Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Todas las bolsas de buffy coat utilizadas para este protocolo fueron irradiadas gracias a la disponibilidad del Dr. Peter Rosenthal, el Dr. Dirk Böhmer y todo el equipo del Departamento de Radiología de Charité Benjamin Franklin. Becaria/Mary Roxana Christopher, este trabajo está respaldado por una beca de la Sociedad Alemana de Cardiología (DGK).

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con el Estatuto de la Charité para Garantizar las Buenas Prácticas Científicas y se respetaron las directrices y disposiciones legales sobre privacidad y ética. El Comité de Ética aprobó todos los experimentos en humanos y la privacidad y el anonimato de los pacientes se mantuvieron de acuerdo con las reglas informadas en el Formulario de Ética.
NOTA: Para el protocolo descrito a continuación se utilizaron muestras frescas de válvula estenótica...

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Aquí presentamos un método para caracterizar subpoblaciones de linfocitos T aisladas de muestras de válvula aórtica estenótica, utilizando citometría de flujo. Este método requiere el uso de una capa buffy irradiada para aislar los PBMC. La frecuencia de radiación a la que deben someterse las bolsas de buffy coat es de 9000 Rad/90 Gray (Gy) y representa un paso crucial para detener la proliferación de las células alimentadoras. El papel de las células aisladas de las bolsas de la capa buffy es actuar solo como...

La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD) es uno de los trastornos de las válvulas cardíacas más comunes, con un gran impacto en la atención médica. La frecuencia de reemplazo de la válvula aórtica en los últimos años ha aumentado dramáticamente y se espera que aumente aún más, debido a la creciente población de edad avanzada1.
La fisiopatología subyacente de la CAVD solo se conoce parcialmente y las estrategias terapéuticas actuales se limitan a medidas conservadoras o reemplazo de la válvula aórtica, ya sea a través de procedimientos quirúrgicos o percutáneos. Hasta la fecha, ningún tratamiento médico eficaz puede dificultar o revertir la progresión de la CAVD y la alta mortalidad se asocia con el inicio temprano de los síntomas, a menos que se realice el reemplazo de la válvula aórtica (RVA)2. En pacientes con estenosis aórtica sintomática grave, la supervivencia sin síntomas a 3 años se informó tan baja como 20%3. El reemplazo transcatéter de la válvula aórtica (TAVR) representa una nueva opción, revolucionando el tratamiento para pacientes de alto riesgo, especialmente entre los ancianos y ha reducido drásticamente la mortalidad, que era intrínsecamente alta en esta población4,5,6. A pesar de los prometedores resultados del TAVR, es necesaria más investigación para comprender la fisiopatología de la CAVD para identificar nuevas dianas terapéuticas tempranas7,8,9.
Anteriormente se pensaba que era un proceso pasivo y degenerativo, la CAVD ahora se reconoce como una enfermedad progresiva activa, caracterizada por un interruptor de fenotipo osteoblástico de las células intersticiales de la válvula aórtica10. Esta enfermedad implica mineralización progresiva, cambios fibrocalcificantes y reducción de la motilidad de las valvas de la válvula aórtica (esclerosis), que en última instancia obstruyen el flujo sanguíneo y conducen al estrechamiento (estenosis) de la abertura de la válvula aórtica11.
La inflamación se considera un proceso clave en la fisiopatología de la CAVD, similar al proceso de aterosclerosis vascular. La lesión endotelial permite la deposición y acumulación de especies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas en la válvula aórtica12. Estas lipoproteínas oxidadas provocan una respuesta inflamatoria, ya que son citotóxicas, con la actividad inflamatoria que conduce a la mineralización. Recientemente se ha destacado el papel de la inmunidad innata y adaptativa en el desarrollo de la CAVD y la progresión de la enfermedad13. Se ha documentado la activación y expansión clonal de subconjuntos específicos de células T de memoria en pacientes con CAVD y valvas de válvula aórtica mineralizadas, de modo que se supone que los procesos inflamatorios están involucrados al menos en el desarrollo de CAVD y presumiblemente también en la progresión de la enfermedad14. De hecho, aunque las células presentadoras de antígenos y los macrófagos están presentes tanto en la válvula sana como en la enferma, la presencia de linfocitos T es indicativa de una válvula aórtica envejecida y enferma. Este infiltrado linfocítico junto con un aumento de la neovascularización y la metaplasia son signos histológicos característicos de CAVD15.
Planteamos la hipótesis de la existencia de una interacción entre las células intersticiales de la válvula aórtica y la activación del sistema inmune, lo que potencialmente desencadena el inicio de un proceso inflamatorio crónico en la válvula aórtica. El ensayo de células T a partir del tejido de la válvula aórtica estenótica podría ser una forma eficiente de aclarar su papel en el desarrollo de la calcificación, ya que puede proporcionar una representación cercana de las células de la válvula aórtica in vivo. En el presente trabajo, utilizando tejido valvular aórtico, aislamos linfocitos T, los cultivamos y clonamos, y posteriormente los caracterizamos mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se extirparon muestras frescas de válvula aórtica de pacientes con CAVD que recibieron reemplazo quirúrgico de la válvula para la estenosis aórtica grave. Después de la escisión quirúrgica, la muestra de válvula fresca se diseccionó en pequeños trozos y las células T se cultivaron, se clonaron y luego se analizaron mediante citometría de flujo. El procedimiento de tinción es simple y los tubos teñidos se pueden fijar con 0.5% de paraformaldehído y analizarse hasta 15 días después. Los datos generados a partir del panel de tinción se pueden utilizar para rastrear los cambios en la distribución de linfocitos T a lo largo del tiempo en relación con la intervención y podrían desarrollarse fácilmente para evaluar los estados de activación de subconjuntos específicos de células T de interés.
La extracción de tejido calcificado, el aislamiento de leucocitos del tejido calcificado y particularmente el uso de la citometría de flujo en este tipo de tejido puede ser un desafío, debido a problemas como la autofluorescencia. Existen pocas publicaciones con protocolos para este fin específico16,17,18. A continuación presentamos un protocolo diseñado específicamente para el aislamiento directo y el cultivo de linfocitos T a partir de muestras de válvula aórtica humana. La expansión clonal de los linfocitos es un sello distintivo de la inmunidad adaptativa. El estudio in vitro de este proceso proporciona información perspicaz sobre el nivel de heterogeneidad de los linfocitos19. Después de un período de incubación de tres semanas, los clones de células T están listos para ser explantados, ya que se obtuvo una cantidad adecuada de células T de cada clon, para permitir el estudio fenotípico y funcional. Posteriormente se estudia el fenotipo de los clones T mediante citofluorometría.
Este protocolo inmunológico es una adaptación de un método previamente desarrollado por Amedei et al. para el aislamiento y caracterización de células T a partir de tejido humano, especialmente diseñado para tejido humano calcificado, como en CAVD20,21,22. El protocolo aquí para el aislamiento de PBMC (células mononucleares de sangre periférica) utilizando una capa buffy irradiada describe una forma efectiva de obtener células alimentadoras (FC), específicamente ajustadas para la fase de clonación de linfocitos T aislados de células intersticiales valvulares. La capa alimentadora consiste en células detenidas por el crecimiento, que aún son viables y bioactivas. El papel de las células alimentadoras es importante para apoyar la supervivencia in vitro y el crecimiento de linfocitos T aislados de células intersticiales valvulares23. Para evitar la proliferación de células alimentadoras en cultivo, estas células deben someterse a una detención del crecimiento. Esto se puede lograr de dos maneras: a través de métodos físicos como la irradiación, o mediante el tratamiento con productos químicos citotóxicos, como la mitomicina C (MMC), un antibiótico antitumoral que se puede aplicar directamente a la superficie de cultivo24. Aquí mostramos la detención del crecimiento de las células alimentadoras lograda a través de la irradiación celular.
Este método presenta una forma eficiente y rentable de aislar y caracterizar las células T del tejido de la válvula aórtica, lo que contribuye a ampliar el espectro de métodos inmunológicos para explorar la fisiopatología de la CAVD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

La enfermedad de la válvula aórtica calcificada (CAVD), un proceso de enfermedad activa que va desde el engrosamiento leve de la válvula hasta la calcificación grave, se asocia con una alta mortalidad, a pesar de las nuevas opciones terapéuticas como el reemplazo de la válvula aórtica transcatéter (TAVR). 
Las vías completas que comienzan con la calcificación de la válvula y conducen a la estenosis aórtica grave permanecen solo parcialmente comprendidas. Al proporcionar una representación cercana de las células de la válvula aórtica in vivo, el ensayo de linfocitos T del tejido de la válvula estenótica podría ser una forma eficiente de aclarar su papel en el desarrollo de la calcificación. Después de la escisión quirúrgica, la muestra fresca de la válvula aórtica se disecciona en pequeños trozos y los linfocitos T se cultivan, se clonan y luego se analizan mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
El procedimiento de tinción es simple y los tubos teñidos también se pueden fijar con 0,5% de paraformaldehído y analizarse hasta 15 días después. Los resultados generados a partir del panel de tinción se pueden utilizar para rastrear los cambios en las concentraciones de células T a lo largo del tiempo en relación con la intervención y podrían desarrollarse fácilmente para evaluar los estados de activación de subtipos específicos de células T de interés. En este estudio, mostramos el aislamiento de células T, realizado en muestras frescas de válvula aórtica calcificada y los pasos para analizar clones de células T utilizando citometría de flujo para comprender mejor el papel de la inmunidad adaptativa en la fisiopatología CAVD.

Se utilizó un método simple y rentable para caracterizar la población leucocitaria de muestras frescas de válvula aórtica derivadas de pacientes humanos con estenosis grave de la válvula aórtica (consultar protocolo). El método para aislar los PBMC es un paso vital en la obtención de células alimentadoras, que se utilizan en cada paso del experimento (fases de clonación, realimentación y división) y permiten la detección y caracterización de leucocitos infiltrantes en muestras de válvula aórtica. Los pas...

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Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

En este estudio, describimos el proceso de aislamiento de linfocitos T a partir de muestras frescas de válvulas aórticas calcificadas y los pasos analíticos de la clonación de células T para la caracterización de los subconjuntos de leucocitos adaptativos mediante el análisis de citometría de flujo.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Este protocolo es fácil de realizar. La fase de clonación permite obtener un mayor número de clones T a partir de muestras frescas. Además, el fenotipo y la función de las células T se pueden analizar fácilmente.Demostrando el procedimiento estará Mary Christopher, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para inducir la clonación de células T, use la espiga de la bolsa con la válvula sin aguja para abrir una bolsa de capa de buffy irradiada en una campana de flujo laminar. Transfiera hasta 50 mililitros de sangre de la bolsa a un matraz T-150 y agregue 70 mililitros de PBS al matraz.Coloque cuidadosamente 30 mililitros de la sangre diluida en 20 mililitros de gradiente de densidad en cada uno de los cuatro tubos cónicos de 50 mililitros, y separe las células mediante centrifugación por gradiente de densidad. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y transfiera el PBMC de cada tubo a un solo tubo nuevo de 50 mililitros. Utilice PBS para llevar el volumen final a 50 mililitros y recoger el PBMC por centrifugación.Después de un segundo lavado en las mismas condiciones, suspenda las células alimentadoras aisladas en 10 mililitros de medio de cultivo celular para contar, y agregue 25 mililitros de un medio de cultivo celular de 70 mililitros complementado con 50 unidades de solución de IL-2 en cada uno de los dos tubos de 50 mililitros. Luego agregue células alimentadoras a un tubo a una 2 por 10 a las 6ª células por mililitro de medio de cultivo celular complementado con concentración de IL-2. Para establecer un cultivo de linfocitos T, agrupe el clon de células T que contiene sobrenadantes del matraz de muestra de válvula estenótica en un solo tubo de 50 mililitros y recoja las células por centrifugación.Lave el pellet tres veces en 50 mililitros de PBS por lavado, antes de volver a suspender las células en 1 mililitro de medio de cultivo celular para contar. Diluya las células a una concentración de 1 por 10 a la 3ª célula por mililitro, y agregue 500 microlitros de células al tubo de medio de cultivo celular suplementado con IL-2 sin células alimentadoras. Agregue la suspensión de la célula alimentadora a una placa de Petri de plástico de 100 por 15 mililitros, y agregue 100 microlitros de células alimentadoras a cada pozo del número apropiado de placas de 96 pocillos con fondo en U para el experimento.Luego agregue las células T a una placa de Petri y agregue 100 microlitros de células T a cada célula alimentadora complementada bien durante una incubación de una semana en la incubadora de cultivo celular. El aislamiento de PBMC es vital para obtener células alimentadoras y permitir la detección y caracterización de leucocitos infiltrantes en muestras de válvula aórtica. Después de dos semanas de incubación, se puede obtener una población de células T clonadas.Aquí, se muestra el esquema de gating para analizar las subpoblaciones de células T en pacientes con enfermedad de la válvula aórtica calcificada. Como se observó en este paciente, había más células T CD4 + que células T CD8 + . El análisis citométrico de flujo de células T no clonadas confirma que los mismos marcadores de células T están presentes tanto en muestras de válvulas nativas como de clones.Tomados en conjunto, estos datos indican que las células T están presentes en las válvulas aórticas calcificadas con leucocitos CD45 +, lo que sugiere que la enfermedad de la válvula aórtica calcificada está relacionada con la activación del sistema inmunológico y la actividad inflamatoria. Este método es muy versátil. Se puede aplicar a diferentes protocolos para los cuales el investigador necesita poder aislar células de un tejido, para la caracterización funcional.Tenga en cuenta que es importante trabajar en condiciones estériles para evitar la contaminación y observar críticamente las células bajo el microscopio.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

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Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

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There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

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En Vitro Generación de células dendríticas murinas plasmocitoide de común linfoide Progenitores utilizando el sistema de alimentación AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

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Protocolo Aislamiento eficiente para B y linfocitos T a partir Humanos Palatine amígdalas

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...