano, especialmente projetado para tecido humano calcificado, como em CAVD20,21,22. O protocolo aqui para o isolamento de PBMCs (células mononucleares de sangue periféricos) usando casaco de buffy irradiado descreve uma maneira eficaz de obter células alimentadoras (FC), especificamente ajustadas para a fase de clonagem de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula. A camada alimentador consiste em células presas em crescimento, que ainda são viáveis e bioativas. O papel das células alimentadoras é importante para apoiar a sobrevivência in vitro e o crescimento de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula23. Para evitar a proliferação de células alimentados na cultura, essas células devem sofrer uma parada de crescimento. Isso pode ser alcançado de duas maneiras: através de métodos físicos como a irradiação, ou através do tratamento com produtos químicos citotóxicos, como a mitomicina C (MMC), um antibiótico antitumoral que pode ser aplicado diretamente à superfície da cultura24. Aqui mostramos a prisão de crescimento celular alimentador alcançada através da irradiação celular.
Este método apresenta uma maneira eficiente e econômica de isolar e caracterizar células T a partir do tecido da válvula aórtica, contribuindo para a ampliação do espectro de métodos imunológicos para a exploração da fisiopatologia CAVD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR). 
As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).
O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.

Utilizamos um método simples e econômico para caracterizar a população leucócito de amostras frescas de válvulas aórticas derivadas de pacientes humanos com estenose de válvula aórtica grave (consulte o protocolo). O método de isolar os PBMCs é um passo vital na obtenção de células alimentadoras, que são usadas em todas as etapas do experimento (clonagem, realimentação e divisão de fases) e permitem a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Os passos-...

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Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.

Investigando a calcificação da válvula aórtica através do isolamento e cultura de linfócitos T usando células alimentadoras do casaco de buffy irradiado

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Este protocolo é fácil de executar. A fase de clonagem permite que um número maior de clones T seja obtido a partir de amostras frescas. Além disso, o fenótipo e a função das células T podem ser facilmente analisados.Demonstrando o procedimento estará Mary Christopher, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir a clonagem de células T, use o espeto do saco com a válvula livre de agulha para abrir um saco de casaco de buffy irradiado em uma capa de fluxo laminar. Transfira até 50 mililitros de sangue do saco para um frasco T-150, e adicione 70 mililitros de PBS ao frasco.Cuidadosamente camada 30 mililitros do sangue diluído em 20 mililitros de gradiente de densidade em cada um dos quatro tubos cônicos de 50 mililitros, e separar as células por centrifugação gradiente de densidade. Aspire cuidadosamente o supernasal e transfira o PBMC de cada tubo para um único tubo de 50 mililitros. Use o PBS para levar o volume final a 50 mililitros e coletar o PBMC por centrifugação.Após uma segunda lavagem sob as mesmas condições, suspenda as células alimentadores isoladas em 10 mililitros de cultura celular para contagem, e adicione 25 mililitros de um meio de cultura celular de 70 mililitros complementado com 50 unidades de solução IL-2 em cada um dos dois tubos de 50 mililitros. Em seguida, adicione células alimentadoras a um tubo a 2 por 10 a 6ª células por mililitro de cultura celular complementada com concentração de IL-2. Para configurar uma cultura de linfócitos T, junte o clone de células T contendo supernantes da amostra de válvula estenótica em um único tubo de 50 mililitros, e colete as células por centrifugação.Lave a pelota três vezes em 50 mililitros de PBS por lavagem, antes de reutilizar as células em 1 mililitro de meio de cultura celular para contar. Diluir as células a uma 1 por 10 a 3ª células por concentração de mililitro, e adicionar 500 microlitres de células ao tubo de cultura celular meio suplementado com IL-2 sem células alimentadores. Adicione a suspensão da célula alimentadora a uma placa de plástico 100 por 15 mililitros de Petri, e adicione 100 microliters de células alimentadoras a cada poço do número apropriado de placas de 96 poços para o experimento.Em seguida, adicione as células T a uma placa de Petri, e adicione 100 microliters de células T a cada célula alimentadora complementada bem para uma incubação de uma semana na incubadora de cultura celular. O isolamento do PBMC é vital para a obtenção de células alimentadoras e para permitir a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Após duas semanas de incubação, uma população de células T clones pode ser obtida.Aqui, mostra-se o esquema de gating para análise de subpopulações de células T em pacientes com doença da válvula aórtica calcificada. Como observado neste paciente, havia mais células CD4+T do que células CD8+T. A análise citométrica de fluxo de células T nãocloadas confirma que os mesmos marcadores de células T estão presentes em amostras nativas de válvulas e clones.Juntos, esses dados indicam que as células T estão presentes em válvulas aórticas calcificadas com CD45+leucócitos, sugerindo que a doença da válvula aórtica calcifica está ligada à ativação do sistema imunológico e à atividade inflamatória. Este método é muito versátil. Pode ser aplicado a diferentes protocolos para os quais o pesquisador precisa ser capaz de isolar células de um tecido, para a caracterização funcional.Tenha em mente que é importante trabalhar em condições estéreis para evitar contaminação, e observar criticamente as células sob o microscópio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Imunologia e Infecção

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolamento de duplas Células αβ T negativa do Rim

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Protocolo de isolamento eficiente para linfócitos B e T a partir de tonsilas palatinas Humanos

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...