Name: investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Alla buffy coat väskor som används för detta protokoll bestrålades tack vare tillgängligheten av Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer och hela teamet av Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Stipendiat/Mary Roxana Christopher, detta arbete stöds av ett stipendium från German Cardiac Society (DGK).

Studien genomfördes i enlighet med stadgan för Charité for Ensuring Good Scientific Practice och de rättsliga riktlinjerna och bestämmelserna om integritet och etik respekterades. Etikkommittén godkände alla mänskliga experiment och patienternas integritet och anonymitet bibehölls i enlighet med de regler som rapporterades på etikformen.
OBS: För protokollet som beskrivs nedan användes färska mänskliga stenotic ventil prover.
1. Reagensberedning
<ol>...

<ol>
	<li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+valvular+heart+diseases:+a+population-based+study.">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li><li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+aortic+valve+calcification,+as+measured+by+MDCT,+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis:+results+of+an+international+registry+study.">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li><li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+outcome+in+severe,+asymptomatic+aortic+stenosis.">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li><li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis:+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement:+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR.">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li><li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+(TAVI)-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development.">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li><li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAVI+for+low-flow,+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction:+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+(GARY).">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li><li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+(TAVI).">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation:+"on-label"+versus+"off-label"+use+of+TAVR+devices.">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li><li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcatheter+valve-in-valve+implantation+(VinV-TAVR)+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves.">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li><li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease.">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).</li><li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcific+Aortic+Valve+Disease:+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches.">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li><li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves.">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li><li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-lymphocyte+infiltration,+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis.">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li><li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells.">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li><li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease.">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li><li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta:+Study+protocol.">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).</li><li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis.">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li><li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes.">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma.">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology &amp; Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer.">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li><li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Different+Functional+Distribution+of+"Not+Effector"+T+Cells+(Treg/Tnull)+in+Colorectal+Cancer.">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).</li><li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications.">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li><li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays.">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li><li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property.">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).</li><li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H+,+K++--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity.">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li><li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo.">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+(CpPLD)+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis.">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques.">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li><li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions.">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li></ol>

Här presenterar vi en metod för att karakterisera T lymfocyt subpopulationer isolerade från stenotic aorta ventil prover, med hjälp av flöde cytometry. Denna metod kräver användning av bestrålad buffy coat för att isolera PBMCs. Den strålningsfrekvens som de buffy coat bags måste utsättas för är 9000 Rad/90 Gray (Gy) och det utgör ett avgörande steg för att stoppa spridningen av matarcellerna. Rollen för de celler som isoleras från de buffy coat bags är att fungera endast som matarceller och ge närin...

Calcific aorta ventil sjukdom (CAVD) är en av de vanligaste hjärtklaff störningar, med en stor inverkan på hälso-och sjukvården. Frekvensen av aortaklaffbyten under de senaste åren har ökat dramatiskt och förväntas öka ytterligare på grund av den växande äldre befolkningen1.
Den underliggande patofysiologi av CAVD är endast delvis känd och de nuvarande terapeutiska strategierna är begränsade till konservativa åtgärder eller kolorektal ventil ersätter, antingen genom kirurgiska eller perkutan förfaranden. Hittills kan ingen effektiv medicinsk behandling hindra eller vända CAVD progression och hög dödlighet är associerad med tidig symptom-debut, om inte aorta ventil ersättning (AVR) utförs2. Hos patienter med svår symptomatisk aorta stenos rapporterades den 3-åriga symptomfria överlevnaden så låg som 20%3. Transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR) representerar ett nytt alternativ, revolutionerande behandling för högriskpatienter, särskilt bland äldre och har dramatiskt minskat dödligheten, som var i sig hög i denna population4,5,6. Trots de lovande resultaten av TAVR är ytterligare forskning nödvändig för att förstå CAVD patofysiologi för att identifiera nya tidiga terapeutiska mål7,8,9.
Tidigare tros vara en passiv, degenerativ process, CAVD är nu erkänd som en aktiv progressiv sjukdom, kännetecknas av en osteoblastic fenotyp switch av aorta ventil interstitial celler10. Denna sjukdom innebär progressiv mineralisering, fibrokala förändringar och minskad motilitet av kolorektal ventil broschyrer (skleros), som i slutändan hindrar blodflödet leder till förträngning (stenos) av kolorektal ventilöppning11.
Inflammation anses vara en nyckelprocess i CAVD patofysiologi, som liknar processen med vaskulär åderförkalkning. Endotelskada möjliggör deponering och ackumulering av lipidarter, särskilt oxiderade lipoproteiner i kolorektalventilen12. Dessa oxiderade lipoproteiner provocerar ett inflammatoriskt svar, eftersom de är cytotoxiska, med den inflammatoriska aktiviteten som leder till mineralisering. Rollen av medfödd och adaptiv immunitet i CAVD utveckling och sjukdomsprogression har nyligen belysts13. Aktivering och klonurvalet expansion av specifika delmängder av minne T-celler har dokumenterats hos patienter med CAVD och mineraliserade aorta valve broschyrer, så att inflammatoriska processer antas vara inblandade åtminstone i utvecklingen av CAVD och förmodligen i sjukdomsprogression samt14. Faktum är att även om antigen-presentera celler och makrofager finns i både friska och sjuka ventilen, är förekomsten av T lymfocyter vägledande för en åldring och sjuk aorta ventil. Denna lymfatiska infiltrate tillsammans med en ökning av neovascularization och metaplasi är karakteristiska histologiska tecken på CAVD15.
Vi t ställa hypotesen förekomsten av en interaktion mellan aorta ventil interstitial celler och aktivering av immunsystemet, som potentiellt utlöser inledandet av en kronisk inflammatorisk process i aorta ventilen. Analys av T-celler från stenotic aorta ventil vävnad kan vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i förkalkning utveckling, eftersom det kan ge en nära representation av aorta ventilceller in vivo. I det nuvarande arbetet, med hjälp av kolorektal ventil vävnad, isolerar vi T-lymfocyter, kultur och klonar dem, och därefter karakterisera dem med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Färska aorta valve prover togs bort från CAVD patienter som fick kirurgiska ventil ersätter för allvarliga aorta stenos. Efter kirurgiska excision dissekerades den färska ventilprovet i små bitar och T-cellerna odlades, klonades sedan analyseras med hjälp av flöde cytometri. Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. De data som genereras från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-lymfocytfördelning över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundergrupper av intresse.
Extraktion av förkalkad vävnad, isolering av leukocyter från förkalkad vävnad och särskilt användningen av flödescytometri på denna typ av vävnad kan vara utmanande på grund av problem som autofluorescens. Få publikationer finns med protokoll för detta specifika ändamål16,17,18. Häri presenterar vi ett protokoll utformat speciellt för direkt isolering och kultur av T lymfocyt från mänskliga aorta ventil prover. Klonisk expansion av lymfocyter är ett kännetecken för adaptiv immunitet. Att studera denna process in vitro ger insiktsfull information om nivån av lymfocyt heterogenitet19. Efter en inkubationsperiod på tre veckor är T-cellsklonerna redo att explanteras, eftersom en tillräcklig mängd T-celler från varje klon erhölls, så att den fenotypiska och funktionella studien kan tillåtas. Därefter studeras fenotypen av T kloner av cytofluorometri.
Detta immunologiska protokoll är en anpassning av en metod som tidigare utvecklats av Amedei et al. för T-cellsisolering och karakterisering från mänsklig vävnad, särskilt utformad för förkalkad mänsklig vävnad, såsom i CAVD20,21,22. Protokollet här för isolering av PBMCs (perifera blod mononukleära celler) med hjälp av bestrålade buffy coat beskriver ett effektivt sätt att erhålla matare celler (FC), särskilt justerat för kloning fasen av T lymfocyter isolerade från ventil interstitiella celler. Matarskiktet består av tillväxt arresterade celler, som fortfarande är livskraftiga och bioaktiva. Matarcellernas roll är viktig för att stödja överlevnad och tillväxt av T-lymfocyter isolerade från ventilinterstitiella celler23. För att undvika spridning av matarceller i kulturen måste dessa celler genomgå ett tillväxtstopp. Detta kan uppnås på två sätt: genom fysiska metoder som bestrålning, eller genom behandling med cytotoxiska kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), ett antitumoralt antitumoral antibiotikum som kan appliceras direkt på odlingsytan24. Här visar vi feeder cell tillväxt arrest uppnås genom cell bestrålning.
Denna metod presenterar ett effektivt, kostnadseffektivt sätt att isolera och karakterisera T-celler från aorta ventil vävnad, bidrar till att bredda spektrumet av immunologiska metoder för att utforska CAVD patofysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL plastic syringes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>9000701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96- well U- bottom Multiwell plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>10638441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bag Spike (needle free)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute to 4% with PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 Brilliant violet 421</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>560349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD25 PE</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>302621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3 PE/Cy7</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>300316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD4 Alexa Fluor 488</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>317419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Brilliant violet 711</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>304137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8 Brilliant violet 510</td>
			<td>&#160;Biolegend</td>
			<td>301047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>13094697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tube 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB0533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10136120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>10788561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>2300E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast read 102 plastic counting chamber</td>
			<td>KOVA INTERNATIONAL</td>
			<td>630-1893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 250 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>168-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filters for culture medium 500 mL</td>
			<td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td>
			<td>166-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB 101 Lyophilized Supplement</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HB Basal Medium</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>T000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>ECS0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HS (Human serum)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-2 IS</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lymphoprep</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11082132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10538931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td>10000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA (phytohemagglutinin)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R80115TS</td>
			<td>10 0mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Media</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco by Life technologies</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters 0,45&#181;l</td>
			<td>Rotilabo-Spritzenfilter</td>
			<td>P667.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 Cell culture flasks</td>
			<td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-75 Cell culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10232771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;- Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2916801</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating aortic valve calcification via isolation and culture of t lymphocytes using feeder cells from irradiated buffy coat

Calcific kolorektal ventil sjukdom (CAVD), en aktiv sjukdom process som sträcker sig från mild förtjockning av ventilen till allvarlig förkalkning, är associerad med hög dödlighet, trots nya terapeutiska alternativ såsom transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR). 
De kompletta vägarna som börjar med ventil förkalkning och leder till allvarliga aorta stenos förblir endast delvis förstådda. Genom att tillhandahålla en nära representation av aorta valve cellerna in vivo, kan analysen av T lymfocyter från stenotic ventil vävnad vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i utvecklingen av förkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeras det färska kolorektalventilprovet i små bitar och T-lymfocyterna odlas, klonas och analyseras sedan med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan också fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. Resultaten från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-cellkoncentrationer över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundertyper av intresse. I denna studie visar vi isolering av T-celler, utförs på färska förkalkade aorta ventil prover och stegen för att analysera T cell kloner med flöde cytometry att ytterligare förstå rollen av adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.

Vi använde en enkel och kostnadseffektiv metod för att karakterisera leukocytpopulationen av färska aorta ventil prover härrör från mänskliga patienter med allvarliga aorta ventil stenos (se protokollet). Metoden för att isolera PBBC är ett viktigt steg för att erhålla matningsceller, som används i varje steg i experimentet (kloning, återmatning och klyvningsfaser) och möjliggör detektion och karakterisering av infiltrerande leukocyter i aortaklaffprover. De viktigaste stegen i den här metoden visas i <st...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat at JoVE.com

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

I denna studie beskriver vi processen för T lymfocyt isolering från färska prover av förkalkade aorta ventiler och analytiska steg av T cell-kloning för karakterisering av adaptiva leukocyte undergrupper med hjälp av flöde cytometry analys.

Undersöka aortaklaffförkalkning via isolering och kultur av T-lymfocyter med hjälp av matarceller från bestrålad buffyrock

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Det här protokollet är lätt att utföra. Kloningsfasen gör det möjligt att få ett större antal T-kloner från färska prover. Dessutom kan fenotypen och funktionen hos T-celler enkelt analyseras.Mary Christopher, doktor från mitt laboratorium, visar proceduren. För att inducera T-cellskloning, använd påspiken med den nålfria ventilen för att öppna en bestrålad buffy coat bag i en laminär flödeshuv. Överför upp till 50 ml blod från påsen till en T-150-kolv och tillsätt 70 ml PBS till kolven.Skikta försiktigt 30 milliliter av det utspädda blodet på 20 milliliter densitetsgradient i vart och ett av fyra 50 milliliter koniska rör och separera cellerna genom densitetsgradientcentrugation. Aspirera försiktigt på supernatanten och överför PBMC från varje rör till ett enda nytt 50 milliliterrör. Använd PBS för att få den slutliga volymen till 50 milliliter och samla PBMC genom centrifugering.Efter en andra tvätt under samma förhållanden, suspendera de isolerade matarcellerna i 10 milliliter cellodlingsmedium för räkning och tillsätt 25 milliliter av ett 70 milliliter cellodlingsmedium kompletterat med 50 enheter IL-2-lösning i var och en av två 50 ml rör. Tillsätt sedan matarceller till ett rör vid en 2 med 10 till de 6: e cellerna per milliliter cellodlingsmedium kompletterat med IL-2-koncentration. För att skapa en T-lymfocytkultur, slå samman T-cellsklonen som innehåller supernatanter från stenotiska ventilprovkolv till ett enda 50 ml-rör och samla cellerna genom centrifugering.Tvätta pelleten tre gånger i 50 milliliter PBS per tvätt, innan du återanvänder cellerna i 1 milliliter cellodlingsmedium för räkning. Späd cellerna till en 1 med 10 till 3: e cellerna per milliliter koncentration och tillsätt 500 mikroliter av celler till röret av cellodling medium kompletterat med IL-2 utan matarceller. Tillsätt matarcellsupphängningen till en petriskål av plast 100 med 15 milliliter och tillsätt 100 mikroliter matarceller till varje brunn med lämpligt antal U-bottenplattor med 96 brunnar för experimentet.Tillsätt sedan T-cellerna till en Petri-maträtt och tillsätt 100 mikroliter T-celler till varje matarcell kompletterad väl i en vecka inkubation i cellodlingsinkubatorn. PBMC isolering är avgörande för att erhålla matare celler och möjliggöra detektion och karakterisering av infiltrera leukocyter i aorta ventil prover. Efter två veckors inkubation kan en klon T-cellspopulation erhållas.Här visas gating-systemet för att analysera T-cells subpopulationer hos patienter med värmeorektal ventilsjukdom. Som observerats i denna patient fanns det fler CD4 + T-celler än CD8 + T-celler. Flödescytometrisk analys av uncloned T-celler bekräftar att samma T-cells markörer finns i både inbyggda ventil- och klonprover.Sammantaget visar dessa data att T-celler finns i förkalkade aortaventiler med CD45 + leukocyter, vilket tyder på att värmeorektal ventilsjukdom är kopplad till aktivering av immunsystemet och inflammatorisk aktivitet. Denna metod är mycket mångsidig. Det kan tillämpas på olika protokoll för vilka forskare behöver kunna isolera celler från en vävnad, för funktionell karakterisering.Tänk på att det är viktigt att arbeta under sterila förhållanden för att undvika förorening och att kritiskt observera cellerna under mikroskopet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Isolera och immunofärgning Lymfocyter och dendritiska celler från murina Peyers plack

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Isolation and Th17 Differentiation of NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4 T Lymphocytes

Isolering och Th17 differentiering för naiv CD4 T-lymfocyter

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

Isolation of Double Negative ÃƒÅ½Ã‚Â±ÃƒÅ½Ã‚Â² T Cells from the Kidney

Isolering av Double Negative αβ T-celler från njure

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

I vitro Generation av murina Plasmacytoid dendritiska celler från Common lymfoid stamfäder med hjälp av AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Effektiv Isolation Protokoll för B- och T-lymfocyter från Human Palatine tonsiller

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...